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纳米金-钴离子比色探针的制备及对半胱氨酸的测定

2024-05-06 30 上传者：管理员

摘要：采用抗坏血酸还原氯金酸制备纳米金，在钴离子的存在下，半胱氨酸诱导纳米金团聚，溶液颜色由红色变为蓝色，据此建立一种半胱氨酸测定新方法。讨论了纳米金-钴离子比色探针的制备条件，探究了测定半胱氨酸的实验条件。结果表明：纳米金-钴离子比色探针测定半胱氨酸的最佳反应时间为20 min、缓冲溶液p H为3.0，该方法测定半胱氨酸的线性回归方程为A725/A520=0.3965 C+0.0133(C单位为μM),R2=0.9882，线性范围为1×10-7～1×10-6 mol/L，方法检出限为2.2×10-8 mol/L。采用标准加入法对健康人的尿样进行回收率测定，回收率为92.8%～95.8%。文中创建了一种简便测定半胱氨酸的方法。

关键词：
半胱氨酸
比色法
纳米金
细胞代谢
钴离子
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半胱氨酸是一种含有硫的必需氨基酸，它在合成蛋白质、细胞代谢至关重要的作用，同时也对许多有害物质和毒素也具有解毒的作用。人体内半胱氨酸含量的变化与许多严重的疾病如心脏病、败血症、类风湿关节炎、HIV、艾滋病、帕金森病、阿尔茨海默病等都相关[1]。人尿中半胱氨酸浓度过高是肾脏吸收半胱氨酸障碍的重要标志，可作为肾结石和胱氨酸尿症等肾脏疾病的指标[2]。半胱氨酸含量的快速、准确检测对人体生理健康和生理活动分析有重要意义。

检测人尿液中半胱氨酸含量的方法有高效液相色谱法、电化学法、荧光法等。Zhang等[3]用高效液相色谱法测定生物体液中的半胱氨酸的含量。采用含氟表面活性剂包覆的金纳米颗粒作柱后比色试剂，用3-(2-羧基乙基)膦还原柱来还原胱氨酸和同型胱氨酸，在优化条件下测定了人尿液和血浆样品中的半胱氨酸。Zhao等[4]用铂电极上半胱氨酸的电催化氧化和不可逆偶联的流式注射双安培法，提出了一种新型的电化学方法检测人尿中的半胱氨酸。Xavier等[5]利用氮掺杂碳纳米点（NCNDs）为基础，构建了一种半胱氨酸荧光传感器。Hg2+对NCNDS的荧光有淬灭作用，半胱氨酸存在情况下，半胱氨酸与Hg2+竞争结合，使荧光信号处于开启状态，建立了一种测定人尿中半胱氨酸的荧光分析方法。但是，上述方法存在一定的缺点，例如需要昂贵的仪器、技术门槛较高、耗费时间较长等。因此开发一种简单、快速、不需要大型仪器的检测半胱氨酸的方法很有研究意义。

纳米金比色法因具有简单、快速、无需大型仪器等优点而备受关注。纳米金制备简单、稳定，有很强的表面等离子体共振性质。化学还原法制备的纳米金表面带负电荷，在分散状态溶液为酒红色，在520 nm处有典型的紫外-可见吸收，纳米金还经常通过Au-S键、Au-N键等被修饰，当目标物加入，通过螯合、氢键等作用使功能化的纳米金颗粒间的距离被拉近，纳米金团聚，溶液颜色变为蓝色或者紫色，纳米金在600～700 nm产生新的吸收峰，这就是基于团聚原理的纳米金比色法。Zhang等[6]合成果胶酶（pectinase）保护的纳米金P@Au NPs，建立了一种检测半胱氨酸的比色传感器。P@Au NPs溶液为酒红色，当加入半胱氨酸后，溶液的颜色逐渐由酒红变为蓝，随着P@Au NPs的聚集，吸收带从523 nm转移到650 nm，该方法用于人尿中半胱氨酸的检测。Chang等[7]利用碘包覆的纳米金建立了一种检测L-Cys的比色传感器。碘封端的纳米金具有良好的类过氧化物酶活性并可直接将3,3',5,5'-四甲基联苯胺（TMB）氧化。当溶液中有半胱氨酸时，可通过Au-S键与纳米金结合，抑制纳米金的催化活性，导致氧化的TMB减少。基于此构建了检测半胱氨酸比色传感器可用于人尿中半胱氨酸的检测。纳米金比色法已经成功的用于人尿中半胱氨酸的检测。

半胱氨酸是一种含硫氨基酸，可以与金属离子进行特异性的螯合[8]。根据这种金属离子-氨基酸的螯合现象，本文利用抗坏血酸（ascorbic acid,AA）还原氯金酸制备纳米金，溶液为酒红色，在520 nm有紫外-可见吸收峰，Co2+与半胱氨酸特异性螯合，诱导纳米金的团聚，在725 nm处产生新的吸收峰，据此建立了一种基于团聚原理的测定半胱氨酸的纳米金比色法，该方法成功用于人尿中半胱氨酸的检测。

1、实验

1.1试剂和仪器

试剂：氯金酸，西安天茂化工有限公司；抗坏血酸，济南行健生物科技有限公司；硝酸钴，天津市博迪化工有限公司；半胱氨酸，济南铭信化工有限公司；硼酸，济南裕诺化工有限公司；磷酸，山东贝塔化工有限公司；乙酸，河北佰润达化工有限公司；氢氧化钠，河北庆兴化工有限公司。所用试剂均为分析纯，实验用水，信阳学院自制去离子水。

仪器：电子分析天平，FA2004，天津天马衡基；p H计，PHS-3E，河北慧采；磁力加热搅拌器，79-1，青岛聚创环保；紫外-可见分光光度计，TU-1901，北京普析通用。

1.2纳米金的制备

所有玻璃仪器均用王水浸泡24小时，用去离子水洗净，滤纸擦干备用。采用抗坏血酸还原氯金酸制备抗坏血酸稳定的纳米金[9]。在烧杯中加入50m L去离子水，煮沸之后，开启搅拌按钮，快速加入1 m L 1%HAu Cl4溶液，继续加热并进行搅拌2 min，将1 m L 0.1 mol/L的抗坏血酸溶液立即加入到氯金酸溶液中，继续加热搅拌30 min，然后移去热源搅拌至室温，4℃冰箱保存。同样的方法加入0.5、0.8、1.2 m L抗坏血酸制备其他三种纳米金。

Britton-Robison(B-R）缓冲溶液是由混合酸和氢氧化钠配制而成，配制浓度均为0.04 mol/L的磷酸、硼酸和醋酸。向100 m L混合液中，加入不同体积的浓度为0.2 mol/L氢氧化钠，同时在去离子水参与下，用PHS-3E型p H计进行调试，分别配成p H为3.0～8.5的缓冲溶液。

1.3半胱氨酸的测定

采用纳米金与钴离子制备成比色探针，利用团聚原理实现对半胱氨酸的检测。改变纳米金、钴离子和半胱氨酸的加入顺序，确定实验方案，通过纳米金紫外可见吸收峰的变化进行实验条件的优化，确定纳米金-钴离子比色探针反应的最佳实验条件，实现对半胱氨酸快速检测的目的。

2、结果与讨论

2.1纳米金-钴离子比色探针制备

取1 m L不同比例的抗坏血酸还原氯金酸所制备的纳米金原液，用去离子水定容至5 m L，进行紫外-可见吸收扫描，结果如图1所示，四种比例制备的纳米金在520 nm处均有纳米金的特征吸收峰出现。氯金酸与抗坏血酸质量比为1∶1761时所制得纳米金较另外三种比例制备的纳米金在520 nm处的吸光度更大，有助于半胱氨酸的测定研究，因此，选择质量比为1∶1761制备的纳米金与钴离子形成比色探针去测定半胱氨酸。

图1纳米金的紫外-可见吸收光谱图

2.2半胱氨酸的比色检测及机理分析

为了研究纳米金、Co2+溶液和半胱氨酸之间的相互作用。纳米金、1.0×10-5 mol/L Co2+标准溶液、5.0×10-7 mol/L半胱氨酸溶液均取1 m L，定容至5m L，混合孵育10 min后进行紫外-可见光谱扫描，结果如图2所示。从图2可以看出，将Co2+溶液和半胱氨酸分别与纳米金混合，纳米金的吸收峰没有显著变化。将半胱氨酸加入含有Co2+的纳米金溶液，纳米金在520 nm处的吸收峰明显降低，在725nm处产生新的吸收峰。其可能的反应机理如图3所示，Co2+与半胱氨酸的羧基和氨基的配位[10]形成特异性的螯合作用，诱导半胱氨酸的-SH与纳米金发生发生强烈的相互作用形成Au-S键[11]，两者协同作用拉近了纳米金颗粒之间的距离，使原本分散性较好的纳米金聚集到一起，溶液颜色变蓝。

图2纳米金与Co2+、半胱氨酸的紫外-可见吸收光谱图

图3纳米金-Co2+测定半胱氨酸的机理图

2.3反应时间的优化

首先探究纳米金-钴离子比色探针制备最佳反应时间的优化，取1 m L纳米金、1 m L 1.0×10-5mol/L钴离子标准溶液定容至5 m L，考察在1、3、5、7、9、10、15、20、25、30 min纳米金-钴离子比色探针的最佳反应时间。结果如图4所示。由图4可知，纳米金-钴离子比色探针反应时间为5 min时，所制备的比色探针比较稳定，紫外吸收峰没有明显的变化，5 min之后A725/A520的比值基本保持不变，25 min之后A725/A520的比值略微下降，可能是溶液中的其他因素使得纳米金团聚，因此选择5min作为最佳反应时间。

其次探究纳米金-钴离子比色探针与半胱氨酸反应的最佳时间。取1 m L纳米金、1 m L 1.0×10-5mol/L钴离子标准溶液先反应5 min，接着加入1 m L5.0×10-7 mol/L半胱氨酸用去离子水定容至5 m L，分别考察反应时间在1、3、5、7、9、10、15、20、25、30 min内的半胱氨酸对纳米金-钴离子比色探针吸收峰的影响。通过紫外-可见吸收光谱图中520和725 nm两处吸光度的变化，可以看到纳米金-钴离子比色探针测定半胱氨酸在反应时间为1～15 min时，A725/A520变化较大，当20 min以后A725/A520变化趋于稳定，选择20 min作为最佳反应时间。

图4反应时间的影响

2.4缓冲溶液p H的优化

缓冲溶液的p H会对纳米金-钴离子比色探针对半胱氨酸的测定产生一定的影响。实验选择在p H为3.0～8.5的范围内研究p H对纳米金-钴离子比色探针测定半胱氨酸的影响。取1 m L纳米金和1 m L1.0×10-5 mol/L钴离子标准溶液分别用不同p H的缓冲溶液进行定容，反应5 min，然后再加入1 m L5.0×10-7 mol/L半胱氨酸，用不同p H的缓冲溶液定容至5 m L，溶液孵育20 min后进行紫外-可见光谱扫描，检测不同p H的缓冲溶对半胱氨酸测定的影响，结果如图5所示。由图5可知，p H为3时，A725/A520最大，由此，选择p H为3的缓冲溶液。

图5 p H对纳米金-钴离子比色探针检测半胱氨酸的影响

2.4校准曲线与检出限

在反应时间为20 min、p H为3的B-R缓冲溶液中，采用纳米金-钴离子比色探针对不同浓度半胱氨酸进行测定，结果如图6所示。由图6可知，半胱氨酸在1×10-7～1×10-6 mol/L浓度范围内与A725/A520有线性关系，该实验校准曲线的回归方程为A725/A520=0.3965 C+0.0133(C，半胱氨酸溶液浓度，μM）。在95%的置信水平下，此种方法的检出限为2.2×10-8 mol/L。另外，对浓度为5×10-7 mol/L和1×10-6 mol/L的半胱氨酸平行测定11次，相对标准偏差分别为3.0%、1.44%。

图6纳米金-钴离子比色探针测定半胱氨酸的校准曲线

2.5特异性实验及干扰实验

为了考察纳米金-钴离子比色探针对半胱氨酸测定的特异性，用丙氨酸、谷氨酸、脯氨酸、酪氨酸、精氨酸、甲硫氨酸、异亮氨酸进行了特异性检验和干扰检验。实验选用1 m L纳米金加入1 m L1.0×10-5 mol/L钴离子做比色探针，在p H为3.0的情况下进行紫外-可见光谱扫描，记录A725/A520的比值，用不加氨基酸的比色探针作为空白，测定结果如图7所示。

纳米金-钴离子比色探针的特异性检验是用浓度均为5.0×10-7 mol/L的几种氨基酸，分别加入到体系为纳米金-钴离子比色探针中，在优化的实验条件下进行紫外-可见光谱扫描，记录A725/A520的比值，结果如图7a所示。从图7a可以看出，纳米金-钴离子比色探针中加入半胱氨酸时，A725/A520的比值较大，说明半胱氨酸可以与钴离子特异性结合，使得纳米金团聚，说明该探针对半胱氨酸有很好的特异性。

干扰实验选纳米金-钴离子-半胱氨酸体系，加入同浓度的丙氨酸、谷氨酸、脯氨酸、酪氨酸、精氨酸、甲硫氨酸、异亮氨酸后进行紫外-可见光谱扫描，记录A725/A520的比值，结果如图7b所示。从图7b中可以看出，在纳米金-钴离子-半胱氨酸体系中加入其它的氨基酸后，A725/A520的比值没有太大的变化，说明其他氨基酸的测在对本方法没有干扰，这主要是和金属离子与氨基酸的特异性结合有关。

图7纳米金-钴离子比色探针测定半胱氨酸的特异性及干扰

表1不同人体尿液中半胱氨酸的回收率

表2测定人尿液中半胱氨酸的不同方法的比较下

2.6样品测定

人尿液中半胱氨酸的含量肾结石和胱氨酸尿症等肾脏疾病的指标，为了验证本方法的实际应用的可行性，取两份健康人的尿液样品进行半胱氨酸含量测定。在室温下将两份尿液静置20 min稀释五倍后备用。取0.5 m L尿样中加入已知量的半胱氨酸标准溶液，按照前面所述方法进行用标准加入法测定回收率，结果如表1所示。在最优条件下测定，半胱氨酸的回收率均在92.80%～95.80%的范围内，相对标准差（RSD）低于4.0%。结果表明，基于纳米金-钴离子的传感器对实际人体尿液样本中半胱氨酸的比色检测是可靠的。进一步验证了该方法的可靠性和实用性。本方法与其他测定人尿液中半胱氨酸含量的方法进行比较，结果如表2所示，进一步证明了该方法的实用性。

3、结论

综上所述，本方法用抗坏血酸制备纳米金，通过钴离子与半胱氨酸的特异性结合，诱导纳米金团聚，使纳米金在520 nm处的吸收峰降低，在725 nm处有新的紫外可见吸收峰的出现，建立了基于团聚原理的半胱氨酸的纳米金比色方法。实验中对体系的反应时间、缓冲溶液的p H分别进行了优化，在最优的实验条件下，该方法测定半胱氨酸线性范围为1×10-7～1×10-6 mol/L，检出限为2.2×10-8 mol/L，对健康人的尿液进行加标测定实验，回收率在92.8%～95.8%之间。该方法为半胱氨酸溶液的测定提供了新思路。

参考文献:

[1]邓威森,肖国强,袁俊,等. L-半胱氨酸光学传感器研究与应用[J].化学传感器, 2022, 42(4):9-22.

基金资助:2022年度信阳学院大学生科研项目(2022-DXSLYB-009);

文章来源:徐永智,毛丽惠,刘雯雯,等.纳米金-钴离子比色探针的制备及对半胱氨酸的测定[J].广州化学,2024,49(02):73-77.