慢性肾衰竭（Chronic renal failure,CRF）是在多种慢性肾脏病（Chronic kidney disease,CKD）的前提下，逐渐出现慢性肾功能减退直至完全破坏的一种临床综合征，主要表现为水电解质紊乱、代谢产物潴留、酸碱平衡失调以及氮质血症和全身各系统的失衡[1]，是各种肾脏疾病进行性发展的最终结果[2]。慢性进行性肾损害和各种肾脏疾病并发症均可加速CRF病程的进展，而Klotho蛋白与CRF病程进展的关系十分密切[3,4]。Klotho蛋白是一种单向跨膜蛋白和多功能蛋白，其通过膜结合Klotho和可溶性Klotho共同作用，可以减轻和修复肾损伤[5]，但其作用机制还有待进一步研究。

复肾功方（Fushengong decoction,FSGD）是著名中医学家、首届国医大师郭子光教授经过临床60余年总结出的经验方，具有补肾、活血、降浊之功，对于慢性肾功能不全的代偿期、失代偿期（Ⅰ、Ⅱ期）疗效明显[6]。前期实验研究表明，复肾功方可明显改善CRF大鼠肾功能[7]，具有保护肾组织[8]、抑制肾间质纤维化[9]、抗炎[10]等作用。为进一步探讨复肾功方治疗CRF的作用靶点及机制，本研究拟探讨复肾功方对CRF大鼠肾组织Klotho蛋白及mRNA表达的影响，从减轻及其修复肾损伤角度阐释复肾功方延缓CRF进展的作用机制。

1、材料与方法

1.1动物

雄性SD大鼠55只，SPF级，8周龄，体质量（200±20)g，由重庆医科大学实验动物中心提供，动物生产许可证号：SCXK（渝）2018-0003。

1.2药物及试剂

复肾功方由黄芪、水蛭、苍术、黄柏、丹皮、茯苓、车前子、牛膝、生地、山药、山茱萸、杜仲等组成，药材均购自重庆桐君阁大药房股份有限公司，经重庆医科大学中医药学院黄学宽教授鉴定合格后，按照常规中药煎服法浓缩为含生药1.0 g·mL-1的水煎剂[8]。0.5%腺嘌呤饲料购自江苏南通特洛菲饲料公司。兔抗Klotho抗体（批号：10j3131）、兔抗β-actin抗体（批号：82b7184），均购自美国Affinity公司；山羊抗兔二抗（批号：BST13G02A54）、免疫组化试剂盒（批号：13J24K11J1020），均购自武汉博士德公司；Trizol（批号：AHF1819A）、PrimeScript RT reagent Kit（逆转录试剂盒，批号：AI40832A）、荧光定量试剂盒（批号：AI62522A），均购自日本TaKaRa公司；血清肌酐（SCr）试剂盒（批号：20180306）、尿素氮（BUN）试剂盒（批号：20180309），均购自南京建成生物工程研究所有限公司。

1.3主要仪器

BX53型荧光倒置显微镜，日本Olympus公司；ICEN-24R型离心机，杭州奥盛仪器有限公司；ODYSSEY®FC化学发光仪，美国LI-COR公司；NanoDrop 2000型超微量分光光度计，美国赛默飞世尔科技有限公司；CFX ConnectTMOpticsModule实时荧光定量PCR仪，美国BIO-RAD公司。

1.4分组、模型复制及给药

SD大鼠适应性喂养1周后，将其随机分为正常组、模型组及复肾功方低、中、高剂量组，每组11只。正常组给予常规饲养，其他4组大鼠则用腺嘌呤含量为0.5%的饲料建立CRF模型，连续喂养21 d。模型复制结束后，随机抽取4只模型大鼠和1只正常大鼠进行血液生化指标及组织病理形态学检测，以考察模型复制是否成功。模型复制成功后，所有大鼠改用常规饲料饲养。复肾功方低、中、高剂量组大鼠按照体质量分别以含生药4、8、16 g·kg-1复肾功方水煎剂灌胃给药，正常组及模型组给予同体积生理盐水，给药体积20 mL·kg-1·d-1，每日1次，连续灌胃给药30 d。

1.5标本采集

大鼠在末次给药后，禁食不禁水12 h，以20%乌拉坦5 mL·kg-1麻醉，心脏采血3～5 m L；静置1～2 h，以4 000 r·min-1离心10 min，分离出血清，4℃冰箱保存，待测。颈椎脱臼处死大鼠，打开腹腔，分离出肾脏，PBS冲洗肾脏后用滤纸吸去多余水分，去除肾脏筋膜；沿窄面正中线纵切后得到2份肾脏组织，1份用4%多聚甲醛固定，用于石蜡包埋；另1份用液氮速冻后，转移至-80℃冰箱保存备用。

1.6生化指标检测

取大鼠血清，严格按照试剂盒说明书方法操作，检测各组大鼠血清SCr、BUN含量。

1.7肾脏组织病理形态学观察

取固定、包埋的肾脏组织，切成厚度为4μm的切片，脱蜡，水化，行HE染色，在光学显微镜下观察肾脏组织病理形态学变化。

1.8大鼠肾脏组织Klotho蛋白表达的检测

1.8.1免疫组化法检测

取肾脏组织切片，55℃烤干30 min；放入二甲苯中常规脱蜡，在梯度乙醇中水化；用H2O2灭活，取枸橼酸进行抗原修复，BSA封闭；滴加一抗（1∶200),4℃冰箱过夜；二抗孵育后冲洗切片，滴加SABC，镜下观察DAB显色后再用苏木素复染；随后用10%醋酸酒精分化，1%氨水返蓝；然后经脱水、烘干、透明，用中性树脂封片后镜检。每组随机选取10张切片，每张切片随机选取3个×400部位采集图像；采用Image-Pro Plus6.0软件分析图像的平均光密度值（IOD），计算蛋白表达量。

1.8.2 Western Blot法检测

取适量肾脏组织，匀浆后，以4℃、12 000 r·min-1离心15 min；采用BCA法测定上清液的总蛋白浓度；上样量为50μg，按比例加入蛋白上样缓冲液、超纯水及样品；混匀后，以4℃、1 000 r·min-1离心1 min;95℃金属浴煮蛋白10 min；再次以4℃、1 000 r·min-1离心3 min后，置于-20℃冰箱备用。配胶，10μL上样，8%的凝胶电泳，恒流300 m A转膜100 min,5%脱脂牛奶封闭2 h；加入Klotho抗体（1∶1 000）、β-actin抗体（1∶3 000）中，4℃孵育16 h过夜；37℃下二抗（1∶3 000）孵育1 h，洗膜3次；ECL显影、扫描。采用Image J软件测定并计算目的蛋白与内参β-actin灰度值比值，作为目的蛋白的相对表达量。

1.9 Real-time PCR法检测肾脏Klotho mRNA的表达

采用TaKaRa Trizol试剂提取肾脏组织总RNA，检测RNA纯度和含量。严格按TaKaRa逆转录试剂盒说明书步骤进行逆转录，反应条件为：37℃15 min,85℃5 s,4℃保持。逆转录后进行RealTime PCR检测，反应体系10μL，反应条件：预变性95℃30 s；变性95℃5 s，退火60℃30 s（收集荧光），39个循环；65℃5 s,95℃0.05 s熔解；END。实验重复3次，参考文献[13]方法计算mRNA相对表达量。引物由南京金斯瑞生物有限公司合成，引物序列见表1。

表1 PCR引物序列

1.1 0统计学处理方法

采用SPSS20.0统计软件进行数据分析；计量资料以均数±标准差表示；多组间比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA），两两比较采用LSD检验；以P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1复肾功方对CRF大鼠血清SCr、BUN含量的影响

结果见表2。与正常组比较，模型组大鼠血清SCr、BUN含量均显著升高，差异均具有统计学意义（P<0.01）。与模型组比较，复肾功方各剂量组大鼠血清SCr、BUN含量明显降低，差异均具有统计学意义（P<0.05,P<0.01）。结果表明，复肾功方能降低CRF大鼠血清SCr、BUN的含量。

表2复肾功方对CRF大鼠血清SCr、BUN含量的影响

2.2复肾功方对CRF大鼠肾脏组织病理形态学的影响

结果见图1。HE染色结果显示，正常组大鼠的肾小球肾小管结构完整清晰。与正常组比较，模型组大鼠肾脏组织病理形态学改变明显，肾小球数量减少，囊腔扩大，系膜细胞及基质增生明显，肾小管出现萎缩或扩大，出现大量炎性粒细胞及中性粒细胞浸润，上皮细胞见空泡样病变，管腔有腺嘌呤结晶沉积堵塞。与模型组比较，复肾功方各剂量组大鼠的肾脏组织病理损伤明显减轻，球囊缩小，系膜细胞及基质增生明显减少，肾小管炎性细胞减少，肾小管结构损伤明显减轻。结果表明，CRF模型组大鼠肾脏组织损伤明显，而复肾功方能减轻和修复CRF大鼠的肾损伤。

图1复肾功方对CRF大鼠肾脏组织病理形态学的影响（HE染色，×400)

2.3复肾功方对CRF大鼠肾脏组织Klotho蛋白表达的影响

2.3.1免疫组化法检测

结果见图2。正常组大鼠肾小管可见Klotho蛋白高表达；与正常组比较，模型组大鼠肾小管的Klotho蛋白表达明显减少，平均光密度值明显降低（P<0.01）；与模型组比较，复肾功方各剂量组大鼠的肾小管中Klotho蛋白表达均有不同程度增加，平均光密度值明显升高（P<0.05）。结果表明，复肾功方能够促进CRF大鼠肾小管Klotho蛋白的表达，减轻和修复肾损伤。

图2复肾功方对CRF大鼠肾脏组织Klotho蛋白表达的影响（免疫组化，×400;,n=10)

2.3.2 Western Blot法检测

结果见图3。与正常组比较，模型组大鼠肾脏组织的Klotho蛋白表达显著降低（P<0.01）；与模型组比较，复肾功方各剂量组大鼠肾脏组织的Klotho蛋白表达均明显增加（P<0.05）。结果表明，复肾功方能够促进CRF大鼠肾脏组织Klotho蛋白的表达。

2.4复肾功方对CRF大鼠肾脏组织Klotho mRNA表达的影响

结果见表3。与正常组比较，模型组大鼠肾脏组织的Klotho mRNA表达明显减少（P<0.01）；与模型组比较，复肾功方各剂量组大鼠肾脏组织的Klotho mRNA表达均明显升高（P<0.05）。结果表明，复肾功方能够促进CRF大鼠肾脏组织Klotho mRNA的表达。

图3复肾功方对CRF大鼠肾脏组织Klotho蛋白表达的影响

表3复肾功方对CRF大鼠肾脏组织Klotho mRNA表达的影响

3、讨论

慢性肾衰竭（Chronic renal failure,CRF）仍是目前医学研究的难题，终末期肾病（ESRD）主要采用透析[11]和肾移植[12]进行治疗，给患者造成沉重的经济负担[13]。故早期及时诊治以恢复肾功能，避免出现终末期肾衰竭，是CRF临床研究的重点。CRF属中医“水肿”“溺毒”“癃闭”“关格”“虚劳”等疾病范畴。现代药理研究[14]表明，复肾功方中黄芪具有提高免疫力和改善肾功能等作用；水蛭则有抗纤维化、抗炎、改善肾功能及抗肾小球硬化等作用；苍术有抗炎、降血糖等作用；黄柏有抗炎、抗氧化等作用；丹皮有抗炎、提高免疫力等作用；茯苓可保护肾脏功能，具有利尿活性及治疗CRF的作用；车前子有抗氧化、利尿、消炎和调节免疫等作用；牛膝能抗氧化、抗凝血和增强肾脏蛋白质的合成；生地黄可抑制炎症和增强肾功能；山药、山茱萸、杜仲则可抗氧化、抗炎、抗衰老及调节免疫功能。全方合用，共奏补肾活血降浊之功，发挥抗炎、抗纤维化，减轻和修复肾组织损伤，保护肾功能，以延缓CRF进展等作用[6,7,8,9,10]。

日本学者Kuro-o等[15]于1997年发现了Klotho基因，其主要存在于肾脏及脑组织中。Klotho蛋白是一种多功能蛋白质，分为膜结合、可溶性以及分泌型蛋白[16]。有研究[17,18]表明，膜结合型Klotho在肾组织中呈高度表达，可激活特异性成纤维细胞生长因子23(FGF23）这一信号途径。FGF23通过FGF23-FGFR-膜Klotho途径，促使Klotho蛋白表达上调，进一步减轻慢性肾脏病（CKD）及减少其并发症，例如继发甲状旁腺功能亢进（SHPT）等的发生，这与FGF23/Klotho轴发挥着近乎相似的作用[19]。可溶性Klotho蛋白属于分泌型功能蛋白，是膜结合蛋白受α-分泌酶A解聚素和含金属蛋白酶结构域的蛋白10(ADAM10）、17(ADAM17）与β-分泌酶即β-APP裂解酶1(BACE1）作用的切割产物，因结合位点和作用受体尚不明确，其功能还需进一步研究[20]，但其在细胞保护、抗纤维化和血管生成等方面有着重要作用[21]。有研究证实，Klotho蛋白可以加速肾单位再生[22]，可通过抑制肾素-血管紧张素系统（RAS）而发挥其保护肾脏的作用，并可减轻肾组织损伤[23]。还可通过抑制Wnt/β链蛋白信号通路的转导，改善肾纤维化及对CKD肾损伤的修复[24]。可见，Klotho蛋白表达的升高有减轻及修复肾损伤，保护肾脏的作用，从而延缓CRF的进展[25]。

本研究通过血清生化指标检测、肾脏组织病理形态学观察、免疫组化、免疫印迹和Real-time PCR等不同方法检测复肾功方对CRF大鼠肾功能和肾组织病理形态学的影响。结果表明，复肾功方各剂量组能不同程度减轻CRF大鼠有关的病理改变，并能不同程度地提高Klotho蛋白及mRNA的表达。而提高肾脏Klotho蛋白及mRNA的表达对于减轻及修复肾损伤，治疗和延缓CFR进展都有着重要作用，可作为治疗CRF的一个关键靶点进行深入研究。复肾功方在Klotho蛋白参与减轻及修复肾损伤、延缓CRF进展中的多途径作用方式，以及与其他信号通路交互作用的复杂机制有待进一步研究。

参考文献：

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[7]万磊,黄学宽,王玲,等.复肾功方对慢性肾功能衰竭大鼠肾功能及Shh信号通路的影响[J].中医杂志,2015,56(20):1771-1774.

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[14]梅全喜.简明实用中药药理手册[M].北京:人民卫生出版社,2010.

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张洋,黄学宽,沈清,童潘,徐珂,罗洪玉.复肾功方对慢性肾衰竭大鼠Klotho蛋白及mRNA表达的影响[J].中药新药与临床药理,2020,31(04):380-385.

基金:重庆市卫生和计划生育委员会､重庆市科学技术委员会联合资助项目(ZY201802148);重庆市技术创新与应用发展专项面上项目(cstc2019jscx-msxmX0119)