心血管病是世界范围内防治的慢性病、疑难病，我国现患人数3.3亿，居城乡居民死亡原因之首，其中冠心病患者1100万，患病率及死亡率仍逐年上升[1]。动脉粥样硬化（AS）是冠心病的病理基础，冠状动脉粥样斑块破裂和血栓形成是急性心血管事件发生的关键环节，防治AS对减少冠心病的发生率和死亡率具有重要意义。AS目前治疗以调脂、抗血小板为主，目的在于稳定斑块、防止疾病进展，并无特效治疗作用，且该类药物具有一定的肝肾损伤性[2]。AS的病理机制尚未完全阐明，其中血管平滑肌细胞增殖是AS形成的重要病理环节之一，而第一间歇期/合成期（G1/S）细胞周期转换是血管平滑肌增殖的关键步骤[3]。课题组前期进行临床证候研究发现，心阳虚证占冠心病患者所有证型的65.96%，占比居首，且贯穿疾病始终；痰瘀互结证占全部兼证的57.4%，血瘀、痰浊是疾病的必然病理产物，“阳虚痰瘀”是冠心病的主要病机[4]。AS是冠心病的病理基础，病性属本虚标实，以气虚（阳虚）为本，血瘀、痰浊为标[5]，治疗亦可从“阳虚痰瘀”入手。基于该病机，曹洪欣教授指出治疗当以温通心阳为重，以补助通，同时活血化痰，通补兼施，据此提出温阳益心法，并创制代表方温心方。该方以生脉散合瓜蒌薤白半夏汤加减，温阳益心同时活血化痰，是治疗冠心病与AS的有效方剂[6]。临床研究显示，温心方可显著减小冠脉狭窄患者冠状动脉斑块，降低狭窄程度（Gensini）积分及平均狭窄度[7]，改善冠心病患者临床症状[8]，抬升心电图ST段，停减硝酸甘油[9,10]。实验研究显示，温心方可显著降低AS大鼠血脂，减轻脂质过氧化物损伤，保护内皮细胞[11]；减少核转录因子-κB(NF-κB），单核细胞趋化因子（MCP-1），白细胞介素-6(IL-6),C反应蛋白（CRP）等炎症因子表达，抑制炎症反应[12,13]；降低血小板体积、分布密度及聚集率，下调血管性假性血友病因子（vWF），血栓烷B2(TXB2），血栓烷A2(TXA2）等，抑制血栓形成[14,15]。进一步的网络药理学分析发现，温心方治疗AS的机制可能是通过调控G1/S细胞周期转换实现的[16]。为验证该推论，本研究以温心方干预AS大鼠，应用分子生物学技术观察温心方对G1/S细胞周期转换关键靶点的作用，进一步揭示温心方治疗AS的作用机制，为临床应用温心方提供实验依据。

1、材料

1.1动物

雄性无特定病原体（SPF）级Wistar大鼠90只，5周龄，体质量180～200g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，合格证号SCXK（京）2016-0006。实验过程经中国中医科学院中医基础理论研究所医学伦理委员会批准（2018-065）。饲养于中国中医科学院中医基础理论研究所实验动物中心，每笼3只，自由饮食，室温（21.0±2.0）℃，湿度50.0%±10.0%，每隔12h开灯照明。

1.2药物及试剂

温心方组成药物：人参10g，桂枝10g，瓜蒌15g，薤白15g，法半夏10g，赤芍15g等，购自北京同仁堂中医医院中药房，由中国中医科学院王孝涛教授鉴定为正品，符合2020年版《中华人民共和国药典》规范；煎制方法：所有药物以双蒸水浸泡2h，人参先煎20min，再纳入剩余药物继续煎煮30min，将药液倒出，饮片再次加水煎煮30min,2次药液兑在一起，继续加热浓煎成2.5g·mL-1的浓缩液，4℃保存备用；瑞舒伐他汀（阿斯利康药业有限公司）；维生素D3（美国Sigma公司，批号47763）；总胆固醇（CHO），甘油三酯（TG），高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C），低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）测定试剂盒（南京建成生物工程研究所，批号分别为A111-2,A110-1,A112-1,A113-1);E2F转录因子1(E2F1）抗体，磷酸化成视网膜细胞瘤蛋白（p-Rb）抗体，细胞分裂周期因子25(Cdc25）抗体，细胞周期素E(CyclinE）抗体，细胞周期素D1(CyclinD1）抗体，β-肌动蛋白（β-actin）抗体（英国Abcam公司，批号分别为ab179445,ab71535,ab40754,ab111830,ab47763,ab8226）；辣根过氧化物酶酶标记羊抗兔免疫球蛋白（Ig)G（北京鼎国昌盛生物科技有限公司，批号SH-0031）；苏木素-伊红（HE）染色试剂盒（北京索莱宝科技有限公司，批号G1117);TRIzol试剂（上海拜力生物科技有限公司，批号15542-023）；逆转录试剂盒，实时荧光定量聚合酶链式反应（Real-timePCR）试剂盒（美国Invitrogen公司，批号分别为AM2044,4385614）。

1.3仪器

MultiskanMK3型酶标仪（美国ThermoScientific公司）；165-8003型垂直电泳仪，170-3930型湿转电转仪（美国Bio-Rad公司）；Odyssey型双色红外荧光扫描成像系统（美国LI-COR公司）；UV-2100型分光光度计（上海尤尼柯仪器有限公司）；ABIPRISM7500型Real-timePCR仪，ABIPRISM9600型普通PCR仪（美国ABI公司）。

2、方法

2.1造模

90只大鼠随机分为正常组6只和造模组84只，造模组采用前期改良的高脂饲料喂养联合腹腔注射大剂量维生素D3的方法建立AS大鼠模型[17]。大鼠给予高脂饲料（4%胆固醇，0.5%胆酸钠，0.2%丙基硫氧嘧啶，10%猪油，5%白糖，80.3%基础饲料）喂养60d，每7d腹腔注射维生素D3(40万U·kg-1)1次，连续3次。造模期间死亡45只，造模结束后随机抽取3只采集胸主动脉、冠状动脉进行HE染色，发现均有粥样斑块形成，提示造模成功。

2.2分组及给药

造模成功后随机分为模型组、温心方高、中、低剂量组及瑞伐舒他汀组，每组6只。以体表面积比计算大鼠给药剂量，温心方高、中、低剂量组分别给予24g·kg-1(2倍等效剂量），12g·kg-1（等效剂量），6g·kg-1(1/2倍等效剂量）温心方水煎液连续灌胃30d，瑞伐舒他汀组给予瑞伐舒他汀1.8mg·kg-1灌胃治疗30d，正常组及模型组给予相同体积生理盐水灌胃。给药结束后以40mg·kg-1戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，腹主动脉取血，4℃条件下3000r·min-1（离心半径10cm，下同）离心15min，血清-20℃冰箱保存。仔细剥离大鼠冠状动脉及胸主动脉，部分组织多聚甲醛固定，石蜡包埋、切片，剩余部分液氮冻存，-80℃冰箱保存。

2.3指标检测

2.3.1一般情况观察

观察各组大鼠皮毛、精神、进食等一般情况，每周测定一次体质量，取材时测定肛温。

2.3.2酶联免疫吸附测定法（ELISA）检测血脂

将血清按照试剂盒说明书进行CHO,TG,HDL-C和LDL-C检测，动脉粥样硬化指数（AI）的计算公式如下：AI=(CHO-HDL）/HDL。

2.3.3HE染色观察冠状动脉、胸主动脉病理学变化

取大鼠冠状动脉、胸主动脉样本，4%多聚甲醛固定，石蜡包埋、切片后行常规HE染色，显微镜下观察并拍照。

2.3.4蛋白免疫印迹法（Westernblot）检测主动脉E2F1,p-Rb,Cdc25,CyclinE,CyclinD1蛋白表达

取主动脉组织样品50～100mg，加入含蛋白酶抑制剂的RIPA裂解缓冲液，冰上匀浆，4℃条件下12000r·min-1离心5min抽提总蛋白；BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度；配制10%SDS聚丙烯酰胺凝胶，每孔加蛋白样品20μg,80V转120V电泳；湿转法200mA转膜2h;5%脱脂奶粉室温封闭1h；加入一抗稀释液（E2F1,1∶2000;p-Rb,1∶500;Cdc25,1∶2000;CyclinE,1∶2000;CyclinD1,1∶2000；β-actin,1∶5000）中4℃孵育过夜，TBST洗膜；加入二抗（1∶5000）抗体稀释液，室温避光孵育2h,TBST洗膜；Odyssey扫描成像系统扫膜，ImageJ软件测定条带灰度值，以目的条带与内参条带比值计算相对表达量。

2.3.5Real-timePCR检测主动脉E2F1,p-Rb,Cdc25,CyclinE,CyclinD1mRNA表达

从GenBank获得目的基因mRNA的全长序列，利用Primer5.0设计引物序列，由北京鼎国昌盛科技公司完成。所用的引物及内参甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）引物见表1。取大鼠主动脉组织液氮研磨后，按照试剂盒说明书提取RNA，测定RNA浓度（500～1000mg·L-1）计算加样量；以总RNA为模板，使用Invitrogen反转录试剂盒进行cDNA合成；依次加入反转录产物1µL，各基因上游与下游引物各0.5µL,PCR反应mix12.5µL，用双蒸水水补足体积至25µL，混匀后进行Real-timePCR扩增（95℃预变性2min,1个循环；95℃PCR反应15s;63℃退火30s;72℃延伸30s,35个循环）；PCR产物琼脂糖电泳，在凝胶成像系统下观察PCR产物的电泳带，并拍照存档；在Real-timePCR仪上获取溶解曲线程序，以基因2-ΔΔCt计算基因相对表达量。

2.4统计学方法

采用SPSS19.0进行统计处理，各组计量数据均以表示，采用单因素方差分析法考查显著性，方差齐时组间两两比较采用最小显著性差异法（LSD）检验，方差不齐则采用Tamhane'sT2检验，以P<0.05表示差异有统计学意义。

3、结果

3.1一般情况观察

正常组大鼠一般状况良好，摄食、饮水正常，毛色光洁，反应灵敏，活动自如，体质量显著增加。模型大鼠皮毛干枯无光泽，精神萎靡，饮食饮水明显减少，蜷缩弓背，较少活动，实验期间共死亡45只大鼠，死亡率与前期实验相符[7]。温心方高、中、低剂量组及瑞伐舒他汀组大鼠在给药后体质量出现上升，摄食、饮水增加，体温回升，蜷缩弓背现象有所好转，活动逐渐增多。取材时测量体质量及肛温，与正常组比较，模型组大鼠体质量明显降低，经药物治疗后，体质量显著增加（P<0.01）。模型组大鼠肛温较正常组低，各药物组肛温较模型组有所回升，但差异无统计学意义。见表2。

3.2对AS大鼠血脂的影响

与正常组比较，模型组大鼠HDL-C水平显著降低，LDL-C,CHO,AI水平显著升高（P<0.01),TG水平无明显差异。与模型组比较，温心方各剂量组LDL-C,CHO,AI水平均显著降低（P<0.01），中剂量组TG水平明显降低（P<0.05），各组HDL-C虽有升高，但差异无统计学意义，瑞伐舒他汀组LDL-C,CHO,AI水平显著降低（P<0.01),HDL-C水平明显升高（P<0.05）。见表3。

3.3对AS大鼠主动脉、冠状动脉病理学的影响

正常组冠状动脉及胸主动脉血管壁结构清晰，内皮细胞完整，内弹力板连续，外膜结缔组织疏松。模型组血管结构紊乱，内膜增厚，内皮细胞脱落，可见粥样斑块形成，纤维帽突出管腔，管腔变窄50%以上，其中含有大量巨噬细胞和泡沫细胞，胶原蛋白及平滑肌细胞增生，排列紊乱，外膜结缔组织增生。温心方低剂量组血管结构紊乱，部分区域可见内皮细胞破坏及粥样斑块形成，管腔明显变窄，内有炎性细胞浸润，平滑肌细胞及胶原增生，外膜结缔组织增生。温心方中剂量组血管结构不甚清晰，内皮细胞脱落，粥样斑块形成，管腔轻度变窄，炎性细胞浸润，平滑肌细胞和胶原含量增多。温心方高剂量组部分区域见粥样斑块，管腔稍有变窄，少量内皮细胞脱落，内弹力膜连续无断裂，平滑肌细胞及胶原增生。瑞伐舒他汀组管腔变窄不明显，内有炎性细胞浸润，管壁结构不甚清晰，平滑肌细胞及胶原增生，外膜组织增生。见图1,2。

3.4对AS大鼠主动脉G1/S细胞周期转换关键蛋白及基因表达影响

与正常组比较，模型组主动脉E2F1,Cdc25,p-Rb,CyclinE,CyclinD1蛋白表达明显升高（P<0.05）；与模型组比较，温心方各剂量组及瑞伐舒他汀组主动脉E2F1,Cdc25,p-Rb蛋白表达均明显下降（P<0.05），其中以温心方高剂量组下调的程度最为显著（P<0.05）；温心方低、高剂量组及瑞伐舒他汀组CyclinE,CyclinD1蛋白表达降低（P<0.05）。与正常组比较，模型组主动脉E2F1,Cdc25,p-Rb,CyclinE,CycilnD1mRNA表达均明显升高（P<0.05）；与模型组比较，温心方中、高剂量组及瑞伐舒他汀组主动脉E2F1,Cdc25,p-Rb,CyclinE,CycilnD1mRNA表达有不同程度降低（P<0.05），温心方低剂量组E2F1,Cdc25,CyclinEmRNA表达明显降低（P<0.05）。见图3,4，表4,5。

4、讨论

AS的主要标志是血管内膜增生，在高脂血症、高血压等多种因素刺激下，血管内皮细胞损伤及炎症反应可触发血管平滑肌细胞经历细胞周期而在内膜下发生过度增殖，导致血管内膜增生，形成粥样斑块，因此细胞周期作为细胞增殖的关键步骤，在AS进程中发挥重要作用[3]。研究发现，抑制细胞周期进展的药物具有治疗AS的作用。

细胞周期按时相顺序分为4期，其中G1期向S期的转换最为重要，G1期的细胞在成功进入S期后保持旺盛的分裂能力，完成DNA的合成与相关组蛋白的组装，细胞持续增殖。G1/S细胞周期转换受E2F1与pRB的调控。E2F1是细胞周期相关转录因子（E2F）家族成员之一，可以参与调控细胞增殖、凋亡等多种生理活动，是E2F家族成员中活性最具特点，也最受关注的一种。E2F1在AS中发挥双向作用，研究表明低表达E2F1可抑制血管平滑肌细胞增殖，减轻血管内膜增生，而抑制E2F1可减少血管内皮细胞凋亡，促进其增殖，起到内皮细胞修复的作用[21,22]。在G0和G1早期，E2F1通过其特异结合位点结合pRb，形成E2F1-DP-pRb复合物，此时E2F1的转录活性被抑制[23]。周期蛋白D(CyclinD1,CyclinD2和CyclinD3）表达，与细胞周期蛋白依赖激酶CDK4/6结合，磷酸化Rb,E2F1和DP-1从复合物中被释放出来，细胞从G0期进入G1期，并产生细胞进入S期所必需的蛋白产物，如CyclinA,CyclinE和细胞周期调控因子Cdc25等[24]。在G1晚期，CyclinE/CDK2表达，与CyclinD/CDK4/6共同使pRb高磷酸化，E2F1,DP1进一步脱离pRb，启动DNA合成，促使细胞进入S期[25]。因此，E2F1转录调节细胞周期，对平滑肌细胞增殖、血管内膜增生产生重要影响。

基于AS本虚标实，阳虚痰瘀互见的特点，曹洪欣教授提出温阳益心法，并创制代表方温心方。该方特点为“温阳益心，贵在温通；痰瘀同治，宜先理气；滋阴清热，既病防变”。方中以人参、桂枝、薤白为君，温补心阳，通阳化气，使气血津液得以运行，杜绝生邪之源，同时有助于痰瘀的消散；用瓜蒌、半夏、川芎、赤芍为臣，理气宽胸，痰瘀同治，使实邪尽去；胸痹病势缠绵，痰瘀易郁久化热，应用麦冬、黄连一方面滋阴清热，另一方面防其化热之虞，既病防变。

本研究以温心方干预AS大鼠发现，温心方可改善AS大鼠一般情况，降低血脂，与前期实验结果一致。病理结果显示温心方可有效减轻AS大鼠主动脉及冠状动脉血管内膜胶原蛋白及平滑肌细胞增生程度。在蛋白、基因水平，AS大鼠主动脉E2F1,Cdc25,p-Rb,CyclinE,CyclinD1蛋白及基因表达较正常组有所上升，提示G1/S细胞周期转换被激活，血管平滑肌细胞出现过度增殖；温心方各剂量组及瑞伐舒他汀组主动脉E2F1,Cdc25,p-Rb,CyclinE,CyclinD1蛋白及基因表达较模型组均有不同程度的下降，其中以温心方高剂量组的下调程度最为显著，提示温心方可显著抑制AS大鼠主动脉G1/S细胞周期关键调控蛋白及基因表达，调控G1/S细胞周期转换。

本研究验证了前期网络药理学研究的预测结果，也为下一步的实验研究提供了思路，温心方可能通过调控主动脉G1/S细胞周期转换，减轻血管平滑肌细胞增殖，改善血管内膜增生，治疗AS。该假说有待进一步的实验验证。

参考文献：

[1]中国心血管健康与疾病报告2019概要[J.心脑血管病防治，2020,20(5):437-450.

[2]廖玉华，程翔，黄恺，等.ASCVD患者逆转斑块他汀治疗专家共识[J].临床心血管病杂志，2015,31(1):1-5.

文章来源：李金霞,宗文静,曹洪欣.温心方对动脉粥样硬化大鼠G_1/S细胞周期转换的调控作用[J].中国实验方剂学杂志,2021,27(20):38-45