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CBF-AML患者诱导缓解率受信号传导通路基因突变的影响及临床特征分析

2020-06-19 652 上传者：管理员

摘要：目的:研究融合基因外其他基因突变对核心结合因子相关急性髓系白血病(CBF-AML)患者1个疗程诱导化疗达首次完全缓解的影响。方法:采集2015年1月至2019年1月在山西医科大学第二医院血液科收治的43例初发CBF-AML患者的骨髓或外周血标本,提取DNA,通过高通量测序检测34种常见血液肿瘤基因突变情况;结合其临床特征,分析相关基因突变对1个疗程诱导化疗完全缓解(CR1)率的影响。结果:43例初发CBF-AML患者初发时骨髓或外周血DNA均通过二代测序(NGS)检测了34种基因,其中16种基因存在突变,KIT基因突变率最高(48.8%),其次为NRAS(16.3%),ASXL1(16.3%),TET2(11.6%),CSF3R(9.3%),FLT3(9.3%),KRAS(7.0%)。不同功能基因突变检出率依次为:信号传导通路基因(KIT、FLT3、CSF3R、KRAS、NRAS、JAK2、CALR、SH2B3、CBL)突变发生频率最高,为72.1%(31/43);表观遗传修饰基因突变频率为30.2%(13/43,包括ASXL1、TET2、BCOR);转录调节基因突变频率为7.0%(3/43,包括ETV6、RUNX1、GATA2);剪接因子相关基因为2.3%(1/43,包括ZRSR2)。经1个疗程诱导化疗CR1率为74.4%。初诊时WT1低表达(表达量临界值选取WT1中位值788.9)患者经1个疗程诱导化疗更易获得CR1(P=0.032),且1个疗程获CR1组患者的RFS显著长于未获CR1组患者[7.6(2.2-44.1)对5.8(1-19.4),(P=0.048)]。信号传导通路基因突变组的1个疗程诱导治疗CR1率明显低于非信号传导通路基因突变组(64.5%对100%,P=0.045),但血清羟丁酸脱氢酶(HBDH)水平显著高于非突变组[418(154-2702)对246(110-1068),P=0.032],2组CD56表达情况总体无差异(P=0.053),仅限于≥20%表达与不表达间存在差异(P=0.048)。结论:存在信号传导通路基因突变的CBF-AML患者常伴较高的HBDH水平和CD56表达,1疗程诱导缓解率低。

关键词：
CR1
信号传导通路
基因突变
核心结合因子相关急性髓系白血病
白血病
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核心结合因子相关急性髓系白血病（CBF-AML）约占成人AML的15%-20%，是1组伴有t(8;21）或inv(16）遗传学异常的的白血病亚型，包含以转录因子RUNX1(AML1）和CBFB为靶点的染色体易位或倒置，染色体重排产生AML1-ETO或CBFβ-MYH11融合基因，预后较好[1,2,3,4,5,6]，诱导化疗首次完全缓解率（CR1）高达70%[7,8]。尽管如此，仍然有部分患者在经1个疗程诱导化疗后并不能达CR1，需要2个以上疗程诱导方能达CR1。随着二代测序等技术的应用发展，更多参与AML发病的协同基因突变相继被发现并研究，至于这些突变是否为诱导缓解异质性的影响因素还不是很明确。因此，需要对这部分患者的特征及预后进行分析，以进一步探究基因突变是否为影响诱导缓解异质性的主要危险因素。本研究通过分析43例初发CBF-AML患者基因突变及临床特征，以期能为CBF-AML提供更详尽的影响首次诱导化疗缓解的分子标志。

一、材料和方法

病例资料

43例CBF-AML初发患者均来自于山西医科大学第二医院血液科，其中男23例，女21例，中位初诊年龄44(15-68）岁。所有患者均经MICM分型确诊，染色体核型分析检测到t(8;21)(q22;q22）或inv(16），并且经PCR方法证实均存在相应的AML1-ETO或CBFβ-MYH11融合基因。其中37例为伴t(8;21）异常，6例为伴inv(16)异常。

试剂与仪器

OMEGAminiBloodDNA提取试剂盒为美国Omega公司产品，蛋白核酸分析仪为美国GeneCompanyLimited产品，染色体核型分析系统为美国Leica公司产品，Illumina测序仪（MiniSeq）为美国Illumina公司产品。

基因组DNA提取

初诊时采集患者骨髓或外周血，EDTA抗凝，分离骨髓或外周血有核细胞，按照OMEGAminiBloodDNA提取试剂盒（美国Omega公司产品）操作说明提取基因组DNA。验证DNA浓度和纯度后将基因组DNA样品稀释至50ng/μl。

染色体核型分析

采用常规R显带技术进行核型分析，细胞核型根据《人类细胞遗传学国际命名体制（ISCN2009）》进行描述。

二、治疗方案

诱导化疗方案、强化巩固治疗方案及挽救化疗方案均根据患者的个体情况确定，43例患者均采用以含标准剂量阿糖胞苷（Ara-C）的IA方案为主的化疗方案进行诱导缓解治疗（I为去甲氧柔红霉素，A为Ara-C）。缓解后的患者均接受以中剂量Ara-C为主的强化巩固治疗。

疗效标准

CR的判断标准参照《血液病诊断及疗效标准（第4版）》。骨髓形态学复发定义为治疗获得完全缓解（CR）后骨髓涂片形态学分类白血病细胞比例超过有核细胞的5%。

随访

采用查阅病例及电话方法随访，自初发时开始随访，截止时间为2019年1月10日。中位随访时间为8.3(2-44.8）个月。

统计学分析

采用SPSS20.0软件进行统计学分析。计量资料以中位数（范围）表示，采用t检验进行比较。分类变量以例数（构成比）表示，采用Fisher确切概率法进行组间比较。生存分析采用Kaplan-Meier描述，组间差异检验采用Log-rank法。疾病确诊至死亡或随访截止的时间段为总体生存（OS）时间，第1次完全缓解为CR1，第1次完全缓解至第1次复发或死亡的时间段为无复发生存（RFS），复发后经1个疗程挽救化疗达完全缓解为CR2。P<0.05为差异有统计学意义。

三、结果

患者临床特征

43例CBF-AML初发患者，男23例，女20例，中位初诊年龄为45(15-68）岁，初诊时外周血白细胞计数（WBC）中位值为8.68(0.82-258.75）×109/L，血红蛋白浓度（Hb）中位值为71(39-114)g/L，血小板计数（Plt）中位值为21(7-144）×109/L，中性粒细胞绝对值（ANC）中位值为3.16(0-27.49）×10[9]/L，骨髓原始细胞比例为40(8-94）%，乳酸脱氢酶（LDH）水平中位值为495.2(149.0-3647.0)U/L，羟丁酸脱氢酶（HBDH）水平中位值为369.0(110.0-2702.0)U/L,WT1表达量为788.9(1.2-10716.7),20.93%(9/43）伴附加染色体异常。32例患者经1个疗程诱导化疗达CR1。10例患者复发，中位复发年龄为40.8(18-68）岁。中位RFS为7(1-44.1）个月，中位OS为8.3(2-44.8）个月。CD56表达阳性率为65.1%(28/43),6例伴inv(16)AML患者均不表达CD56。

基因突变情况

所有患者初诊时的骨髓或外周血DNA标本均由二代测序（NGS）检测34种基因突变情况。其中16种基因存在突变（图1）。其中，KIT基因突变阳性21例（48.8%),NRAS突变阳性7例（16.3%),ASXL1基因突变阳性7例（16.3%),TET2基因突变阳性5例（11.6%),CSF3R基因突变阳性4例（9.3%),FLT3基因突变阳性4例（9.3%),KRAS突变阳性3例（7.0%）。JAK2、CALR、ETV6、RUNX1、GATA2、SH2B3、ZRSR2、CBL及BCOR各检出1例（均为2.3%）。

不同功能基因突变检出率依次为：信号传导通路基因（KIT、FLT3、CSF3R、KRAS、NRAS、JAK2、CALR、SH2B3、CBL）突变发生频率最高，为72.1%(31/43）；表观遗传修饰基因突变频率为30.2%(13/43，包括ASXL1、TET2、BCOR）；转录调节基因突变频率为7.0%(3/43，包括ETV6、RUNX1、GATA2）；剪接因子相关基因为2.3%(1/43，包括ZRSR2）（图1）。t(8;21）患者检出以上16种基因突变，inv(16)患者仅检出KIT、NRAS、TET23种突变(图1)。

1个疗程诱导化疗完全缓解情况及影响因素分析

43例患者经1个疗程诱导化疗后，32例（74.4%,32/43）患者获得CR1。1个疗程诱导化疗获得CR1组与1个疗程诱导化疗未获得CR1组临床特征比较显示,初诊时WT1低表达（表达量临界值选取WT1中位值788.9）患者经1个疗程诱导化疗更易获得CR1(P=0.032）。1个疗程获CR1组患者的RFS显著长于未获CR1组患者[（7.6(2.2-44.1)vs5.8(1-19.4)months,(P=0.048）]。其余指标无统计学差异（表1）。

信号传导通路基因突变对CBF-AML诱导化疗疗效的影响

按照是否存在信号传导通路基因突变将患者分为突变阳性组与突变阴性组。突变阴性组12例(100%)患者均在1个疗程诱导化疗获得CR1,31例突变阳性组患者中20例（64.5%）在1个疗程诱导化疗获CR1(P=0.045）。11例1个疗程诱导化疗未获CR1患者中，有8例在接受第2个疗程诱导化疗后获得CR2,3例患者在化疗后骨髓抑制期死亡。信号传导通路基因突变组与非突变组临床特征比较见表2。信号传导通路基因突变组与非突变组患者在初发时性别、年龄、WBC计数、辅助性T(Th）淋巴细胞百分比、骨髓原始细胞比例、WT1表达、CD56表达、诊断时合并附加染色体异常、获CR1所需疗程数、RFS均无统计学差异。信号传导通路基因突变组羟丁酸脱氢酶（HBDH）水平显著高于非突变组[418(154-2702)vs246(110-1068),(P=0.032）]。两组CD56表达情况总体无差异（P=0.053），仅限于≥20%表达与不表达间存在差异（P=0.048）。此外，突变组LDH水平高于非突变组，但无统计学差异（P=0.07）。

信号传导通路基因突变对CBF-AML复发及挽救化疗疗效的影响

如表2所示，信号传导通路基因突变组复发率为22.6%，非突变组为25%，两组间无显著差异。突变组7例复发患者经1个疗程挽救化疗后，仅3例（42.9%）能获得CR2，而非突变组3例复发患者经1个疗程挽救化疗后均能获得CR2(100%），但无统计学差异（P=0.2）。

信号传导通路基因突变对OS的影响

本研究中信号传导通路基因突变组中位生存期为8.3(2-37）个月，非突变组8.6(3-44.8）个月，非突变组OS略高于突变组，但差异无统计学意义（P=0.08）（图2）。

四、讨论

CBL-AML通常预后良好，但仍有部分患者经1个疗程诱导化疗后不能获得完全缓解，CBF-AML患者的生物学特性和临床表现出很大的异质性，而临床的多样性大多体现在许多有预后和治疗价值的基因突变上。

本研究结果显示，信号传导通路基因突变影响第1个诱导疗程CR1率，突变组CR1率低于非突变组。信号传导通路基因包括KIT、FLT3、CSF3R、KRAS、NRAS、JAK2、CALR、SH2B3、CBL1[9,10]，其中KIT突变发生率最高为47.7%，多数报道中KIT突变对于初始诱导化疗缓解率无显著影响[11,12]，本研究结果与此一致。研究显示[13],KITExon17突变患者初始诱导缓解率低于无KIT突变患者。且KIT突变与治疗后较高的复发率有关[11,13]。王建祥等[14]发现KITD816突变伴t(8;21）患者初次复发再诱导化疗缓解率显著低于非突变患者，RFS更短，但在本研究中，KITD816与RFS、复发及挽救化疗疗效无显著影响。FLT3-ITD在CBF-AML中相对少见，在t(8;21）患者为2%-10%[9,15],inv(16)患者为0-7%[9,15,16]，小鼠模型已经证明当FLT3-ITD与RUNX1-RUNX1T1[17]和CBFβ-MYH11[18]共存于白血病细胞时可诱发急性白血病。FLT3-TKD在inv(16）患者中更常见（6%-24%），在t(8;21）患者中为2%-16.7%[15,18,19,20]。FLT3-TKD患者的预后情况较野生型患者无明显差异[20]。FLT3在CBF-AML中的预后意义尚待确定。本研究中也未观察到FLT3（其中FLT3-TKD与FLT3-ITD各2例)突变对预后的影响。鉴于FLT3-TKD在inv(16）患者中的发病率相对较高，有必要深入研究分析构成酪氨酸激酶抑制剂潜在治疗靶点的FLT3突变的预后影响。RAS基因突变包括NRAS和较少的KRAS，在inv(16）患者中很常见，约占54%[9];8%-26%的t(8;21）患者存在RAS突变[9,15]。本研究RAS突变在CBF-AML总发生率为23.3%。目前，RAS突变对AML预后的影响尚未完全明确。有研究表明，RAS突变并不影响成人AML患者的总体生存，而NRAS突变可能是AML患儿预后不良的1个关键的预后指标[19]。CSF3R在AML中不常见，当突变发生时往往与核心结合因子基因异常有关[20]，深入了解CSF3R突变与AML1-ETO或CBFβ-MYH11融合基因之间的相互作用有助于更清楚地了解其在CBF-AML发展中的作用。JAK2突变在CBF-AML中并不常见，1项研究中138例CBF-AML患者中有5例（3.6%）存在JAK2突变[2例有t(8;21）和3例有inv(16）]，具有JAK2突变的CBF-AML患者的无病生存率（DFS）显著低于没有这些突变的患者的DFS[21]。但乔曼等[16]在58例CBF-AML患者中未检出JAK2突变。Schnittger等[22]提示JAK2突变可能与经蒽环类药物和拓扑异构酶抑制剂治疗的治疗相关性CBF-AML相关。然而，有研究在初发CBF-AML中检测到JAK2V617F突变[23]。在本研究中，37例初发t(8;21）患者中1例检测到JAK2突变，6例初发inv(16）患者中无1例发生JAK2突变。CALR、SH2B3基因突变多见于骨髓增殖性肿瘤患者，在CBL-AML患者中报道较少，对AML预后的影响尚未完全明确。

此外，1个疗程获CR1组患者的RFS显著长于未获CR1组患者。这提示，1个疗程获CR1组患者的预后较未获CR1组好。并且发现，初诊时WT1低表达患者经1个疗程诱导更易获得CR1，初诊时WT1高表达为预后不良因素。窦翠云等[24]也得出类似的研究结论，中、高危组病人经1疗程治疗后,缓解组的WT1表达量低于未缓解组，未缓解组WT1低表达的病人经再次诱导易达缓解，WT1低表达2年OS明显延长。

本研究结果显示，信号传导通路基因突变与高羟基丁酸脱氢酶（HBDH）水平、CD56表达情况相关。细胞溶质中2型羟基丁酸脱氢酶（BDH2）过度表达可缩短总生存率，降低强化诱导化疗的应答率[25]。信号传导通路基因多项研究表明CD56阳性是AML患者预后不良影响因素[26,27,28,29]。

本研究因例数较少，故仅能初步反应信号传导通路基因突变对患者初次诱导缓解存在影响，还需要在将来的临床工作中进一步扩大样本量以进行统计总结。总之，信号传导通路基因突变对CBL-AML患者初次诱导缓解存在影响，经1个疗程诱导化疗不易获得CR1，此类患者初发时常伴较高的HBDH水平和CD56≥20%表达。此发现有助于更准确深入地对CBL-AML患者进行评估预后及危险分层，为提高诱导化疗首次完全缓解率及延长患者总体生存期提供新的治疗策略。

参考文献：

14]宫本法,谭业辉,廖爱军,等.KITD816突变对伴t(8;21)复发急性髓系白血病预后的影响.中华血液学杂志,2018;39(6):460-464.

[16]乔曼,李渭阳,孙爱宁,等.核心结合因子相关性急性髓系白血病中酪氨酸激酶突变分析及其临床意义.中华血液学杂志,2011;32(10):679-683.

[24]窦翠云,张继磊,黄倩,等.急性白血病患者WT1基因定量监测与预后的关系.中国实验血液学杂志,2018;136(6):1632-1636.

范丽芳,许晶,陈秀花,田婷婷,谢娟,胡晋君,郭志萍,覃艳红,徐智芳,任方刚,张耀方,罗明,任维肖,王宏伟.信号传导通路基因突变对CBF-AML患者一个疗程诱导缓解率的影响及临床特征分析[J].中国实验血液学杂志,2020,28(03):781-788.