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荧光法检测血小板在异常血小板计数中的临床研究

2024-11-28 20 上传者：管理员

摘要：目的：研究荧光法检测血小板(PLT)在异常PLT计数中的临床价值。方法：收集EDTA-K2抗凝的门诊标本195例，分为对照组、低值PLT组、小红细胞组、PLT异常直方图组和PLT聚集组。采用电阻抗法(PLT-I)和荧光法(PLT-F)检测各组PLT水平，并与人工镜检法(PLT-M)进行相关性分析和差值百分比的Bland-Altman分析。结果：对照组PLT-M与PLT-F的相关性和PLT-I接近(r=0.995、0.987),具有较好的一致性。低PLT组PLT-F与PLT-M具有更高的相关性(r=0.990)和一致性；小红细胞组PLT-M与PLT-F具有更高的相关性(r=0.996);PLT异常直方图组PLT-F与PLT-M相关性(r=0.996)和一致性均优于PLT-I。结论：在小红细胞症以及存在红、白细胞碎片或巨大PLT、PLT微小聚集等异常血液标本中，荧光检测法由于其高度的特异性，适用于复查此类标本的PLT计数。

关键词：
手工法
电阻抗法
荧光法
血小板计数
血细胞分析仪
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血小板(PLT)计数是临床继白细胞、红细胞系列参数外又一重要检测参数，是健康体检者重点关注的项目之一，并在临床血液疾病诊断，术前术后监测及指导PLT输注，监控干细胞植活等方面都具有重要价值。如何得到准确的PLT数量一直是临床实验室追求的方向。传统电阻抗法因不能完全排除非PLT有形成分(如小红细胞，红、白细胞碎片或杂质)以及PLT聚集的干扰，无法满足临床需求。随着检验技术的进步，血细胞分析仪中新型光学法、荧光法是否能在上述干扰物质存在情况下，替代人工镜检以得到更加准确的PLT仍需进行评估。因此，本研究在上述干扰物质存在的情况下，同时用电阻抗法和荧光法计数PLT,并与手工显微镜计数PLT进行相关性分析和作差值百分比的Bland-Altman图进行仪器法与手工法之间的一致性分析。

1、对象与方法

1.1研究对象

收集2022年11月—2023年5月就诊于我院门诊患者195例，分为健康对照组(各参数均在正常范围内，无任何直方图或文字报警)49例，低PLT组(PLT-I法<80×109/L,排除PLT聚集)49例，小红细胞组(MCV<70fL,血小板直方图尾部上翘)70例，PLT异常直方图组(MCV>70fL,PLT>80×109/L,PLT直方图出现明显陡坡或无规律图形)17例，经涂片染色镜检验证PLT聚集组10例。严格按操作规程留取各组EDTA-K2抗凝静脉全血2mL。

1.2仪器与试剂

仪器为日本原装进口System-9000全自动血液分析仪及原装配套试剂(CELLPACK DFL,批号：A2007、CELLPACK DCL,批号：G2400、Fluorocell PLT染色液，批号：A2031),SP-10全自动推片机(日本System公司生产),伯乐血液分析质控品，OLYMPUS BX43相差显微镜，牛鲍氏计数板，10g/L草酸铵稀释液。

1.3方法

严格执行全自动血液分析仪(以下简称XN-9000)的保养要求，每年2次对仪器进行校准。每日开机自检合格后运行1次室内质控。在质控各参数均在控且与全球同系列仪器比对合格后，对临床样本进行自动进样检测。将仪器运用电阻抗法检测血小板标记为PLT-I,荧光法标记为PLT-F。手工法：草酸铵稀释液0.38mL,加入20μL新鲜抗凝全血，立即混匀，待完全溶血后再混匀1min,静置室温10min。吸取混悬液，充入计数池，静置10～15min后由两名资深检验人员采取双盲法计数PLT(2次计数结果误差<10%)[1],取平均值标记为PLT-M。对各组标本同时采用PLT-I通道和PLT-F通道进行PLT计数，并与PLT-M作比较。PLT聚集组更换枸橼酸钠抗凝全血上机用PLT-I通道检测PLT并与原血标本PLT-F通道法做比对。各项检测均在采血后1～2h完成。

1.4统计学方法

分别采用SPSS16.0和MedCalc软件进行Pearson或Spearman相关性分析和差值百分比的Bland-Altman绘图分析。

2、结果

2.1各组标本PLT-I、PLT-F与PLT-M相关性分析

对照组、低PLT组、小红细胞组及PLT异常直方图组PLT-F与PLT-M、PLT-I与PLT-M具有相关性(P<0.05),见表1。PLT-I与PLT-F的r值分别为0.993、0.821、0.928、0.605。因无法准确计数PLT聚集组的PLT-M和PLT-I,故未作PLT聚集组PLT-F、PLT-I与PLT-M相关性评价。

2.2各组标本PLT-I、PLT-F与PLT-M一致性分析

表1各组PLT-I、PLT-F与PLT-M的相关性分析

对照组PLT-I、PLT-F分别与PLT-M作Bland-Altman图，见图1。PLT-I 95%一致性界限可信区间为(-6.524 5%,10.719 9%),2.0%(1/49)的点在95%一致性界限以外，差值百分数均值为2.1%;PLT-F 95%一致性界限可信区间为(-4.824 5%,5.518 2%),2.0%(1/49)的点在95%一致性界限以外，差值百分数均值为0.3%。

图1对照组PLT-I、PLT-F与PLT-M的Bland-Altman图

图2低PLT组PLT-I、PLT-F与PLT-M的Bland-Altman图

图3小红细胞组PLT-I、PLT-F与PLT-M的Bland-Altman图

图4 PLT异常直方图组PLT-I、PLT-F与PLT-M的Bland-Altman图

3、讨论

PLT参数是血液分析中重要组成部分。准确的PLT计数对红细胞碎片综合征，如烫伤、DIC、TTP患者意义重大，同时在血小板制剂输血决策及手术禁忌证中起到至关重要的指导作用。目前ICSH推荐的检测PLT数量参考方法是流式细胞仪法[2]和手工计数法[3]。但由于流式细胞仪法需要购置昂贵的仪器，且操作繁杂，测定成本高，检测时间长，无法在各实验室内普及使用。而相差显微镜手工计数法由于操作简便，抗干扰能力强，准确性高，仍然是许多实验室推崇的参考方法，即本文选择的参考方法。

XN-9000的PLT-I法是利用鞘流直流阻抗法计数同一通道内的红细胞和PLT,被鞘流包裹着的细胞颗粒通过小孔中央时产生的脉冲电压信号被其独创的数字波形处理技术灵敏地捕捉到，再根据脉冲电压大小结合浮动界标法间接区分出红细胞与PLT。PLT-I检测速度快、重复性好、准确性高、成本低廉，是目前大多数全自动血液分析仪检测PLT的主要方法。在49例健康组标本PLT计数中，PLT-I与PLT-M的r值为0.987,电阻抗法与手工法具有较好的相关性与一致性。可见PLT-I在正常血液标本PLT的准确度、精密度都是符合国家卫生健康临床检验中心室间质量评价标准，可以直接应用于临床。

但由于PLT-I方法学原理的局限性，无法完全排除相似颗粒的干扰，对异常PLT计数准确性有限。应势而生的PLT-F核酸荧光法是采用半导体激光流式细胞术，利用可强烈着染PLT内含RNA的核糖体和线粒体成分的特殊染料，给血小板“上色”,其对红细胞(或细胞碎片)的浆膜着色甚微[4],可特异地将红细胞与血小板区分开来，从而排除小红细胞、细胞碎片等对PLT计数的干扰，弥补了PLT-I法的不足。

福建地区作为地中海贫血的高发地区，加上缺铁性贫血、慢性疾病等人群的存在，日常血液分析检测中小红细胞症十分易见。小红细胞由于体积减小，甚至变为极小，在PLT-I法中容易干扰PLT检测，这在小红细胞组的检测比对中得到了验证。在小红细胞组中，PLT-I与PLT-M相比，PLT数明显增多，有的甚至超出临床检验中心室间质量评价标准，对临床诊断直接造成影响[5]。两者的r值为0.925,而PLT-F与PLT-M的r值达到0.996。运用PLT-F法计数PLT是非常可靠的[6]。

在低值PLT组统计比对中，PLT-I计数值大多偏低，PLT-I与PLT-M的r值为0.865,而PLT-F与PLT-M的r值为0.990。PLT-F与PLT-M的相关性明显优于PLT-I。这可能是由于PLT-F通道计数的标本量是PLT-I的3～5倍。在排除PLT聚集所致假性PLT减少的情况下，PLT较低的标本也能获得高精度的结果。许多研究者认为，PLT-F通道法是PLT减少患者合理选择PLT输注的首选方法[7]。PLT-F法可以作为快速准确的PLT复查方法。

在PLT异常直方图组中，有4例患者为小红细胞干扰(70fL

值得一提的是，PLT-F通道在微小聚集样本中可以正确纠正PLT。在10例聚集样本的PLT检测中，除2例严重聚集病例的PLT计数无法得到纠正外，另8例样本经SP-10全自动推片机推片染色镜检可见3～10个PLT聚集成簇，聚集个数≥5个，主要分布在片中、片尾处。PLT-F通道检测的PLT数均大幅度高于PLT-I通道。更换枸橼酸钠抗凝剂，重新采样后检测的PLT数均与PLT-F通道检测数目大致相符。这10例聚集样本中，有1例Q-Flag(血小板聚集阈值)提示为0,1例提示为30,其余均提示为300(仪器Q-Flag阈值为100)。这与曹宝华等[10]的研究相符。可见不能将Q-Flag值作为PLT聚集的唯一报警信号，仍需结合PLT直方图或散点图报警信息综合判断，必要时人工镜检确认。因此，本实验室针对PLT减少的复查规则是：在排除标本凝固或冷凝集等情况下，当PLT<80×109/L或(80～125)×109/L且同时出现PLT直方图异常或散点图异常或Q-Flag报警[11],则此类标本可启用PLT-F通道复检，并同时推片染色镜检。若显微镜下无PLT聚集出现，则选择PLT-F通道检测值报告结果。若出现PLT聚集，PLT-F通道检测值大幅度高于PLT-I通道(即已纠正PLT),可在大致评估镜下PLT数的前提下，用PLT-F通道值报告结果。若PLT-F通道与PLT-I相差不大(即无法纠正PLT),则更换枸橼酸钠抗凝剂重新采样检测。这样能缩短标本的检测周期(TAT),减轻患者痛苦。

总之，对于正常血液标本，血液分析仪适合采用标本体积更少、计数时间更短及成本更低的PLT-I法检测PLT数量。但在小红细胞症及存在红、白细胞碎片或巨大PLT、PLT微小聚集等异常血液标本中，PLT-F荧光检测法由于其高度的特异性能，显示出了极佳的准确度和精密度[12],适用于作为一个反射实验对怀疑PLT-I法计数不准确的标本复检。

参考文献:

[1]尚红,王毓三,申子瑜.全国临床检验操作规程[M].第4版.北京:人民卫生出版社,2015:14-16.

[3]刘成玉,罗春丽.临床检验基础[M].第5版.北京:人民卫生出版社,2014:67-70.

[5]徐文丽,李舟.XN-9000血细胞分析仪3种计数血小板方法结果差异分析[J].临床血液学杂志,2017,30(2):122-125.

[7]史东沙,胡志东.PLT-F通道在异常血小板计数检测中的应用进展[J].国际检验医学杂志,2023,44(5):628-631,640.

[8]周小棉,邹晓.假性血小板减少症研究进展[J].中华检验医学杂志,2007,30(9):1065-1068.

[9]廖远泉,郭喜.EDTA依赖性假性血小板减少症的探析及其对策[J].中华临床实验室管理电子杂志,2020,8(3):133-139.

[10]曹宝华,郭雪雅.Sysmex XN9000血细胞分析仪血小板聚集报警的可靠性评价[J].中国卫生检验杂志,2021,31(16):1991-1997.

[11]程翔,王刚强,郑善銮.两种报警信息联合应用在改进血小板准确计数流程中的价值评估[J].检验医学与临床,2017,14(5):621-623.

文章来源:郑艳斌,陈丽萍,林卫,等.荧光法检测血小板在异常血小板计数中的临床研究[J].医学理论与实践,2024,37(22):3897-3900.