糖尿病心肌病(DCM)属于糖尿病心血管并发症，是糖尿病患者死亡的主要原因之一。DCM的机制为心肌细胞肥大，凋亡增多，心肌细胞肥大进而使凋亡增多引起的心肌细胞数量相对减少是DCM 发生的重要病理基础之一[1,2]。研究表明，蛋白激酶B(AKT)和糖原合成酶激酶(GSK)-3β的磷酸化状态降低，与心肌炎症反应、氧化损伤增强相关，进而诱导了核因子(NF)-κB、肿瘤坏死因子(TNF)-α、白细胞介素(IL)-6,髓过氧化物酶(MPO)活性增加，因此AKT/GSK-3β通路可能是DCM的治疗靶点[3～5]。Klotho是与人衰老相关的基因，该基因在动物模型中会引起一系列类似人类衰老的特性，Klotho基因在脑组织和肾脏中大量表达，人类慢性肾衰竭(CRF)所表现出来的各种症状都与Klotho基因异常表达有关。膜结合型Klotho蛋白是一种单跨膜蛋白，Klotho蛋白的胞外区域可以水解脱落并释放到血液、尿液和脑脊液，称为分泌型Klotho蛋白。研究表明，人分泌型Klotho蛋白具有多种治疗特性，包括抗氧化、抗炎、抗病毒特性等[6,7]。有研究发现，分泌型Klotho蛋白可逆转胰岛素抵抗、高血糖及与肥胖和肥胖相关的代谢性疾病相关的其他症状[8,9]。有报道称，人分泌型Klotho蛋白通过增加一氧化氮(NO)释放和抑制活性氧(ROS)的产生而对内皮细胞功能障碍起到保护作用[10]。本研究探讨人分泌型Klotho蛋白对2型DCM大鼠的治疗作用及机制。

1、材料与方法

1.1 实验动物

50只Wistar大鼠购自遵义医学院动物实验中心，动物生产许可证号：SCXK(黔)2019-0015,动物质量合格证号：201825696,置于(22±3)℃,湿度60%的受控环境中；12 h明/暗循环，可自由饮水。

1.2 细胞培养

人正常心肌细胞H9C2购自上海生物科学研究所。将H9C2在Dulbecco改良的Eagle培养基中培养，培养基添加了10%胎牛血清(FBS),100 U/ml青霉素和100 μg/ml链霉素。将细胞保持在37 ℃的含有5%CO2的潮湿培养箱中。

1.3 主要试剂与仪器

人分泌型Klotho蛋白(德国Sigma, 批号845212.36);高糖高脂饲料(正常饲料54.00 kg、蔗糖16.50 kg、猪油8.31 kg、蛋黄4.14 kg、盐83.40 g组成，总质量为83.78 kg)(重庆中医药研究院，批号：WS414.32);普通饲料(粗蛋白≥18%、粗脂肪≥4%、粗纤维≥5%、粗灰分≤8%、水分≤10%、赖氨酸≥0.82%、钙1.0%～1.8%、磷0.6%～1.2%、盐0.2%～0.8%,重庆中医药研究院，批号：ED6363.36);二甲双胍、苯那普利(中美上海施贵宝制药有限公司，批号5365.63、4589.65);链脲佐菌素(STZ,Sigma-Aldrich, 批号：SD-5269.36);Dulbecco改良的Eagle培养基(批号：MN54896.63)、10% FBS(批号：VF-5745.69,美国 Gibco);超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、丙二醛(MDA)试剂盒(南京建成生物科技有限公司，批号：4589.63、5486.21、4752.36);Trizol®试剂(美国 Thermo Fisher Scientific, 批号：DF-458936.65);Prime Script RT试剂盒、SYBR Premix Ex Taq(日本TaKaRa Biotechnology Co, 批号：589626.36、XC-52489.69);聚合酶链反应(PCR)仪器(美国Applied Biosystems);蛋白酶抑制剂(批号：FG-589636.63)、放射免疫沉淀(RIPA)裂解缓冲液(批号：58965.54)、二喹啉甲酸(BCA)蛋白质检测试剂盒(批号：LK-41478.63,美国Thermo Fisher Scientific);10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE;中国Solarbio, 批号：NB5696.65);聚偏氟乙烯(PVDF,美国Invitrogen, 批号：VB23654.36);p-AKT、p-GSK-3β、GAPDH一抗(美国Abcam, ab23306、ab16663、ab108357);辣根过氧化物酶耦联的二抗(美国Cell Signaling Technology, 批号：DC-4785.54);电化学发光(ECL)试剂(Pierce, 中国碧云天，批号：485636.65);Bio-Rad Quantity One软件(美国Bio-Rad);噻唑蓝(MTT)分析试剂盒(中国海门市Beyotime生物技术研究所，批号：DC-59654.69)。

1.4 分组及造模

随机抽取10只大鼠为正常组给予普通饲料喂养，其余40只大鼠给予高糖高脂饮食(基础饲料基础上加入20%蔗糖和20%猪油)喂养8 w造成胰岛素抵抗后，STZ 40 mg/kg一次性腹腔注射诱导2型糖尿病大鼠模型，STZ给药72 h和7 d后分别测定大鼠空腹血糖。两次空腹血糖≥11.6 mmol/L且左心室舒张末期内径(LVIDd)、左心室收缩末期内径(LVIDs)、左心室短轴缩短率(LVFS)、左心室射血分数(LVEF)与正常组比较有明显差异可认定DCM模型建立成功。将大鼠均分为模型组、二甲双胍+苯那普利组(90 mg/kg+0.9 mg/kg)[11]、低、高剂量组(50、100 mg/kg人分泌型Klotho蛋白，预实验求出人分泌型Klotho蛋白对慢性心力衰竭大鼠的ED50为200 mg/kg, 以1/2、1/4 ED50为高低剂量组),每组10只。模型组、二甲双胍+苯那普利组、低高剂量组于建模成功后，给予相应药物灌胃，正常组及模型组给予等体积的生理盐水，本实验周期为8 w。

1.5 各组心功能指标测定

治疗结束后，超声心动仪检查LVIDd、LVIDs、LVFS、LVEF水平。

1.6 各组心肌氧化指标测定

制作心肌组织匀浆，黄嘌呤氧化酶法测定心肌组织中SOD活性、比色法测定心肌组织中GSH-Px活性、硫代巴比妥酸(TBA)法测定组织中MDA含量变化。SOD、GSH-Px、MDA试剂盒购于南京建成生物科技有限公司。

1.7 心肌组织形态学检查

将心肌组织在4%多聚甲醛中固定48 h。然后，将组织进行乙醇脱水，石蜡包埋，然后切成薄片(5 μm)。随后，将切片用苏木素-伊红(HE)染色以进行组织学分析

1.8 心肌组织中p-AKT、p-GSK-3βmRNA水平测定

用Trizol®试剂分离心肌组织的总RNA,然后用Prime ScriptRT试剂盒转化为cDNA。则按照制造商的协议。SYBR Premix Ex Taq用于实时荧光定量(qRT)-PCR分析，以检测组织中p-AKT、p-GSK-3β mRNA表达水平。qPCR在95 ℃下运行10 min, 然后在95 ℃下进行40个循环进行15 s熔化，并在60 ℃下进行1 min进行退火/延伸。U6被用作内源性对照基因，以使p-AKT、p-GSK3β表达水平正常化。引物序列：p-AKT正向：5′-GCGCCCTAGGTAGTTTCATGTT-3′,反向：5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′;p-GSK3β正向：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′,反向：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′;U6正向：5′TGTCGATCGATCGATCGATCGATCG-3′,反向：5′-CGTGACAGTAGCTAGCGAGCTG-3′,引物购自YRgene Co.Ltd(中国长沙)。一式三份进行RT-qPCR分析，并使用2-ΔΔCt方法计算p-AKT、p-GSK-3β mRNA表达的变化。

1.9 心肌组织中p-AKT、p-GSK-3β蛋白表达水平测定

用含有蛋白酶抑制剂的RIPA裂解缓冲液裂解转染的细胞。通过使用BCA蛋白质检测试剂盒测量提取蛋白质的浓度。用10% SDS-PAGE分离等量的蛋白质，然后转移至PVDF膜。然后在TBST中用5%脱脂牛奶在室温下将膜封闭1 h, 然后与p-AKT、p-GSK3β、GAPDH一抗在4 ℃下过夜，随后将膜用TBST洗涤3次并在室温下用相应的辣根过氧化物酶耦联的二抗检测2 h。使用ECL试剂检测膜上的信号。

1.10 细胞分组

分组设计：H9C2组：H9C2(2-1)心肌细胞系细胞在DMEM高糖，10%胎牛血清培养，培养至 80%～90%融合时，换1%胎牛血清16 h促进细胞分化融合后开始实验。H9C2 应用 1%胎牛血清分化后，低糖培养过夜，之后重新换低糖培养基；棕榈酸(PAL)组：PAL细胞培养方法同H9C2组，加入PAL,使PAL浓度为100 μmol/L;PAL+人分泌型Klotho蛋白组培养方法同心肌H9C2细胞组，分别加入PAL、人分泌型Klotho蛋白，使PAL、人分泌型Klotho蛋白浓度分别为100、200 μmol/L。以上各组每孔设6个平行样，培养72 h。

1.11 细胞活力水平测定

根据制造商的规程，使用MTT分析试剂盒测量细胞增殖。每个实验进行3次。

1.12 细胞p-AKT、p-GSK3βmRNA和蛋白水平测定

方法同1.8、1.9。

1.13 统计学分析

采用SPSS19.0软件进行单因素方差分析、SNK-q检验。

2、结果

2.1 人分泌型Klotho蛋白对DCM大鼠心功能指标的影响

与正常组比较，模型组、二甲双胍+苯那普利组及高、低剂量组LVIDd、LVIDs明显升高，LVFS、LVEF明显降低(P<0.05);在使用二甲双胍结合苯那普利、人分泌型Klotho蛋白治疗后，与模型组相比，LVIDd、LVIDs明显降低，LVFS、LVEF明显升高，且具有明显剂量依赖性(P<0.05);二甲双胍+苯那普利组与低剂量组各指标有统计学差异(P<0.05),而与高剂量组各指标无明显差异(P>0.05),见表1。

2.2 人分泌型Klotho蛋白对DCM大鼠心肌氧化指标的影响

与正常组比较，模型组、二甲双胍+苯那普利组、低、高剂量组MDA水平明显升高，SOD、GSH-Px水平明显降低(P<0.05);在使用二甲双胍+苯那普利、人分泌型Klotho蛋白治疗后，与模型组相比，MDA水平明显降低，SOD、GSH-Px水平明显升高，且具有明显剂量依赖性(P<0.05);二甲双胍+苯那普利组和低剂量组以上指标有统计学差异(P<0.05),而与高剂量组以上各指标无明显差异(P>0.05),见表1。

与正常组比较：1)P<0.05；与模型组比较：2)P<0.05；与二甲双胍+苯那普利组比较：3)P<0.05；与低剂量组比较：4)P<0.05；表2同

表1 人分泌型Klotho蛋白对DCM大鼠心功能及心肌氧化指标影响

2.3 人分泌型Klotho蛋白对心肌病理结构的影响

正常组心肌结构正常；模型组心肌纤维紊乱，核深染，心肌细胞变形肥大，炎症细胞浸润明显，可见明显间质纤维化；二甲双胍+苯那普利、人分泌型Klotho蛋白干预后，心肌纤维化程度减轻，心肌横纹肌断裂减少，且排列趋于整齐，且具有一定的剂量依赖性，见图1。

图1 各组心肌病理结构(HE染色，×400)

2.4 各组心肌p-AKT、p-GSK-3βmRNA和蛋白表达水平比较

与正常组比较，模型组、二甲双胍+苯那普利组及高、低剂量组p-AKT、p-GSK-3β mRNA和蛋白表达明显降低(P<0.05);在使用二甲双胍+苯那普利、人分泌型Klotho蛋白治疗后，与模型组相比，p-AKT、p-GSK-3β mRNA和蛋白表达明显升高，且具有明显剂量依赖性(P<0.05);二甲双胍+苯那普利组和高剂量组各指标无明显差异(P>0.05),见表2、图2。

表2 各组心肌p-AKT、p-GSK-3β mRNA和蛋白表达比较

图2 各组心肌p-AKT、p-GSK-3β蛋白表达比较

2.6 各组H9C2形态比较

H9C2组细胞形态较为正常；与H9C2组比较，PAL组细胞面积增大，细胞形态逐渐肥大，纤维化明显；与PAL组比较，PAL+人分泌型Klotho蛋白组细胞面积和形态逐渐正常，纤维化逐渐消失，见图3。

2.7 各组H9C2中p-AKT、p-GSK-3βmRNA及蛋白表达比较

与H9C2组比较，PAL组、PAL+人分泌型Klotho蛋白组p-AKT、p-GSK-3β mRNA及蛋白表达明显降低(P<0.05);与PAL组比较，PAL+人分泌型Klotho蛋白组p-AKT、p-GSK-3β mRNA及蛋白表达明显升高(P<0.05),见表3、图4。

与H9C2组比较：1)P<0.05;与PAL组比较：2)P<0.05

表3 各组H9C2组OD值、存活率、p-AKT、p-GSK3β mRNA比较

图3 各组H9C2形态比较(结晶紫染色，×200)

图4 各组心肌H9C2细胞组p-AKT、p-GSK3β蛋白电泳

3、讨论

Klotho在人和动物之间有同源性，人和大鼠为83%,人和小鼠为80%,大鼠和小鼠为93%。研究发现，在基线水平Klotho基因缺失小鼠与野生型小鼠的心脏无明显异常，但是在应激情况下，Klotho基因缺失小鼠可发展更严重的病理性心肌肥厚和重构。而过表达Klotho基因的转基因小鼠(KL-Tg)中，循环中的 Klotho蛋白的水平比野生型小鼠中Klotho蛋白的水平高出100%,可阻断应激导致的心肌细胞肥大，说明Klotho蛋白对应激情况下引起的心脏病理改变有保护作用[12]。各种肥厚性心脏病的模型中，经典瞬时受体电位通道(TPRC)1、3、4、5、6表达水平都明显上调，而下调上述蛋白表达可防止心脏肥厚性生长。研究发现，TRPC6基因敲除可以完全抑制应激因素引起的 Klotho基因缺陷小鼠中心脏肥厚及心室重构等病理改变，说明 Klotho蛋白的心脏保护作用是通过下调 TRPC6介导的[13]。研究发现，Klotho蛋白主要通过阻断胰岛素样生长因子(IGF)1/磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)信号通路介导的对离子通道的作用，降低细胞膜上 TRPC6 含量发挥心脏保护作用[14]。本研究结果说明，PAL明显增加了心肌细胞面积，使得细胞形态肥大，纤维化明显，存活率降低；人分泌型Klotho蛋白能够使PAL诱导的心肌细胞面积和形态逐渐正常，纤维化消失，存活率升高。本实验结果说明，人分泌型Klotho蛋白对DCM大鼠心功能损伤及心肌氧化损伤具有明显改善作用。HE染色结果与上述讨论一致。

心肌肥大是指心肌在受外界刺激后(长期的超负荷运动、氧化应激、缺血缺氧、高糖、高胰岛素),而产生的以心脏体积增大，顺应性下降为特征的一种心脏代偿性增生的症状，心肌肥大发生的分子机制比较复杂，GSK-3β的活性变化是引起心肌肥大的主要分子机制之一，GSK-3β最初发现是由于其对糖原合成的促进作用，其与细胞的结构、增殖等都有密切关系，GSK-3β的磷酸化形式是其失活的形式，一些肽类的生长因子，如IGF、生长激素(GH)能与酪氨酸受体结合，使PI3K激活，PI3K进一步使AKT富集并磷酸化，导致GSK-3β失活[15]。激活GSK-3β能减轻慢性β肾上腺素受体和压力过负荷导致的心肌肥大[16];有研究发现，尾加压素(U)Ⅱ能够通过磷酸化GSK-3β使其失活，从而诱导成年鼠心肌细胞肥大；在压力超负荷导致心肌肥大的小鼠模型中，过表达GSK-3β的小鼠甚至能逆转心肌肥厚的发生[17]。研究发现[18],在慢性酒精诱导的FVB小鼠心肌肥大的实验中，乙醛脱氢酶(ALDH)-2基因的过表达能够通过增加p-GSK-3β来减轻心肌肥大的发生，改善心功能；应用丹参酮Ⅱ治疗DCM的大鼠后能通过增加AKT和GSK-3β磷酸化来保护大鼠心功能，保护线粒体并减少炎性因子生成[19];应用AKT的抑制剂鱼藤素后，抑制GSK-3β的磷酸化，其加大了心肌梗死后的心肌肥大和心功能损伤。目前研究认为，GSK-3β磷酸化通过抑制线粒体通透性孔道开放从而减少线粒体损伤，是其发挥保护心肌肥大作用的机制之一[20]。本研究结果与前述研究一致。

综上，人分泌型Klotho蛋白对DCM大鼠心功能损伤及心肌细胞氧化损伤具有明显改善作用；其机制可能与人分泌型Klotho蛋白能促进p-AKT、p-GSK-3β mRNA和蛋白表达进而激活AKT/GSK3β通路有关。

参考文献:

11尹超,王朋宇,胡艳云,等.黄连地黄汤对糖尿病性心肌病大鼠心肌CTGF及FN1表达的影响[J].天津中医药,2020;37(6):104-9.

基金资助:国家自然科学基金面上项目(81501764);

文章来源:张婷婷,左宪宏,王维娜,等.人分泌型Klotho蛋白对2型糖尿病心肌病大鼠的治疗作用及机制[J].中国老年学杂志,2024,44(15):3684-3690.