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针灸改善DDP化疗致肾脏损伤模型小鼠的作用机制

2024-07-10 8 上传者：管理员

摘要：目的从肾脏炎症反应角度探讨针灸改善顺铂(DDP)化疗致小鼠肾脏损伤的机制和保护作用。方法 40只SPF级雄性KM小鼠，随机分为4组，每组10只。空白组采用0.9%NaCl溶液腹腔注射，余下3组注射同等剂量10 mg/kg的DDP溶液，24 h后模型复制成功。针刺组选用0.18 mm×13 mm毫针直刺3 mm,留针6 min。艾灸组选用0.4 cm×12 cm细艾条垂直穴位上2 cm悬灸6 min,穴位均选用“大椎”“肝俞”(双穴)“肾俞”(双穴)“足三里”(双穴),其余两组仅陪同固定，1次/d,连续5 d。禁食1 d后取材，酶联免疫吸附试验(ELISA)检测各组血清尿素氮(BUN)和血肌酐(Scr)含量，免疫荧光法观察髓样分化因子(MyD)88、IκB激酶(IKK)α、NOD样受体蛋白(NLRP)3表达，Western印迹和RT-聚合酶链反应(PCR)法检测MyD88、IKKα、NLRP3蛋白和mRNA表达。结果与空白组比较，模型组血清BUN、Scr含量明显升高，肾组织中MyD88、IKKα、NLRP3蛋白和mRNA表达明显升高(P<0.05),荧光表达均增强。与模型组比较，针刺组和艾灸组血清BUN、Scr含量明显降低，肾组织中MyD88、IKKα、NLRP3蛋白和mRNA表达明显降低(P<0.05),荧光表达均减弱。结论针灸可能通过下调MyD88、IKKα及NLRP3表达水平，减轻模型小鼠肾脏损伤，改善肾功能，对化疗所致肾脏损伤有明显的增效保护作用。

关键词：
NOD样受体蛋白(NLRP)3
肾损伤
针灸
顺铂
髓样分化因子(MyD)88
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顺铂(DDP)是临床治疗恶性肿瘤使用广泛且疗效显著的化疗药物之一，但其毒副作用明显，主要体现在肾毒性、消化道毒性、骨髓抑制、肝毒性、神经毒性等方面[1]。其中肾毒性较为常见，其机制涉及细胞毒性、氧化应激、炎性反应、自噬、凋亡等方面，炎性反应是肾毒性最重要的机制之一[2]。DDP能激活肾上皮细胞中Toll样受体(TLR)4介导的炎性反应，导致炎症产生，引起肾脏损伤[3]。髓样分化因子(MyD)88、IκB激酶(IKK)α均是TLR4介导的炎性反应中启动信号通路的重要蛋白，NOD样受体蛋白(NLRP)3作为炎性信号通路的下游蛋白被活化后，促使炎症因子的释放，对肾脏组织造成损伤[4]。目前抑制IκK/IκB/核因子(NF)-κB通路的激活可被视为肾损伤治疗的靶点[5],IKKα是组成IκK复合物的重要成分之一，NF-κB以二聚体的形式与抑制因子IκB结合在一起而呈现无活性的状态。DDP肾损伤后炎性通路启动，MyD88被活化，激活IκK复合物，启动NF-κB通路进而激活NLRP3释放炎性因子。课题组前期已初步阐明针灸在改善肝肾损伤、减轻胃肠道反应和提高机体免疫功能等方面具有独特优势[6,7,8,9],本研究旨在从不同层次阐释针灸改善DDP小鼠肾脏损伤的作用机制及针灸是否能通过干预MyD88、IKKα及NLRP3蛋白表达起到改善肾脏损伤的作用，为临床针灸改善肾脏损伤的腧穴处方提供实验依据。

1、材料与方法

1.1 实验动物及分组

40只5周龄SPF级KM雄性小鼠，体质量(30±2)g, 购自济南朋悦实验动物繁育有限公司，动物合格证号为SCXK(鲁)20190003。适应性喂养于河南中医药大学实验动物中心[温度23～27 ℃,相对湿度(50±2)%,光照12 h],自由饮水饮食3 d后按小鼠体质量随机分为4组(空白组、模型组、针刺组、艾灸组),每组10只。严格遵守《关于善待实验动物的指导性意见》,通过河南中医药大学实验动物伦理审查(编号：DWLL2018030013)。

1.2 试剂与仪器

主要试剂：注射用DDP(AA1A10078)购自齐鲁制药有限公司；肌酐(Scr)试剂盒(C011-2-1)、尿素氮(BUN)试剂盒(C013-2-1)购自南京建成；十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)凝胶制备试剂盒购自西安晶彩生物科技有限公司；二喹啉甲酸(BCA)蛋白浓度测定试剂盒购自南京Vazyme公司；MyD88山羊多克隆抗体(ab28763)、IKKα兔多克隆抗体(ab32041)、NLRP3兔单克隆抗体(ab263899)购自英国Abcam公司；MyD88、IKKα、NLRP3二抗购自郑州乐睿生物科技有限公司；MyD88兔单克隆抗体(ab133739)、IKKα兔单克隆抗体(ab32041)购自英国Abcam公司，NLRP3兔多克隆抗体(PA1665)购自美国BosterBio公司；免疫荧光抗体二抗购自正能生物(550037、550042);RNA提取试剂(QP020)、反转录试剂(QP056)、荧光定量试剂(QP031)购自美国GeneCopoeia公司。主要仪器：细艾灸条(规格0.4 cm×12 cm)购自临湘市湖香艾生物有限公司细、毫针(规格0.18 mm×13 mm)购自北京中研太和医疗器械有限公司；酶标仪、电泳系统、离心机、NanoDrop® 8000分光光度计购自美国Thermo Fisher公司；7900HT Fast Real-Time聚合酶链反应(PCR)System、凝胶成像仪购自美国ABI公司；普通PCR仪购自日本TaKaRa公司；台式高速冷冻离心机购自湖南湘仪离心机有限公司。

1.3 模型制备

DDP诱导肾损伤小鼠模型的安全剂量为10～15 mg/kg[10],课题组前期研究以10 mg/kg的剂量成功制备DDP肾损伤的小鼠模型[11],故选用10 mg/kg DDP腹腔注射诱导肾损伤小鼠模型(24 h后模型制备完成),同时段予空白组腹腔注射0.01 ml/g 0.9%NaCl溶液，模型制备完成后每组随机选取3只做病理切片，以验证模型成功。

1.4 干预方法

空白组、模型组陪同固定不干预；针刺组、艾灸组分别行针刺、艾灸干预。根据《实验针灸学》教材定位取穴[12],选大椎、肝俞(双穴)、肾俞(双穴)、足三里(双穴)。针刺组进针3 mm, 留针6 min; 艾灸组悬灸6 min(艾灸的高度高于穴位2 cm)。均1次/d, 连续5 d。

1.5 组织取材

治疗结束后每组取眼球血后静置2 h, 3 500 r/min, 离心10 min, 分离血清，-20 ℃冰箱保存备检。采血后小鼠脱臼处死，迅速剖腹，干冰上取出左侧肾脏组织，剔除结缔组织，清洗后三等分，两份浸入超低温液氮冻淬后转移至-80 ℃冰箱保存备检，另一份置于4%多聚甲醛中固定、脱水、透明、浸蜡、包埋备检。

1.6 BUN和Scr的检测

按照试剂盒说明测定BUN和Scr含量。

1.7 Western印迹检测肾脏组织中MyD88、IKKα、NLRP3蛋白相对表达水平

取适量冻存的肾组织，加入裂解液后超声粉碎机粉碎，4 ℃过夜，次日4 ℃,13 000 r/min离心30 min取其上清，测定蛋白浓度(BCA蛋白浓度测定法)。加入10%SDS-PAGE上样，电泳采用90 V跑浓缩胶，110 V跑分离胶，转膜后采用5%脱脂奶粉封闭2 h, Tris盐酸缓冲液吐温(TBST)清洗后根据说明书加入稀释一抗(1∶1 000)4 ℃摇床孵育过夜。TBST洗膜3次，每次15 min, 后加入稀释二抗(1∶5 000),室温孵育2 h。室温用TBST洗膜3次，使用电化学发光(ECL)显影，以β-actin为内参蛋白，以目标蛋白与内参的比值作为目标蛋白相对表达量。

1.8 RT-PCR检测MyD88、IKKα、NLRP3mRNA相对表达量

取冻存肾脏组织液氮研磨，加入离心管中采用Trizol试剂提取RNA,采用分光光度计测定RNA浓度。取1 μg RNA经反转录试剂转录为cDNA,RT-PCR采用SYBR Green 染料法，反应总体积为20 μl。反应条件：95 ℃ 10 min(1个循环),95 ℃ 10 s(40个循环),60 ℃ 20 s(40个循环),72 ℃ 15 s(40个循环)。采用 2-ΔΔCt法进行半定量分析，引物序列由郑州乐睿生物科技有限公司提供，引物序列：MyD88上游ACCGTGAGGATATACTGA,下游GTTC-TGCTGCTTACCTAA;IKKα上游GCCTTGCTCATTCCTTAG,下游ATTCACAGATACCACTCAGA;NLRP3上游CTTGAAGAAGAGTGGATG,下游CCTTGATAGAGTAGAACCT;β-actin上游ATCTTCCGCCTTAATACT,下游GCCTTCATACATCAAGTT。

1.9 免疫荧光检测

石蜡切片放入二甲苯Ⅰ和Ⅱ各15 min, 置于无水乙醇Ⅰ和无水乙醇Ⅱ各5 min, 脱蜡后切片经85%、75%酒精5 min, 蒸馏冲洗；切片置于乙二胺四乙酸(EDTA)抗原修复缓冲液中微波炉抗原修复，自然冷却后置于脱色摇床洗涤3次，每次5 min; 画圈血清封闭，滴加牛血清白蛋白(BSA)于湿盒内4 ℃孵育过夜；加入磷酸盐缓冲液(PBS)按一定比例配好的一抗，湿盒4 ℃孵育过夜；脱色摇床上洗涤3次，滴加与一抗相应种属的二抗，避光室温孵育50 min; 切片洗涤后甩干滴加4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染液，避光室温孵育10 min; 洗涤后加入自发荧光淬灭剂5 min, 流水冲洗10 min, 甩干后封片；切片于荧光显微镜下观察并采集图像。

1.10 统计学分析

采用SPSS25.0软件进行单因素方差分析，用Levene法进行方差齐性检验，若方差齐，两两比较采用LSD法；若方差不齐，两两比较采用Tamhane法。

2、结果

2.1 各组肾脏组织中MyD88、IKKα、NLRP3mRNA及蛋白相对表达比较

与空白组比较，模型组肾脏组织MyD88、IKKα、NLRP3 mRNA及蛋白相对表达均明显升高(P<0.05);与模型组比较，针刺组和艾灸组肾脏组织以上指标均明显降低(P<0.05);针刺组和艾灸组肾脏组织以上指标差异无统计学意义(P>0.05)。见图1、表1。

2.2 针灸对DDP小鼠血清BUN和Scr含量的影响

与空白组比较，模型组血清BUN和Scr含量均明显升高(P<0.05);与模型组比较，针刺组、艾灸组血清BUN和Scr含量均明显降低(P<0.05)。见表1。

图1 各组肾脏组织中MyD88、IKKα、NLRP3 蛋白相对表达

表1 各组血清Scr、BUN含量、肾脏组织MyD88、IKKα、NLRP3 mRNA及蛋白相对表达比较

图2 各组肾脏组织中MyD88、IKKα、NLRP3表达(免疫荧光，×400)

3、讨论

DDP对肿瘤细胞有强大的杀伤作用，同样对正常组织和器官也有损害，DDP药毒会聚集在肾脏近端小管，引起炎性反应，加重肾功能下降，促进肾小管损伤标志物的表达和组织学上的损伤[13]。基于化疗后肾损伤临床症状表现为乏力倦怠，纳差，腰痛等，药邪损伤脏腑，引起机体正气亏虚，根据其病因病机，可归结为“虚劳”“腰痛”等范畴，基于课题组前期的大量动物试验和临床研究，以肾虚为基本病机，兼有血瘀。以“扶正”为基本治疗原则，凝练出“扶正固肾”穴组，即：“大椎、肝俞、肾俞、足三里”。大椎穴隶属督脉，为诸阳之会，能振奋阳气，提升身体正气；肝俞具有疏肝理气，养血藏精的功效；肾俞具有强腰固肾、益气温阳之功；肝俞与肾俞配伍，体现了“肝肾同源”“精血同源”,肾水滋养肝木，使精血得调；足三里为足阳明胃经合穴，能将后天之本运化的精气输布全身，提升身体正气，主治一切虚劳羸瘦。诸穴同用，共奏扶正固本，疏肝益肾，温阳补气之力。

炎症反应是DDP诱导肾脏损伤的发病机制之一，炎性细胞渗透肾脏组织，对肾脏造成损伤[14,15]。DDP可直接导致药物在近端小管中积聚产生炎性损伤，已证实炎性因子可加剧损伤[16],Scr、BUN反映肾小球滤过功能的损害程度。TLRs是一个受体家族，其功能是促进炎性因子的释放，MyD88是TLR下游炎症信号通路的典型接头蛋白，其信号途径有MyD88依赖性和非依赖性两种[17]。MyD88依赖性途径如下，当TLR与相应配体结合后发生二聚化，此时Toll的TIR结构域与MyD88羟基发生作用，将信号传递细胞核内，并通过下游衔接蛋白分子激活IκB激酶复合物，IκB激酶复合物发生磷酸化降解，进而启动失活的NF-κB转录程序，促使炎症因子释放[18]。IKKα是IκB激酶其中的一个催化亚基，也是组成IκB激酶复合物的主要成分之一[19]。NF-κB能启动NLRP3表达，NLRP3启动后会诱导大量细胞因子如白细胞介素(IL)-1β、IL-18、肿瘤坏死因子(TNF)-α等释放[20]。MyD88/IKKα/NF-κB通路主要参与了NLRP3的启动环节[21],TLRs被激活后启动MyD88依赖性途径，并激活IKKα等复合物，IKKα等复合物能解除NF-κB与IκB结合的无活性状态，激活NF-κB信号通路进而启动NLRP3炎症小体的活性，释放出大量细胞因子，最终导致炎症发生。MyD88作为TLRs重要接头蛋白之一，负责将细胞外信号传递到细胞内，IκK/IκB/NF-κB信号通路的活性也是致炎因子表达的关键，IKKα等复合物起着非常重要的作用，作为炎性小体的NLRP3被激活后标志着炎性通路激活。本研究结果提示，DDP所致肾损伤与MyD88、IKKα、NLRP3蛋白在炎性通路表达有关，针灸可能通过下调MyD88、IKKα、NLRP3蛋白表达减轻炎性反应，进而恢复肾功能，改善肾脏损伤。针刺与艾灸的作用无显著差异，但从趋势上可以看出艾灸效果略优于针刺。

综上，针刺和艾灸均能通过调节MyD88、IKKα、NLRP3蛋白表达对DDP肾脏损伤小鼠起到改善作用。而针灸改善肾脏损伤的机制应该是多方面的，有待于进一步基础研究和临床应用加以例证。

参考文献:

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基金资助:国家自然科学基金青年基金(No.81804196); 河南省重点研发与推广专项(科技攻关)(No.222102310720); 河南省高等学校青年骨干教师培养计划(2019GGJS108); 河南省省级科技研发计划联合基金(优势学科培育类)(222301420077); 河南省中医药科学研究专项课题(2022ZY2041);

文章来源:范世东,张欢欢,于冬冬,等.针灸改善DDP化疗致肾脏损伤模型小鼠的作用机制[J].中国老年学杂志,2024,44(13):3178-3182.