羟基磷灰石（HAP）是骨骼和牙齿中最重要的无机矿物成分，但并非所有的HAP都对人体有益。在泌尿系统，由HAP诱导形成的Randall斑块是促进肾结石形成的重要原因[1]。在Randall斑块中存在从大小由纳米到微米及不同形态的HAP[2]。草酸钙结石是一种最常见的肾结石，其形成机制尚未完全阐明[3]。HAP参与草酸钙结石的形成，以及是如何促进肾结石的形成的机制研究尚未明确。

草酸钙在肾乳头Randall斑块上的过度生长是草酸钙结石形成的潜在机制[4]。EVAN等[5]通过肾脏活检发现，Randall斑起源于髓袢基底膜，随后扩散到了肾直小管，最后到尿路上皮表面，促进草酸盐晶体的成核、生长和聚集，从而增加了肾结石形成的风险。在含钙结石或尿液中发现了许多磷酸钙盐成分，最常见的磷酸钙盐是HAP[6]。因此，HAP与肾结石之间存在密切的关系，肾小管上皮细胞的氧化炎症损伤与结石的形成密切相关[7]。YU等[8]通过将HK-2细胞与不同浓度的HAP和/或巨噬细胞共同培养，HAP增加上调了HK-2细胞中骨桥蛋白（OPN）的表达水平，并引起异质的成核、粘附和晶体沉积，从而促进了Randall斑块和肾结石的形成。RAO等[9]通过研究四种不同类型的HAP（球状、针状、棒状、盘状），结果表明HAP的细胞毒性：球状>针状>棒状>盘状，HAP的物理性质对其细胞毒性起着至关重要的作用，同时发现HAP可能激活细胞氧化应激反应，引发一系列细胞功能障碍、凋亡和坏死。本实验设计不同浓度的HAP探究其通过氧化应激反应对HK-2细胞的凋亡的影响及其机制，为泌尿系结石的机制研究作一定探讨。

1、材料与方法

1.1主要试剂

人源近端肾小管上皮细胞（HK-2细胞武汉普诺生命科技有限公司中国）、HAP（水热法合成、分散性好、棒状、60～100nm×12nm）、MEM培养基和胎牛血清（Gibco公司美国）、胰蛋白酶（Sigma公司美国）、AnnexinV-FITC/PI细胞凋亡和坏死双染料试剂盒、活细胞/死细胞染色试剂盒和DCFH-DA（上海贝博生物有限公司中国）、青霉素和链霉素、线粒体膜电位检测试剂盒（JC-1）、吖啶橙（AO）染料（碧云天生物技术公司中国）、四甲基偶氮唑蓝（MTT)、Lyso-TrackerRed和Mito-TrackerGreen、过氧化氢（H2O2）试剂盒（赛默飞世尔科技有限公司中国）、Caspase-3活性试剂盒（南京建成生物工程研究所中国）。

1.2实验方法

1.2.1HAP的合成和表征

根据文献，利用水热法合成了HAP[10]。将样品分散到无水乙醇中、超声均匀分散，滴于铜网，干燥，用透射电子显微镜（TEM）进行观察。将样品分散到无水乙醇中、超声均匀分散，滴于硅片，干燥，用扫描电子显微镜（SEM）进行观察。取适量的样品，用X-射线衍粉末射仪（XRD）对其结构进行测定。取适量的样品，用固态荧光测量仪对样品的荧光性质进行。

1.2.2细胞培养

将HK-2细胞接种到含有10%FBS,100μg/mL青霉素和100μg/mL链霉素的MEM培养基上在37℃、5%CO2培养箱中培养，胰蛋白酶消化用于细胞繁殖，细胞同步后，实验模型分组：（1）对照组：仅添加等体积PBS溶液（0μg/mL);(2)HAP处理组：将HK-2细胞暴露于5、10、20、40、80μg/mL的HAP。

含HAP的PBS悬液的制备：将一定量的HAP粉末铺板，用紫外线灭菌，过夜，然后分散在PBS溶液中，制备浓度为4mg/mL的悬浮液，并超声处理5min。

1.2.3HK-2细胞存活率和活细胞/死细胞染色检测

通过用MTT的方法测定HK-2细胞存活率[11]。将HK-2细胞（2×104）接种到96孔板上，按照上述分组分别孵育24、48、72h，分别加入10μLMTT，在37℃的条件下孵育4h，弃去上清并加入100μLDMSO，摇床震荡10min，使用酶标仪测定570nm的吸光度（OD）值。细胞活性=OD实验组/OD对照组×100%。

将HK-2细胞（1×105）接种到6孔板上，实验模型孵育24h，严格按照活死染试剂盒说明书操作，通过荧光显微镜观察，绿色为活细胞，红色为死细胞。

1.2.4HK-2细胞凋亡测定

AnnexinV-FITC/PI细胞凋亡和坏死双染料检测细胞凋亡[12]。将HK-2细胞（1×105）接种到6孔板上，实验模型分为两组：（1）对照组：仅添加PBS溶液（0μg/mL);(2)HAP处理组：将HK-2细胞暴露于10、20、40μg/mL的HAP，孵育6、24h，严格按照试剂盒的说明书步骤操作，通过流式细胞仪检测细胞凋亡情况。

1.2.5HAP在HK-2细胞内分布

分别用LysoTrackerRed或Mito-TrackerGreen追踪HAP在HK-2细胞中的细胞内分布[13]。将HK-2细胞（2×104）接种到培养皿上，用HAP(40μg/mL）处理HK-2细胞6h。用Lyso-TrackerRed和Mito-TrackerGreen分别给溶酶体和线粒体染色，用共聚焦显微镜观察HAP在细胞中的分布。

1.2.6ROS的检测

用DCFH-DA检测到细胞内ROS水平[14]。孵育6h，将细胞用200μLDCFH-DA染色，在37℃暗处孵育20min,PBS洗涤3次后，PBS重悬，通过流式细胞仪检测氧化DCFH-DA的荧光。

严格按H2O2试剂盒说明书步骤操作，使用酶标仪在415nm下测量吸光度。实验模型分组：（1）对照组：仅添加等体积PBS溶液（0μg/mL);(2)HAP处理组：将HK-2细胞暴露于5、10、20、40μg/mL的HAP。用5mmol/LN-乙酰半胱氨酸（NAC）预处理1h，使用酶标仪在570nm下测量吸光度。细胞活性=OD实验组/OD对照组×100%。

1.2.7溶酶体完整性检测

吖啶橙（AO）检测溶酶体完整性，孵育6h，用PBS制备的5μg/mL吖啶橙染料（AO）溶液染色15min，通过流式细胞仪检测通透性。

用Lyso-TrackerRed检测溶酶体通透性的改变。加入Lyso-TrackerRed和Hochest，分别孵育30min和15min。用荧光显微镜观察溶酶体的碱化。

1.2.8线粒体膜电位（ΔΨm）和Caspase-3检测

将HK-2细胞（每孔1×105个细胞）接种在6孔板中，同2.2.4实验模型分组，孵育6h，收集细胞并以1000rpm/min离心5min，吸出上清液，用PBS洗涤，再次离心获得细胞沉淀，加入500μLJC-1，在黑暗中于37℃孵育20min,PBS洗涤三次除去未反应的JC-1，并通过流式细胞仪检测分析细胞的线粒体膜电位的变化。5

将HK-2细胞（每孔1×105个细胞）接种在6孔板中，孵育6h，严格按照说明书裂解细胞，取少量细胞样品用BCA蛋白浓度定量试剂盒定量蛋白浓度以保证每组的蛋白浓度在100～200μg。Caspase-3活性测定严格按说明书操作。用酶标仪测定波长为405nm的吸光度（OD）。Caspase-3活化程度=OD样品组/OD对照组×100%。

1.3统计学方法

所有结果至少作三个独立平行实验。数据表示为均数±标准差。单因素方差分析用于多重比较，两组间比较用独立样本t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1HAP表征

通过TEM和SEM对HAP的形貌和大小进行测定。HAP为分散性良好的棒状，长度×高度：（60～100)nm×12nm（图1a、b）。利用XRD对HAP的结构进行测定，通过与标准衍射图（JCPDSNo.09-0432标准衍射图）对比，HAP与标准衍射图一致，表明合成了纯的HAP（图1c）。利用固态荧光测量仪检测HAP发蓝光（图1d）。

图1HAP表征结果

2.2HAP对的HK-2细胞存活率影响

MTT法观察不同剂量HAP处理24、48和72h对HK-2细胞生存率的影响，见图2a。0、5、10、20、40和80μg/mL的HAP处理的HK-2细胞在24、48和72h对HK-2细胞增殖均有明显的抑制作用，并呈明显的剂量依赖性。在24h,HAP在5、10μg/mL细胞存活率无明显差异，约降低17%～19%,80μg/mL细胞存活率约降低60%。本结果显示，HAP抑制HK-2细胞增殖，降低细胞生存率且引起细胞产生细胞毒性且呈浓度-时间依赖性。

活细胞/死细胞染色结果表明HK-2细胞增殖能力随浓度的增加而降低（图2b)HAP在20μg/mL后释放红色荧光的死细胞逐渐增多，释放绿色荧光的活细胞逐渐减少。HAP在5、10μg/mL活/死细胞未观察到明显差异，80μg/mL时仅观察到了少量的活细胞。活/死细胞染色结果与MTT结果基本一致。

2.3HAP引起的HK-2细胞调亡

由于80μg/mL的HAP明显的抑制HK-2细胞的增殖并导致坏死脱落。结合细胞活性和活死染结果，选择0、10、20、40μg/mL的HAP分别作用于HK-2细胞共孵育6、24h，凋亡结果表明6h细胞的存活率没有明显差异（图2c),24h凋亡结果表明细胞的凋亡和坏死率随着浓度的增加而升高（图2c、d）。

图2HK-2细胞凋亡结果

2.4HAP在HK-2细胞中的分布

见图3,HAP的蓝色荧光主要与Lyso-Tracker标记的溶酶体的红色荧光重叠，与Mito-Tracker标记的绿色荧光仅有部分局限，结果表明HAP主要分布在溶酶体。

2.5HAP诱导HK-2细胞ROS的释放

DCFH-DA荧光探针检测了HAP诱导的HK-2细胞中ROS的变化。荧光强度的定量结果表明，HK-2细胞中的ROS水平随浓度增加增加（图4a）。HK-2细胞中的H2O2水平随浓度增加增加（图4b）。正常组的细胞具有暗荧光，表明细胞内ROS水平低。HAP治疗组的绿色荧光均显着增强（图4d），表明HAP导致细胞内ROS水平升高。乙酰半胱氨酸（NAC）是一种抗氧化剂，加入NAC,HAP诱导的细胞活性较未加入NAC的细胞生存率升高（图4c），表明细胞的生存率与ROS释放有关，HAP在5、10μg/mL细胞存活率无明显差异。

图3在暴露于40μg/mL的HAP中6h后，HK-2细胞中HAP的分布

图4HK-2细胞ROS的释放

2.6HAP对HK-2细胞溶酶体膜完整性的影响

见图5a。HAP可使HK-2细胞溶酶体通透性增加，溶酶体内的大量的水解酶释放，溶酶体膜受损。Lyso-TrackerRed是一种碱性染料，溶酶体红在溶酶体内的荧光强弱可间接反应溶酶体的完整性，见图5d。HAP可使HK-2细胞溶酶体完整性受损。结果表明HAP可使HK-2细胞溶酶体完整性受损，且呈浓度依赖性。

2.7HAP对HK-2细胞线粒体功能的影响

见图5b，所示随HAP浓度的增加ΔΨm降低。HAP引起的细胞内ROS水平升高可能导致ΔΨm降低。

2.8caspase-3的释放

caspase-3是细胞凋亡的过程中的一种关键酶。见图5c，所示随HAP浓度的增加caspase-3增加。由HAP引起的细胞ΔΨm降低可能导致caspase-3激活。

3、讨论

肾结石是一种日益增长的泌尿系统疾病，约占世界人口的5%～13%[15]。目前治疗肾结石的主要方法是外科手术[16]，但患者的复发率高，5年复发率约为50%[17]。因此，了解肾结石的发病机制对结石的治疗和预防复发具有重要意义。目前国内外主要集中在草酸钙在肾结石形成机制的探究[18]，而关于HAP作为促进肾结石形成的机制的研究较少。

图5HAP对HK-2细胞线粒体功能和细胞溶酶体膜完整性的影响

近年来国内外出现了关于HAP对肾上皮细胞损伤的报道，余骏川等[19]研究了HAP对HK-2细胞的损伤作用，发现细胞存活率与HAP的浓度呈负相关且通过上调细胞内的OPN表达参与肾结石的形成。COHENA等[20]将草酸，草酸钙和HAP与犬肾细胞（MDCK）共培养，结果表明它们都引起MDCK细胞中基质Gla蛋白（MGP）表达增加，超氧化物歧化酶释放，乳酸脱氢酶释放，并促进细胞凋亡率，从而促进肾结石的形成。研究表明HAP对肾上皮细胞造成损伤，但并未对其造成损伤的机制进一步研究。有研究表明当300μg/mL的HAP会对HK-2细胞造成不可逆的损伤，造成大量细胞凋亡[21]，所以设计的最大浓度不高于200μg/mL，本研究通过MTT和活细胞/死细胞染色实验，发现HAP可以降低HK-2细胞的存活率，抑制细胞增殖，表明对HK-2细胞具有一定的损伤作用。

研究表明细胞内的氧化应激反应能引起细胞氧化炎症损伤，过量的ROS会引起氧化应激，导致正常的肾上皮细胞功能障碍、细胞凋亡甚至死亡[22]。目前主要凋亡途径包括线粒体和溶酶体途径[23],ROS是ΔΨm降低的直接原因[24]。当细胞受损时，造成大量ROS释放可引起线粒体功能障碍，包括ΔΨm下降、bcl-2的降低以及bcl-2相关bax蛋白的释放，同时线粒体通过释放细胞色素c进一步活化Caspase-9,Caspase-9又可激活下游的Caspase-3，导致细胞凋亡[25]。本研究通过流式细胞仪检测HAP可导致ΔΨm明显降低、Caspase-3水平增加，与ROS的上升趋势一致。

溶酶体膜的完整性是细胞凋亡过程中的关键因素[26]，组织蛋白酶B是一种存在于溶酶体内的凋亡介质[27]，当溶酶体膜完整性受损可导致组织蛋白酶B释放，从而导致细胞调亡。本研究通过共聚焦显微镜观察HAP主要分布在溶酶体内，溶酶体膜的通透性增加，组织蛋白酶B释放，导致细胞凋亡。

综上，本研究对不同浓度的HAP通过溶酶体-线粒体途径诱导HK-2细胞凋亡。其机制：（1)HK-2细胞内的ROS释放增加导致线粒体膜电位降低，激活caspase-3导致HK-2细胞凋亡；（2)HAP主要定位于HK-2细胞的溶酶体中导致溶酶体膜的通透性增加，凋亡因子释放（组织蛋白酶B）引起细胞凋亡；（3）值得注意的是HAP作用于HK-2细胞6h时没有引起细胞凋亡，但有大量ROS产生、线粒体膜电位降低、caspase-3水平升高等改变。表明凋亡的因素的出现早于细胞的凋亡。本研究表明HAP能明显的抑制HK-2细胞增殖，并通过溶酶体-线粒体通径介导细胞的凋亡和坏死，从增加了结石形成的风险。

参考文献：

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[12]胡颖辉,张振,雷蕾,等.糖基化终产物通过其受体激活NADPH氧化酶及其下游通路诱导L细胞的凋亡[J].实用医学杂志,2017,33(3):358-362.

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[19]余骏川,刘权,邓耀良,等.羟基磷灰石对人肾小管上皮细胞骨桥蛋白表达的影响及机制探讨[J].山东医药,2017,57(14):6-9.

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董文敬,张海松,徐玉晓,崔静,陈玉杰,王倩,葛坤,高燕,董文英.纳米羟基磷灰石通过溶酶体-线粒体通路诱导肾小管上皮细胞的凋亡机制[J].实用医学杂志,2020,36(12):1616-1622.

基金:河北省自然科学基金资助课题(编号:H2018201289)