首页 > 论文范文 > 医药卫生论文 > 内科论文 > 心血管内科论文 > miR-617靶向调控FOXO4对心肌细胞凋亡的影响

miR-617靶向调控FOXO4对心肌细胞凋亡的影响

2024-11-11 80 上传者：管理员

摘要：目的微小RNA-167(miR-167)靶向调控头框转录因子O家族(FOXO)4对心肌细胞凋亡的影响。方法将体外培养的人心肌AC16细胞随机分为对照组(不做处理正常培养)、miR-NC组(转染miR-NC)、miR-617组(转染miR-617mimics)、miR-617+pcDNA3.1组(共转染miR-617mimics和pcDNA3.1空载体)、miR-617+pcDNA3.1-FOXO4组(共转染miR-617mimics和pcDNA3.1-FOXO4过表达载体),双荧光素酶报告检测miR-617和FOXO4的靶向关系，实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)检测miR-617表达，细胞计数试剂盒8实验检测细胞增殖活力，流式细胞仪检测细胞凋亡，Western印迹法检测FOXO4、B细胞淋巴瘤(Bcl)-2、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、剪切的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Cleaved caspase)3蛋白表达。结果与对照组和miR-NC组比较，miR-617组细胞中miR-617表达水平明显升高，而FOXO4蛋白表达水平明显降低(P<0.05);miR-617组细胞增殖活力和Bcl-2蛋白表达水平均明显高于miR-NC组，而FOXO4蛋白表达水平、细胞凋亡率和Bax、Cleaved Caspase-3蛋白表达水平均明显低于miR-NC组(P<0.05);与miR-617组和miR-617+pcDNA3.1组比较，miR-617+pcDNA3.1-FOXO4组细胞增殖活力和Bcl-2蛋白表达水平均降低，而FOXO4蛋白表达水平、细胞凋亡率和Bax、Cleaved Caspase-3蛋白表达水平均升高(P<0.05)。结论 miR-617可通过靶向调控FOXO4表达抑制心肌细胞凋亡。

关键词：
头框转录因子O家族4
微小RNA-617
心肌细胞
细胞凋亡
细胞增殖
加入收藏

心血管疾病是威胁人类身体健康的重要疾病，预计2030年因其死亡的人数将超过2 360万，我国患病人数高达2.9亿，虽然药物和介入治疗可以有效缓解和改善患者症状，但治疗效果还远远不能令人满意[1]。心肌细胞是组成心肌的基本单位，当心肌细胞出现异常凋零、损伤情况时，会导致患者出现心肌梗死、心肌缺血再灌注损伤等心血管相关疾病[2,3]。微小RNA(miRNA)是一类非编码RNA,当其与相关靶基因的3′-非翻译区(UTR)结合后，将参与心肌细胞凋亡的调控[4]。miR-617是miRNAs家族成员，被报道可调控肿瘤细胞的生物学行为，与帕金森病和肥厚型心肌病等发生有关[5～7]。然而，miR-617是否参与心肌细胞凋亡的调控并不清楚。头框转录因子O家族(FOXO)4是FOXO成员，其表达下调可抑制心肌细胞凋亡[8]。近年来，有研究指出，miR-617可通过靶向FOXO4促进白细胞介素(IL)-22刺激的角质形成细胞的生长[9]。本研究旨在探讨miR-617能否通过靶向调控FOXO4影响心肌细胞凋亡。

1、材料与方法

1.1 细胞培养

采用添加有10%胎牛血清(杭州四季青公司)和1%青链霉素双抗(美国Hyclone公司)的DMEM培养基(美国Hyclone公司)在5%二氧化碳、37 ℃细胞培养箱(美国Thermo公司)内常规培养人心肌AC16细胞(美国ATCC),每隔2 d更换1次培养液，待细胞铺满瓶底80%以上时，加入0.5%胰蛋白酶(北京诺博莱德科技有限公司)消化，并按照1∶3比例传代。

1.2 实验分组与处理

将体外培养的AC16细胞随机分为：(1)对照组：正常培养不做处理；(2)miR-NC组：转染阴性对照miR-NC;(3)miR-617组：转染miR-617mimics; (4)miR-617+pcDNA3.1组：共转染miR-617mimics和pcDNA3.1空载体；(5)miR-617+pcDNA3.1-FOXO4组：共转染miR-617mimics和pcDNA3.1-FOXO4过表达载体。

1.3 细胞转染

将对数生长期的AC16细胞以每孔105个接种至24孔细胞板，常规培养至70%融合度时，根据转染试剂脂质体2000说明书(美国Invitrogen公司)将miR-617mimics(广州锐博生物技术有限公司)、miR-NC、pcDNA3.1空载体及pcDNA3.1-FOXO4过表达载体(上海吉玛制药技术有限公司)转染至AC16细胞中；转染6 h后，更换新鲜培养基，继续培养48 h。

1.4 双荧光素酶报告基因实验

采用Targetscan数据库预测发现miR-617与FOXO4 3′UTR存在互补的结合位点，将包含野生和定点突变后的FOXO4 3′UTR序列片段克隆重组至pGLO-basic载体上，分别构建野生型(WT)-FOXO4和突变型(MUT)-FOXO4载体质粒(上海吉玛制药技术有限公司);根据1.3中的方法将构建的载体质粒分别与miR-NC、miR-617mimics共转染至AC16细胞中；转染48 h后，根据双荧光素酶报告基因检测试剂盒(江苏凯基生物技术股份有限公司)说明书检测细胞的荧光素酶活性。

1.5 实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)检测

向待测的AC16细胞中加入1 ml Trizol试剂(美国Invitrogen公司)提取总RNA后，紫外分光光度计(上海易汇生物科技有限公司)检测RNA浓度与纯度；根据逆转录试剂盒说明书(南京诺唯赞生物科技股份有限公司)将RNA逆转录合成单链cDNA,以cDNA为模板，根据实时荧光定量PCR试剂盒说明书进行PCR扩增；其中，miR-617上游引物：5′-CGTCCTCTGAAGGGTAAACTT-3′,下游：5′-GCAGGGTCC-GAGGTATTC-3′,U6上游引物：5′-CTGGTAGGGTGC-TCGCTTCGGCAG-3′,下游：5′-CAACTGGTGTCGTGGAGTCGGC-3′;以U6为模板，采用2-ΔΔCt法计算AC16细胞中miR-617表达水平。

1.6 细胞计数试剂盒(CCK)-8实验

将待测的各组对数生长期的AC16细胞以每孔5×103个接种至96孔细胞板上，常规培养24、48、72和96 h; 根据CCK-8试剂盒(上海江莱生物科技有限公司)说明书操作后，采用酶标仪(赛默飞世尔科技)在450 nm处检测细胞的吸光度(A)值。

1.7 流式细胞仪检测

收集待测的AC16细胞后，根据膜联蛋白Ⅴ-异硫氰酸荧光素(Annexin Ⅴ-FITC)/碘化丙啶(PI)试剂盒(北京索莱宝科技有限公司)说明书结合缓冲液重悬细胞；再分别各加入5 μl Annexin Ⅴ-FITC和PI溶液避光孵育后，使用上流式细胞仪(美国BD公司)检测细胞凋亡率。

1.8 Western印迹检测

向待测的AC16细胞中加入放射免疫沉淀(RIPA)裂解液(北京索莱宝科技有限公司)提取细胞总蛋白后，进行电泳分离后，转至聚偏氟乙烯膜；经5%脱脂奶粉封闭后，加入FOXO4、B细胞淋巴瘤(Bcl)-2、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、剪切的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Cleaved Caspase)-3和甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)抗体(均为1∶1 000,美国Santa Cruz公司)于4 ℃下孵育过夜；次日洗膜后，加入二抗，室温孵育2 h; 经化学发光剂显影曝光后，以GAPDH为内参，采用凝胶成像分析系统(美国Bio-Rad公司)扫描分析。

1.9 统计学分析

采用SPSS26.0软件进行方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验。

2、结果

2.1 miR-617可与FOXO4 3′UTR靶向结合

Targetscan数据库预测发现miR-617与FOXO4 3′UTR存在互补的结合位点。见图1。miR-617mimics和WT-FOXO4的细胞荧光素酶活性明显低于转染miR-NC组(P<0.05)。见表1。

图1 miR-617与FOXO4 3′UTR结合位点

表1 miR-617和FOXO4靶向关系的验证

2.2 miR-617可降低心肌细胞中FOXO4蛋白表达

miR-617组细胞中miR-617表达水平明显高于对照组和miR-NC组，FOXO4蛋白表达水平明显低于对照组和miR-NC组(P<0.05)。见表2、图2。

表2 miR-617对心肌细胞中FOXO4蛋白表达的影响

图2 Western印迹检测各组FoxO4蛋白表达

表3 miR-617靶向调控FOXO4对心肌细胞蛋白表达、增殖活力、Bcl-2、Bax、Cleaved caspase-3的影响

2.4 miR-617可靶向调控FOXO4影响心肌细胞凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax和Cleaved Caspase3蛋白表达

miR-617组、miR-617+pcDNA3.1组细胞中Bcl-2蛋白表达明显高于miR-NC组、miR-617+pcD-NA3.1-FOXO4组,Bax和Cleaved Caspase3蛋白表达明显低于miR-NC组、miR-617+pcDNA3.1-FOXO4组(P<0.05)。见表3。

2.5 miR-617可靶向调控FOXO4抑制心肌细胞凋亡

miR-617组细胞凋亡率[(2.15±0.36)%]明显低于miR-NC组[(6.31±0.54)%,P<0.05],miR-617+pcDNA3.1-FOXO4组细胞凋亡率[(4.64±0.39)%]明显高于miR-617组和miR-617+pcDNA3.1组[(2.38±0.24)%,P<0.05]。见图3。

图3 miR-617靶向调控FOXO4对心肌细胞凋亡的影响

3、讨论

老年人的心血管疾病负担下降速度持续，但年轻人的发病率和流行率的总体趋势正在恶化[10]。心肌细胞死亡是各种心血管疾病的显著特征，心肌细胞很少发生凋亡，心肌细胞再生能力非常有限，轻微凋亡也会对心脏功能产生不可逆的影响，而在应激或损伤情况下心脏细胞凋零会骤然增加，使机体出现心力衰竭等不良后果严重威胁患者生命健康安全[11]。miRNAs是控制细胞增殖、凋亡和分化等过程的重要组成部分，在心血管疾病发生发展中起到重要作用[12]。如在糖尿病心肌病中，miR-29a可通过靶向调控Bcl-2拮抗因子1抑制心肌细胞凋亡[13];心肌缺血再灌注损伤中，miR-140-5p可通过靶向调控B细胞淋巴瘤-2样1表达促进心肌细胞凋亡[14]。miR-617具有抑制宫颈癌和口腔鳞状细胞癌细胞增殖和促进细胞凋亡的作用[7,15];另外，miR-617还可通过靶向调控Smad3参与牙髓干细胞的成骨过程[16],还被报道在肥厚型心肌病中异常表达[6],然而其是否参与心肌细胞凋亡的调控并不清楚。

FOXO4与包括心血管疾病在内的多种疾病的发生发展有密切联系[17]。FOXO4 siRNA可抑制神经肽Y或血管紧张素Ⅱ诱导的心肌肥厚[18];随着心肌细胞缺血再灌注时间的延长，FOXO4表达水平和心肌细胞凋亡率逐渐升高[19];下调FOXO4表达可通过调控抑制心肌细胞凋亡参改善心肌梗死和心肌缺血再灌注损伤[8,20]。有报道指出，FOXO4是miR-617的靶基因，miR-617可通过调控其表达促进IL-22刺激的永生人角质形成细胞增殖并抑制其凋亡[9]。本研究结果提示，miR-617可能通过调控FOXO4在心肌细胞凋亡过程中发挥着重要作用。说明miR-617可通过靶向调控FOXO4增强细胞增殖活力和调控凋亡相关蛋白表达起到抑制心肌细胞凋亡的效果；而靶向调控FOXO4是其抑制心肌细胞凋亡机制中的部分因素，可能还与调控其他基因有关。

参考文献:

5陈依梦.MicroRNAs及其表达调控异常在帕金森病发病中的作用及临床应用研究[D].北京:中国科学院大学,2017.

12张曼,王鹏.miR-106a-5p靶向GAB1影响人心肌细胞增殖和凋亡的机制研究[J].医学分子生物学杂志,2021;18(4):280-5.

15李霞,葛爱敏.miR-617在宫颈癌组织中的表达及其对宫颈癌SiHa细胞生物学行为的影响[J].现代妇产科进展,2016;25(8):586-8,592.

17王珍珍.FOXO4通过Chop介导凋亡在H9C2细胞缺氧/复氧(HR)中的机制研究[D].南昌:南昌大学,2019.

19苏忠雪,刘华跃,孟晓文,等.磷酸化叉头框O4型在H9c2心肌细胞缺氧/复氧损伤中的作用[J].国际麻醉学与复苏杂志,2021;42(4):337-43.

基金资助:山东省医药卫生科技发展计划项目(2015WS0404);

文章来源:熊攀,赵浩,冯泽瑞.miR-617靶向调控FOXO4对心肌细胞凋亡的影响[J].中国老年学杂志,2024,44(21):5312-5315.