心血管疾病是造成癌症病人死亡的重大疾病之一，其中心肌梗死（MI）是在心血管疾病中致死率最高的重症之一[1]。心肌梗死通常定义为在冠状动闭塞的基础上，供应血流急性、持续性的减少或中断使相应的心肌出现严重持久的缺血，最终导致心肌的缺血局部坏死[2]。轻度的心肌梗死与冠心病并无太大区分，但严重的心肌梗死可能会参与左心室重构，从而导致心力衰竭和心脏功能发生障碍，因此将心肌梗死当做冠状动脉疾病中的一类较为严重且危险的疾病[3]。

加味丹参饮是黄政德教授在《时方歌括》丹参饮的基础上去砂仁、加川芎、红花、当归、赤芍、生地黄化裁而得，具有活血祛瘀、行气止痛的功效[4]。虽有研究表明该方在治疗心血管疾病上有一定的疗效，能够减少心肌梗死的面积，保护心肌缺血再灌注损伤、抑制炎症因子的水平、促进血管的生成等[5,6,7]，但是加味丹参饮对心肌梗死、心肌缺血等疾病的整合作用还缺乏系统性研究。因此，本研究借助网络药理学方法，以新的视角研究加味丹参饮治疗心肌梗死的作用机制，多层次的探索药物与疾病的关系，从而为加味丹参饮更深入、更全面、更有针对性地研究提供参考依据。

1、材料与方法

1.1 加味丹参饮化学成分的获取及相关靶点筛选

利用中药系统药理学数据库及分析平台（TCMSP,http：//ibts.hk-bu.edu.hk/LSP/tcmsp.php）以方中丹参、檀香、川芎、红花、当归、赤芍、生地黄为关键词进行搜索，获取所有化学成分对应的相关信息。同时选取满足口服利用度（OB)>30%，类药性（DL)>0.18的化学成分作为有效成分。

利用TCMSP数据库链接到Drugbank数据库（http：//www.drugbank.ca/），将筛选出的有效成分先通过Drugbank数据库查找相关靶点；对于Drugbank数据库未收录的化学成分-靶点，将有效成分输入至Pubchem数据库（http：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）查找其化学成分的“Smile”值，再通过SwissTargetPrediction[8](http：//www.swisstargetprediction.ch/）查找单个成分作用的靶点。将查找到的相关靶点输入至通用蛋白质数据库UniProt中，以校正靶点基因的名称。

1.2 心肌梗死靶点筛选

在人类表型本体数据库（HPO,http：//hpo.jax.org/app/）和人类孟德尔遗传数据库（OMIM,http：//omim.org/）[9]以“myocardialinfarction”为关键词进行搜索，查找并筛选与心肌梗死疾病相关的靶点基因，同时参考来源于文献中的基因数据，从而得到心肌梗死疾病的基因。

1.3 关键靶点的筛选

把复方中有效成分与心肌梗死对应的全部靶标输入STRING数据库（https：//string-db.org/）检索可能存在的潜在靶标，物种设为“Homosapiens”（人类），相互作用阈值设为高等置信度“highestconfidence”0.900，其余参数保持默认设置，将相互作用关系的数据导入Excel表中，再将该数据通过Cytoscape3.6.0软件[10]中的NetworkAnalyzer功能进行网络构建分析，并根据节点连接度（Degree）筛选出大于30的节点并合并化合物与疾病相关的交集靶点，记作为关键节点。

1.4 复方加味丹参饮靶标网络图的构建

利用Cytoscape3.6.0软件构建“加味丹参饮-化学成分-靶点”、“疾病-靶点”、“加味丹参饮-相关化学成分-疾病-关键靶点”进行网络可视化的蛋白质交互网络图。在网络中，节点可代表加味丹参饮、7味中药、有效成分、靶蛋白、疾病，而边代表各自之间的相互作用关系。

1.5 GO生物过程和KEGG代谢通路分析

将在“1.3”项下筛选得到的关键节点，利用DAVID(http：//david.ncifcrf.gov/）数据库将P值设置为<0.05进行GO生物过程和KEGG代谢通路分析。在GO分析中按照P值大小排序，分别在生物过程（Biologicalprocess）、细胞组成（CellComponent）、分子功能（MolecularFunction)3项中选取排名前20数据进行分析。而KEGG分析的选取原则是以P值<0.001为标准。

2、结果

2.1 加味丹参饮主要有效成分与靶点预测

根据OB>30%,DL>0.18为标准，从TCMSP中共筛选到加味丹参饮中的有效化学成分103个。其中丹参有60个化合物符合该标准，主要包括丹参酮、丹酚酸和芳香醛等。但查阅文献和药典[11]发现，活性很高的丹酚酸A和丹酚酸B却不包括在查找的有效成分当中，原因可能是丹酚酸A、丹酚酸B的OB和DL不能同时满足标准，因此系统自动把二者剔除掉。但鉴于丹酚酸A与丹酚酸B不仅是药典规定的药效成分，而且在心血管疾病应用中有着良好的疗效，故把两个化合物考虑在内，即丹参共以62个化合物纳入后续研究中。同样的条件下筛选其他药物的有效成分，得檀香有2个，川芎7个，当归2个，红花15个，生地黄2个，赤芍13个有效成分，主要包括黄酮、甾醇、苯丙素类。将复方中所包含的9个相同有效成分剔除，最终得加味丹参饮的有效成分为94个。然后在“1.1”项条件下进行靶点检索，删除靶点重复值后，共存在成分对应靶点451个。加味丹参饮中94个化学成分如表1所示，并将有效成分由简单字母代替，以便构建网络分析图。

表1加味丹参有效成分汇总表

2.2 心肌梗死疾病靶点的筛选

以“myocardialinfarction”为关键词，从人类表型本体数据库HPO中进行搜索，收集该数据库与心肌梗死有关的基因共51个，从人类孟德尔遗传数据库OMIM中搜索可得108个靶基因。将两个数据库得来的靶点基因进行合并，并删掉11个重复值，最终得到148个可能与心肌梗死相关的靶点。

2.3 复方加味丹参饮中关键靶标的筛选

将有效成分靶标与疾病靶标合并，剔除掉重复值即得578个靶标。把578个靶标导入至STRING数据库中，在“interactionscore”选项里设置“highestconfidence”为0.900，以获得高置信度的靶点相互作用数据。把高置信度的靶点互作数据导入Cytoscape3.6.0软件，筛选出Degree值大于30的关键互作靶点56个。因化合物与疾病存在21个交集靶点，考虑到交集靶点在预测加味丹参饮对心肌梗死机制研究的重要性，故把这21个交集靶点与56个关键互作靶点合并，删除重复值后得到72个关键靶标。

2.4 “加味丹参饮-有效成分-疾病-关键靶标”网络构建与分析结果

使用Cytoscape3.6.0绘制“加味丹参饮-化学成分-靶点”网络图，如图1所示，左侧中心倒三角形代表加味丹参饮，左侧菱形代表单味药材，左侧椭圆形代表药材所对应的有效成分，而右侧代表有效成分对应的靶标，结果共涉及由531个节点和1877条边。从图1可反映出加味丹参饮中的有效成分能够作用于多个靶点，而某些靶点又与多个有效成分息息相关，由此可见，加味丹参饮符合中药复方多靶点、多成分的特性。

构建“心肌梗死疾病-靶点”网络图，如图2所示，共得到148个靶点，可直观反映出疾病与靶点之间的关系，橘红色菱形代表心肌梗死（MI）；绿色菱形代表与MI相关的靶标。

构建“加味丹参饮-有效成分-疾病-关键靶标”网络靶点图，如图3所示，红色菱形代表复方加味丹参饮；橘色菱形代表心肌梗死；紫色椭圆形代表与关键靶点相关的化合物；粉色菱形代表复方与疾病的共同靶点；绿色菱形代表与化合物相关的关键靶点；深蓝色菱形代表与疾病相关的关键靶点。可见关键靶点中多数是复方有效成分所对应的靶点，也有大部分是复方与疾病共同交集靶点，如肿瘤坏死因子（TNF）、血管内皮生长因子A(VEGFA）、酪氨酸激酶2(JAK2）、基质金属蛋白酶（MMP）等，提示加味丹参饮对改善心肌梗死疾病的重要性。

图1加味丹参饮-化学成分-靶点图

图2心肌梗死-靶点图

图3加味丹参饮-有效成分-疾病-关键靶点图

2.5 GO功能分析、KEGG代谢通路富集分析结果

加味丹参饮治疗心肌梗死疾病的GO功能分析如图4所示。由图4可知，在加味丹参饮治疗心肌梗死的GO功能分析中，包括G蛋白偶联受体信号通路（G-proteincoupledreceptorsignalingpathway）、调节细胞增殖（regulationofcellproliferation）、细胞-细胞信号转导通路（cell-cellsignaling）、RNA聚合酶II转录因子活性（RNApolymeraseIItranscriptionfactoractivity）等多种功能过程。

加味丹参饮治疗心肌梗死疾病的KEGG代谢通路分析如图5所示。从图5可得，加味丹参饮有多种通路可能与治疗心肌梗死有关，主要为神经活性配体-受体相互作用（Neuroactiveligand-receptorinteraction）、第二信使cAMP信号通路（cAMPsignalingpathway）、PI3K-Akt信号通路（PI3K-Aktsignalingpathway）、微小RNA-癌症相关通路（MicroRNAsincancer）、VEGF信号通路（VEGFsignalingpathway）、JAK-STAT信号通路（Jak-STATsignalingpathway）、AMPK信号通路（AMPKsignalingpathway）、TNF信号通路（TNFsignalingpathway）等。

3、讨论

心肌梗死从中医学角度来说属于“真心痛”的范畴，是“胸痹心痛”进一步发展的表现，其发病机制复杂，现代观点表明气血亏虚、血瘀痰浊为心肌梗死最主要的病机[12,13]。随着中医药文化事业的不断发展，越来越多的复方也逐步运用到心肌梗死的治疗当中来。因加味丹参饮具有活血、行气、止痛、祛瘀之效，在临床上常作为经验方用来治疗心血管疾病。黄政德教授首先发现加味丹参饮预处理对损伤的心肌具有显著的延迟保护作用[4]。

加味丹参饮由丹参、川芎、檀香、当归、红花、赤芍、生地黄7味中药组成，具活血、行气、止痛、祛瘀之效，是临床上用于治疗心血管疾病的经验方。临床研究发现，用加味丹参饮治疗心血瘀阻症冠心病相关患者，可以改善各种临床不适应症、增强心功能、减轻并发症的发生率[14,15]。从疗效方面、安全角度对加味丹参饮进行了评价性研究，证明了加味丹参饮联合西药治疗心肌梗死，能够比单独使用西药治疗效果更优、安全性更高，且不会增加药物的毒副作用[16,17]。体内实验研究表明，加味丹参饮预处理对损伤的心肌具有显著的延迟保护作用[4]。同样地，该复方还能够降低缺血心肌大鼠血浆中的炎症因子水平，降低血小板黏附率及血浆黏度，扩张冠状动脉增加冠状动脉血流，减轻心力衰竭的损伤程度[18]。

图4加味丹参饮治疗心肌梗死的GO生物过程

图5加味丹参饮治疗心肌梗死的KEGG代谢通路富集

本研究运用网络药理学的方法从复方角度出发，通过构建网络图去探索加味丹参饮与心肌梗死疾病的物质基础与分子机制。首先从复方中筛选出94个可能与心肌梗死相关联的有效化学成分，发现丹酚酸、丹参酮、黄酮类、苯丙素类、甾醇类化合物均有着较大的degree值，暗示加味丹参饮治疗心肌梗死的物质基础可能是多个成分共同作用的结果。

大量实验数据验证了此次结果的可靠性，如加味丹参饮中的丹酚酸A、丹酚酸B、丹参素、丹参酮类、没食子酸、红花素、黄芩素、芍药苷等化学成分，均有文献报道其对心肌的保护作用[19,20,21,22,23,24]。因此，通过网络药理学结论、文献数据共同论证了加味丹参饮治疗心肌梗死的物质基础是多个有效成分共同作用的结果。

通过构建“加味丹参饮-相关化学成分-疾病-关键靶标”网络图，得到有效成分与疾病相关的关键靶点21个，如TNF、VEGFA、JAK2、MMP等关键靶点可能是加味丹参饮治疗MI的分子机制研究的基础，同时也阐明了中药复方“多成分-多靶点”的协同作用。TNF与心肌梗死中的炎症反应密切相关，除了自身引发的炎症反应以外，还能诱导IL-1、GM-CSF、IL-8等炎症因子的分泌。研究表明，加味丹参饮可通过降低TNF-α、IL-2、CK-MB等炎症因子水平来防止心肌细胞损伤[5]。VEGF作为血管内皮生长因子，能够促进血管再生、改善血液微循环，在治疗缺血性心脏病的过程中发挥着十分重要的作用[25]。

已有研究证实VEGF能够作为加味丹参饮调控的一个潜在靶标，该方能够促进骨髓间充质干细胞VEGF的分泌[26]。大量研究证实，丹参水溶性成分如丹酚酸B，与脂溶性成分如丹参酮ⅡA均能改善心肌梗死边缘区VEGF的表达，以促进血管再生[27,28]。JAK2是非受体型酪氨酸蛋白激酶家族的一种，通常与转录激活蛋白（STAT）构成JAK-STAT经典信号通路，参与机体免疫调节，细胞增殖、分化等进程。姚橘泉[29]得出了加味丹参饮可通过JAK2-STAT3通路对大鼠心肌缺血再灌注损伤起到保护作用的结论。MMP2、MMP-9等钙离子依赖的基质蛋白酶是MMP家族的重要成员，可靶向调控细胞表面因子、黏附分子、生长因子等众多蛋白，参与细胞外基质降解，对细胞生长、迁移、凋亡等活动发挥着极其重要的作用。现代研究表明，心梗病患者中MMP含量的增多，使得心肌纤维斑块胶原的降解，纤维帽变薄，最终导致斑块破裂是引起心肌梗塞的重要发病机制。

GO功能分析以及KEGG代谢通路分析结果表明，加味丹参饮治疗心肌梗死可能涉及到AMPK、mTOR、JAK-STAT、PI3K-Akt、VEGF等信号通路，参与细胞增殖、细胞调亡、氧化应激、炎症反应、自噬等生物过程。AMPK在协调生物体代谢和能量中起着重要作用[30]。AMPK可以与哺乳动物mTOR相互作用。当AMPK激活时，通过磷酸化抑制mTORC1使自噬增强，这是1条自噬的经典信号通路AMPK/mTOR轴[31]。有研究表明，丹参酮ⅡA可以通过AMPK介导的自噬通路来减轻抗癌药物对心肌细胞带来的损伤[32]。JAK-STAT信号通路与诸多细胞因子如白细胞介素（IL)-6、心肌营养素（CT-1）、干扰素（INF）及G-蛋白偶联受体的配体血管紧张素Ⅱ等息息相关，参与着多种对心脏损伤的反应，如心肌梗死、缺血预处理、心肌肥大等[33]。相关研究表明，加味丹参饮可通过JAK2/STAT3通路对大鼠心肌缺血再灌注损伤起到保护作用[29]。

磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）是一类在抗凋亡机制中起着重要作用的细胞因子。PI3K激活后可引发下游脂质底物磷酸化，激活下游蛋白激酶B，主要参与细胞生长和骨架重塑等过程，在细胞的增殖、分化与凋亡中起重要作用。PI3K/AKT/mTOR途径还是1条有关自噬的明星通路，可以影响胰岛素样和其他生长因子信号的生长[34]。曹慧敏[35]等发现丹参酮ⅡA对预防动脉粥样硬化有着良好的效果，可能机制是通过调控PI3K/Akt/mTOR信号通路促进自噬而发挥作用。

综上所述，从网络药理学角度去预测复方治疗疾病的潜在分子机制具有一定科学性与可信度。预测加味丹参饮的有效成分可能作用于上述信号通路的某些关键因子而起到治疗心肌梗死的作用。“系统-系统”的复杂网络的作用关系已经成为了中药复方与疾病之间的相互作用模式，而网络药理学则能够更宏观、更全面的去诠释药物对复杂疾病的生物作用，为中药复方-疾病作用机制的研究奠定理论基础，也为中药复方作用于疾病的深入研究提供更具创新的思路和技术手段。总之，本研究利用网络药理学研究加味丹参饮对心肌梗死的作用，从整体上预测了加味丹参饮治疗心肌梗死的作用机制，从多药物、多成分、多靶点、多途径的整体协同作用方面进行了初步诠释，也可为对加味丹参饮深入机制研究提供一定的理论基础。

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基金:国家自然科学基金青年项目(81704065);湖南省中医药科研项目计划重点项目(202016);湖南省自然科学基金面上项目(2020JJ4466);中医内科学省部级共建教育部重点实验室开放基金(ZYNK201401);湖南省教育厅科学研究优秀青年项目(16B198);湖南省自然科学基金青年项目(2017JJ3239);湖南省中医药科研计划项目(201790);中医内科学省部共建教育部重点实验室开放基金重点项目(ZYFT201507);湖南省自然科学基金-青年基金项目(2019JJ50471).