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角质形成细胞增殖、凋亡、迁移受冬凌草甲素的影响研究

2020-07-24 527 上传者：管理员

摘要：目的研究冬凌草甲素(oridonin)对人永生化角质形成细胞株(HaCaT cells)增殖、凋亡和迁移的影响,并分析其机制。方法分别用0、10、20和40μmol/L的冬凌草甲素处理HaCaT细胞,在不同时间用MTT法检测冬凌草甲素对HaCaT细胞增殖的抑制作用;用流式细胞仪检测冬凌草甲素对HaCaT细胞凋亡的影响;用Transwell实验检测冬凌草甲素对HaCaT细胞迁移能力的影响;用ELISA实验检测冬凌草甲素对HaCaT细胞分泌肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素6(IL-6)水平的影响。结果冬凌草甲素对HaCaT细胞的增殖有明显的抑制作用,且抑制率与浓度和时间呈正相关;经冬凌草甲素干预后的HaCaT细胞凋亡率升高,迁移减慢;冬凌草甲素作用于HaCaT细胞后TNF-α、IL-6表达水平下降。结论冬凌草甲素能抑制角质形成细胞的增殖、迁移,促进凋亡,并且可以抑制角质形成细胞TNF-α、IL-6的分泌,可能成为治疗银屑病的潜在药物。

关键词：
冬凌草甲素
凋亡
增殖
角质形成细胞
迁移
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冬凌草甲素(oridonin)是从冬凌草中提取出来的一种四环二萜类的天然有机化合物,近年来大量的研究表明它可以诱导多种细胞凋亡、抑制增殖和迁移,从而达到抗肿瘤的作用,同时它还具有抗炎、抗微生物等多种药理和生理作用[1]。银屑病中角质形成细胞过度增殖和肿瘤细胞类似,其中角质形成细胞过度增殖、异常凋亡和定向迁移过快在银屑病的发病机制中极其重要[2]。本文主要通过观察冬凌草甲素对HaCaT(人永生化角质形成细胞)细胞的增殖、凋亡、迁移的影响及其对角质形成细胞分泌的炎症因子TNF-α、IL-6的变化,为银屑病开发新的治疗药物提供依据。

1、材料与方法

1.1材料及主要试剂

HaCaT细胞、结晶紫染液均购自上海歌凡生物技术公司;冬凌草甲素购自美国TargetMol公司;DMEM完全培养基、PBS缓冲液和胰蛋白酶溶液均购自Gibco公司;Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒购自七海生物;MTT溶液购自Sigma公司;Transwell板购自美国Corning公司;人肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白介素-6(IL-6)、ELISA检测试剂盒均购自Abcam。

1.2细胞培养

在37℃、5%CO2条件下将HaCaT细胞培养于含10%胎牛血清的完全培养基中,细胞密度达到90%且状态良好即可传代准备做实验。

1.3 MTT检测细胞活性

调整细胞密度为1×104/mL,以每孔200μL接种于96孔板中,分别加入10、20、40μmol/L的冬凌草甲素同时设空白对照,每组6个复孔,分别培养于6、12、24 h后各孔中加入5 mg/mL MTT 20μL,继续培养4 h,吸出上清,每孔中加入150μL DMSO,摇床震荡15 min,充分溶解结晶,用酶联免疫测试仪测定570 nm的每孔细胞A值。以上实验重复4次,求出其平均值。细胞抑制率=(1-实验组A值/对照组A值)×100%。

1.4流式检测凋亡

用0、10、20、40μmol/L的冬凌草甲素处理培养细胞24 h,把细胞培养液吸出并收集,PBS洗涤贴壁细胞1次,用胰酶细胞消化液消化细胞。将刚收集的培养液混合,1 000 g离心5 min,弃上清,收集细胞,用PBS洗3次后,加入195μL Annexin V-FITC结合液轻轻重悬细胞,加入5μL Annexin V-FITC,轻轻混匀,室温(25℃)避光孵育10 min。取200 g细胞悬液离心5 min,弃上清,加入190μL Annexin V-FITC结合液重悬细胞。加入10μL PI染色液,轻轻混匀,冰浴避光放置,1 h内进行流式细胞仪检测。

1.5 Transwell检测细胞的迁移

用胰酶消化细胞,终止消化后离心弃去培养液,用PBS洗2遍,用含BSA的无血清培养基重悬。调整细胞密度至5×105/mL。取细胞悬液100μL加入Transwell小室,24孔板下室加入600μL含20%FBS的培养基,培养6 h后添加不同的药物浓度到上室里,并做好标记,培养24 h后取出Transwell小室,弃去孔中培养液,用无钙的PBS洗2遍,甲醇固定30 min,将小室适当风干。用0.1%结晶紫染色20 min,用棉签轻轻擦掉上层未迁移细胞,用PBS洗3遍,400倍显微镜下随机5个视野观察细胞,记数。

1.6检测细胞因子

按照ELISA试剂盒说明检测分别用0、10、20、40μmol/L冬凌草甲素处理24 h后的HaCaT细胞培养上清液中TNF-α和IL-6。

1.7统计学分析

采用SPSS22.0对以上实验结果进行统计学分析,计量资料采用x¯±s表示,不同浓度组间比较采用单因素方差分析,两两多重比较采用LSD-t检验,不同浓度和时间比较采用重复测量数据的两因素多水平分析,P<0.05为差异具有统计学意义。

2、结果

2.1冬凌草甲素对角质形成细胞增殖的影响

通过MTT检测冬凌草甲素对角质形成细胞增殖的影响,结果表明不同浓度冬凌草甲素对HaCaT细胞的抑制率差异有统计学意义(F=103.21,P<0.05),不同时间的抑制率差异有统计学意义(F=9.12,P<0.05),药物浓度与时间具有交互作用(F=8.04,P<0.05),即冬凌草甲素可以抑制HaCaT细胞的增殖,且抑制率与浓度和时间呈依赖性,见表1。

2.2冬凌草甲素对角质形成细胞凋亡的影响

采用Annexin-V/PI双染检测不同浓度的冬凌草甲素对HaCaT细胞作用24 h的凋亡率(图1),结果显示0、10、20、40μmol/L冬凌草甲素的凋亡率分别为(0.06SymbolqB@0.03)%,(9.13SymbolqB@0.45)%,(18.61SymbolqB@0.99)%,(25.14SymbolqB@0.61)%,组间差异有明显的统计学意义(F=988.8,P<0.01),两两多重组间比较差异均具有统计学意义(P<0.01),表明冬凌草甲素通过诱导细胞凋亡来抑制细胞的增殖,且凋亡率与药物浓度呈依赖性,见图1。

表1不同浓度冬凌草甲素对HaCaT细胞增殖的影响

2.3冬凌草甲素对角质形成细胞迁移的影响

0、10、20、40μmol/L冬凌草甲素处理HaCaT细胞24 h后通过小室的细胞数为(320.00SymbolqB@151.00)、(221.00SymbolqB@55.05)、(144.00SymbolqB@62.03)、(113.80SymbolqB@33.22),不同浓度冬凌草甲素对通过小室的细胞数有影响,差异有统计学意义(F=5.49,P<0.01),两两多重组间比较发现20、40μmol/L组与0μmol/L组相比通过的细胞数目显著减少,差异有统计学意义(P<0.05),其余各组差异均无统计学意义(P>0.05),表明冬凌草甲素能够抑制角质形成细胞的迁移,但与浓度无关(图2)。

2.4冬凌草甲素对角质形成细胞分泌细胞因子的影响

图1不同浓度冬凌草甲素对Ha Ca T细胞凋亡的影响

不同浓度冬凌草甲素对TNF-α的降低有影响(F=29.50,P<0.01),两两多重比较20、40μmol/L冬凌草甲素均能显著降低TNF-α的分泌(P均<0.05),10μmol/L组与0μmol/L组间差异无统计学意义(P>0.05),其余各组组间差异均有统计学意义(P<0.05)。不同浓度冬凌草甲素对IL-6的表达水平有影响(F=27.00,P<0.01),两两多重比较显示除10、20μmol/L,20、40μmol/L组间差异无统计学意义(P>0.05),余各浓度差异均具有统计学意义(P<0.05),表2。

表2冬凌草甲素对HaCaT细胞分泌的细胞因子的影响

3、讨论

银屑病俗称“牛皮癣”,是一种常见的慢性、免疫性、炎症性皮肤疾病,被WHO列为“世界十大顽症之一”,其发病机制涉及遗传、免疫、环境和生活方式等。但确切的机制仍有待阐明[3],不同的触发因素,如创伤、感染、药物和压力均可以激活皮肤的免疫炎症反应,导致角质形成细胞的过度增殖[4]。银屑病患病率呈逐年递增趋势,世界范围的银屑病发病率约为3%[5],显著影响患者生活质量并且具有发生潜在的全身性并发症的可能[6,7],它给患者带来了巨大的生理和精神痛苦,长期的治疗也给社会和个人带来了沉重的经济负担和药物副作用,因此对银屑病的防治是我国乃至全球医学领域亟待解决的重大课题之一。

在表皮中,超过90%的细胞是角质形成细胞,它的异常增殖、分化、凋亡、迁移是银屑病的主要病理特点,而目前大多数药物如地蒽酚,维生素D3衍生物和甲氨蝶呤等都是通过抑制角质形成细胞增殖和调节角质形成细胞分化从而达到缓解症状的目的[8]。冬凌草在中医中也被称为“东灵草”,是我国的特色中草药,其主要活性成分为冬凌草甲素,常用于治疗胃痛、喉痛、咳嗽、牙周炎和肿瘤,具有抗氧化、抗肿瘤、抗血管生成和抗炎作用,近来已被用作膳食补充剂[9,10,11,12]。

图2冬凌草甲素对Ha Ca T细胞迁移的影响

Seunghee等[13]发现,冬凌草甲素能增加H2O2诱导的体外培养HaCaT细胞的细胞活力、抑制凋亡。在该研究中笔者以体外培养的HaCaT细胞作为对象进行观察冬凌草甲素对角质形成细胞增殖、凋亡和迁移的作用,通过MTT笔者发现冬凌草甲素可以抑制HaCaT细胞的增殖,并且抑制率与冬凌草甲素的浓度和作用时间呈依赖性。进一步通过流式细胞检测了冬凌草甲素对HaCaT细胞凋亡的影响,结果显示冬凌草甲素可以促进HaCaT细胞凋亡且与浓度呈依赖性,这提示冬凌草甲素可能通过促进HaCaT细胞凋亡来实现它抑制增殖的作用。银屑病的角质形成细胞迁移过快,导致表皮通过时间缩短,因此笔者检测了冬凌草甲素对HaCaT细胞迁移的影响,结果发现其可以抑制角质形成细胞的迁移,该结论与冬凌草甲素通过调节非肌球蛋白IIA抑制细胞迁移保持一致[14]。

TNF-α和IL-6在银屑病中属于两种关键性的细胞因子,均与银屑病的炎症程度呈正相关。TNF-α是由单核巨噬细胞分泌,它对角质形成细胞增殖活化有重要的作用,同时它还能够刺激多种其它细胞因子产生,加重炎症反应。IL-6主要由单核细胞、巨噬细胞等多种细胞分泌,且能刺激体外培养的角质形成细胞增生,参与了很多自身免疫性角质形成细胞增生性疾病的病理生理过程。Zhao等[15]发现冬凌草甲素能够降低急性肺损伤小鼠模型血清中的TNF-α和IL-6。本研究发现冬凌草甲素能抑制HaCaT细胞分泌的TNF-α和IL-6,提示冬凌草甲素能够抑制角质形成细胞的炎症反应。

虽然大多数常规药物可以减轻银屑病的症状,但是目前这种疾病还没有已知的治愈方法。此外,许多药物引起的副作用,例如皮肤萎缩、器官毒性、免疫抑制、感染和致癌作用等影响了这些常规药物的长期使用。因此,有必要寻找既高效又副作用小的新的治疗银屑病的药物,本研究结果表明冬凌草甲素对角质形成细胞具有良好的抗增殖、促凋亡、抑制迁移、抑制炎症因子表达的作用,初步为今后研究新的治疗银屑病药物奠定了实验室基础。

王美霞,郑瑞.冬凌草甲素对角质形成细胞增殖､凋亡､迁移的影响[J].中国皮肤性病学杂志,2020,34(07):754-758.

基金:山西省重点研发计划社会发展方面(201803D3110)