地衣芽孢杆菌活菌制剂是一种微生态活菌制剂，具有提升人体免疫力和预防疾病等作用，近年在临床治疗中逐渐广泛应用[1]。微生态制剂产品的质量控制关键在于对该制品的安全性和有效性的评价[2]。中国药典2015年版三部微生态活菌制品总论规定微生态活菌制品必须由非致病的活细菌组成，无论在生产过程、制品贮存和使用期间均应保持稳定的活菌状态[3]。其中，地衣芽孢杆菌活菌制品芽孢数和芽孢率作为芽孢杆菌性能的重要指标，只有当芽孢数和芽孢率较高时才能发挥较好的益生效果[4]。然而，目前市场上或生产企业的一些地衣芽孢杆菌活菌制品随着保存时间的延长，其有效活菌数量严重下降；有些活菌制品在制成制剂的过程中，受到来自药品中其他粉体原料的摩擦和挤压，造成菌体破裂导致死亡[5]。传统检测地衣芽孢杆菌活菌制剂的方法有平板计数法和孔雀绿染色法。前者操作繁琐，检测周期长，严重滞后于生产过程；后者染色困难，只能检测芽孢率，不能计数芽孢数量。随着微生物快检技术的发展，也出现了如流式细胞术等快速检测方法。但因仪器成本较高，专业性较强，目前该方法使用率并不高。因此，研究地衣芽孢杆菌活菌制剂芽孢数的快速检测且简单易行方法非常必要。

2,6-吡啶二羧酸(dipicolinic acid,DPA)是在芽孢杆菌的营养体中不存在，当芽孢杆菌处于芽孢状态时才产生的一种特异成分，占芽孢干重的5%～10%[6]，因此可以通过检测芽孢中的DPA来验证芽孢体的存在。韩雪等[7]对脱脂乳进行处理，采用紫外光度法测得DPA的A值，建立芽孢数与DPA的关系，根据回归方程只能半定量预测出脱脂乳中芽孢数量。本研究采用HPLC，建立地衣芽孢杆菌活菌制剂中DPA的定量检测方法，同时用传统的平板计数法对相应的芽孢悬液中芽孢数量进行统计，建立DPA浓度与芽孢数之间的关系曲线，以期通过测定样品中DPA含量，间接定量测定地衣芽孢杆菌活菌制剂的芽孢数。

1、材料与方法

1.1仪器

MLS-3780高压蒸汽灭菌器(三洋工业株式会社)；KB240低温生化培养箱(BINDER公司)；Seven Easy酸度计(梅特勒-托利多公司)；BS223S电子天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司)；DK-S24电热恒温水浴锅(上海精宏实验设备公司)；IS-RDD3台式恒温振荡器(美国精骐有限公司)；Z206A离心机(德国HERm LE公司)；LA2-4A1生物安全柜(新加坡艺思高科技有限公司)；Agilent1260高效液相色谱仪(Agilent公司)；Waters e2695高效液相色谱仪(Waters公司)。

1.2材料

地衣芽孢杆菌活菌菌粉(批号：20160912，含量2.7×1010 CFU·g-1)、地衣芽孢杆菌活菌胶囊(批号：201607106,201608128,201603019；规格：每粒0.25 g)、地衣芽孢杆菌活菌片(批号：20140501,20140502,20140503；规格：每片0.5 g)、地衣芽孢杆菌活菌颗粒(批号：20131102,20131104,20131106；规格：每袋0.5 g)，均由浙江京新药业股份有限公司提供。营养琼脂培养基(青岛高科园海博生物技术有限公司，批号：20161115)，经培养基适用性检查，结果符合规定；氯化钠(国药公司，批号：20140818);DPA对照品(ALDRICH公司，批号：BCBP3374V；纯度：99%)；二硫苏糖醇(dithiothreitol,DTT)(Roche Diagnostic公司，批号：70503525)；氢氧化钠(兰溪市华盛化工有限公司，批号：050615)；十二烷基硫酸钠(SDS，香港迪韻科技有限公司，批号：110826);DTT溶液[7]：称取氢氧化钠、氯化钠、SDS、DTT适量，置同一量瓶，加水溶解并稀释，最终各成分浓度分别为100 mmol·L-1氢氧化钠、100 mmol·L-1氯化钠、10 g·L-1 SDS和100 nmol·L-1 DTT。

1.3方法

1.3.1HPLC检测DPA含量

1.3.1. 1色谱条件与系统适用性试验

用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，柱温为30℃，0.1%磷酸-甲醇(92∶8)为流动相，检测波长为273 nm，流速为0.8 m L·min-1。

1.3.1. 2对照品溶液的制备

精密称取DPA对照品40.00 mg，用水溶解并定容至200 m L，制成质量浓度为200 mg·L-1的母液，在4℃下贮存；取母液分别用水稀释，配制质量浓度为80,40,20,10,5,2.5 mg·L-1的对照品溶液。

1.3.1. 3供试品溶液的制备

无菌称取地衣芽孢杆菌活菌菌粉(批号：20160912)3.0 g，加入0.9%无菌氯化钠稀释液27.0 m L，添加无菌玻璃珠置摇床上振摇30 min，充分混匀，制成1∶10溶液。经80℃水浴加热处理30 min后，迅速冷却，制成芽孢悬液[8]。取上述芽孢悬液1 m L，平行2份，经高压蒸气灭菌器121℃灭菌15 min后取出，分别加入DTT溶液0.5 m L，置65℃水浴30 min，加1 mol·L-1盐酸4滴，加水定容至10 m L。滤过，即得。

1.3.1. 4(1)线性关系考察：

取“1.3.1.2”项下DPA对照品溶液，质量浓度分别为2.5,5,10,20,40,80 mg·L-1，按“1.3.1.1”项下色谱条件进样，测定色谱峰面积，以DPA浓度C为横坐标(X)，峰面积A为纵坐标(Y)，绘制标准曲线。(2)稳定性试验：精密吸取“1.3.1.3”项下供试品溶液20L，分别在0,2,4,8,12,16,20,24 h依次进样，测得其峰面积。(3)仪器精密度试验：精密吸取“1.3.1.3”项下供试品溶液20μL，连续进样6次，测定色谱峰面积。(4)重复性试验：取同一批样品(批号：20160912)6份，按“1.3.1.3”项下方法制备供试品溶液，依法测定。(5)加样回收试验：取已知含量的地衣芽孢杆菌活菌菌粉样品(批号：20160912，含量为41.4 mg·L-1)9份，每份3.0 g，精密称定，加入0.9%无菌氯化钠稀释液27.0 m L，置于涡旋振荡器充分混匀，制成1∶10供试液。取供试液，80℃水浴30 min，得芽孢悬液。分别取芽孢悬液0.6,0.5,0.4 m L，再分别精密加入40 mg·L-1 DPA对照品溶液0.4,0.5,0.6 m L，经高压蒸气灭菌器121℃灭菌15 min后取出，分别加入DTT 0.5 m L，置65℃水浴30 min，加1 mol·L-1盐酸4滴，加水定容至10 m L。滤过，分别精密吸取20L，按“1.3.1.1”项下色谱条件，测得峰面积

1.3.2平板计数法测定芽孢数

取“1.3.1.3”项下芽孢悬液，采用10倍梯度稀释法制成适宜稀释度的供试液。取上述适宜稀释度的供试液100μL，涂布于营养琼脂平板，平行涂布3个平板，37℃倒置培养18～24 h后计数。

1.3.3建立芽孢数与DPA浓度的关系

取“1.3.1.3”项下芽孢悬液(芽孢浓度2.6×1010 CFU·m L-1)0.25,0.5,1,2,3 m L各2份，经高压蒸气灭菌器121℃灭菌15 min后取出，分别加入DTT 0.5 m L，置65℃水浴30 min，加1 mol·L-1盐酸4滴，加水定容至10 m L。滤过，依法测定，以芽孢浓度(108 CFU·m L-1)为横坐标(X),DPA浓度(mg·L-1)为纵坐标(Y)，绘制标准曲线。

1.3.4样品测定

取3种活菌制剂共10批，分别依法测定。

2、结果

2.1对照品及样品溶液的HPLC图谱

取DPA对照品溶液、地衣芽孢杆菌活菌菌粉及制剂溶液分别进样，HPLC图谱见图1。

2.2测定波长的选择

取DPA对照品溶液，在190～400 nm扫描，结果在272.6 nm处有最大吸收，故确定检测波长为273 nm。

2.3线性关系考察

以DPA浓度C为横坐标(X)，峰面积A为纵坐标(Y)，绘制标准曲线，得回归方程Y=57.98X-84.79,r=0.999，结果表明DPA在2.5～80 mg·L-1内呈良好的线性关系。

图1 5种溶液的HPLC色谱图

2.4稳定性试验

在0,2,4,8,12,16,20,24 h进样的峰面积RSD为0.4%(n=8)，结果表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.5仪器精密度试验

供试品溶液峰面积RSD为0.2%(n=6)，表明仪器精密度良好。

2.6重复性试验

供试品溶液DPA浓度平均值为34.52 mg·L-1,RSD为0.9%(n=6)，结果表明本方法重复性良好。

2.7加样回收试验

平均回收率为102.3%,RSD为4.6%(n=9)，结果表明本方法回收率符合要求。结果见表1。

2.8建立芽孢数与DPA浓度的关系

以芽孢浓度(108 CFU·m L-1)为横坐标(X),DPA浓度(mg·L-1)为纵坐标(Y)，绘制标准曲线，得回归方程Y=1.01X+0.34,r=0.993，结果表明DPA浓度在7～77 mg·L-1，芽孢最终浓度在6.5×108～7.8×109 CFU·m L-1内，呈良好的线性关系。结果见表2。

表1平均回收率测定结果

表2 DPA浓度及相应芽孢数检测结果

2.9样品测定

取3种活菌制剂共10批，分别依法测定，结果见表3。将表3中地衣芽孢杆菌胶囊剂、片剂和颗粒剂3种剂型的lg(HPLC计算法)和lg(平板计数法)分别采用t检验进行统计学分析。结果显示，HPLC计算法和平板计数法对地衣芽孢杆菌胶囊剂、片剂和颗粒剂3种剂型进行芽孢数计数的结果均无显著性差异。以上结果表明，对该企业生产的地衣芽孢杆菌胶囊剂、片剂和颗粒剂的芽孢数均可以采用HPLC和平板计数法，2种方法的检测结果无显著性差异。

3、讨论

因DPA显酸性，笔者选择常用的0.1%磷酸与甲醇作为流动相，考虑到保留时间、分离度等，流动相比例为92∶8。p H值选择：范围2.5～3.5时，响应值较2.0大。考虑到保留时间、峰型，笔者选用p H 3.0作为最终条件。

陈文莹等[4]对地衣芽孢杆菌BL-5芽孢生成条件进行研究时发现，营养体(无芽孢菌体)的致死温度为75～80℃，并且在75℃和80℃条件下的致死率并无显著差别，芽孢体致死温度>80℃。此外，光学显微镜和电子显微镜下观察发现，由营养体形成成熟的芽孢需经历7个阶段[9]，前4个阶段的芽孢不耐热，直到后3个阶段的芽孢才具有耐热性，故>80℃水浴加热处理后，一些不耐热芽孢被杀死，最终芽孢计数结果急剧下降[10]。中国农业行业标准(NY/T 1331-2007)[11]——乳与乳制品中嗜冷菌、需氧芽孢及嗜热需氧芽孢数的测定标准中，采用80℃水浴处理10 min后，进行需氧芽孢计数。林陈强等[9]研究发现，80℃水浴处理对地衣芽孢杆菌营养体具有良好的杀灭作用，80℃水浴处理15 min后，经活体染色实验验证，CHB6营养体死亡率近100%。本课题根据平板计数和FCM计数结果的分析，结合前期镜检结果，为保证试验结果的准确性和稳定性，采用80℃水浴处理30 min作为营养体灭活的时间，也即芽孢数计数的处理条件[8]。

DPA可以通过高压或者在酸性条件下加热的方法从芽孢中提取。Warth等[12]在100℃，20 mmol·L-1的HCl中加热10 min，梭菌中可以完全提取DPA。Wang等[13]在15 psi 121℃处理30 min的条件下提取DPA。郭小华等[14]采用高温高压灭菌法，分别采用不同时间进行处理，即100℃15 min、100℃30 min、121℃5 min、121℃10 min、121℃20 min、121℃40 min，经过结果对比，最终采用灭菌锅中121℃处理5 min的参数，在此参数下样品中的DPA即可完全释放，处理强度进一步增加体系荧光强度保持不变。为了保证DPA提取充分，笔者根据本课题组前期研究，采用高压蒸气灭菌器121℃灭菌15 min，并加入DTT溶液[7]0.5 m L，置65℃水浴30 min的方法，促使芽孢释放DPA。DTT与SDS共同作用，一方面可去除芽衣，大大降低芽孢对其他化学物质的抗性；另一方面它作为一种变性剂，可以减少样品沉淀对DPA释放的干扰。向DTT溶液处理过的样品中加入HCl，它可促使DPA完全释放到HCl溶液中[7]。笔者曾试用同时加溶菌酶的方法[15]，结果影响不大，因此最终试验并未采用加溶菌酶的方法。

表3 3种活菌制剂中的芽孢数测定结果

平板计数法是传统的微生物计数方法，但因操作繁琐、对操作人员检验水平要求较高，且操作周期较长，一般为3～5 d，严重滞后于生产过程，不能实时监测制剂中芽孢数和活菌数，为活菌制剂质量控制提供依据，因此限制了其在活菌制剂生产过程中的应用。HPLC因其灵敏度高、分离效率高、自动化程度高、分离速度快等优点，已经被广泛应用于药品检验领域[16]。本课题样品处理过程简单，耗时短，在生产过程中可即时检测芽孢数，方便快捷，且研究发现HPLC与平板计数法同时检测3种地衣芽孢杆菌活菌制剂(片剂、胶囊剂和颗粒剂)的芽孢数，结果无显著性差异。说明在一定条件下，HPLC法有希望代替平板计数法，成为微生态活菌制剂质量控制的新手段。

参考文献：

[1]段勇.微生态制剂在儿科消化性疾病治疗的应用分析[J].临床医药文献电子杂志, 2018, 5(78):24.

[2]袁佩娜.微生态制剂的质量控制要求[J].中国微生态学杂志, 2002, 14(4):187-188.

[3]中国药典.三部[S]. 2015:44.

[5]林俊,段智勇,罗正.中国益生菌类产品的质量控制现状[J].饲料工业, 2013, 34(19):21-23.

[10]潘梦垚,王凯英,王阳.细菌芽孢理化性质和耐热机制研究[J].科协论坛(下半月), 2012(4):102-103.

[11]NY/T 1331-2007乳与乳制品中嗜冷菌､需氧芽孢及嗜热需氧芽孢数的测定[S]. 2007.

[14]郭小华,杨菁菁,姜琦,等.一种快速定量测定芽孢浓度的方法:中国, 106442453 A[P]. 2017-02-22.

[16]白杨,王娟,祁警平.分析高效液相色谱法在药品检验中的应用和效果[J].全科口腔医学电子杂志, 2019, 33:139-142.

董芳华,王银环,李珏,李永泉.地衣芽孢杆菌活菌制剂芽孢数的快速检测方法研究[J].中国现代应用药学,2020,37(11):1333-1337.

基金:浙江省药品接触材料质量控制研究重点实验室(2014E10006)