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CD44差异表达在胶质母细胞瘤中的生物信息学分析及细胞验证

2024-05-31 17 上传者：管理员

摘要：目的探究CD44差异表达在胶质母细胞瘤(GBM)中的临床意义以及相关通路的富集并以胶质母细胞瘤细胞系U87进行实验验证。方法通过差异表达和Cox分析确定泛癌转录组中肿瘤患者与健康人的CD44表达是否具有差异以及风险比(HR);比较GBM患者CD44高、低表达组的免疫浸润及干细胞相关评分，并进一步分析各免疫细胞亚群是否具有差异及其与CD44的相关性；对GBM患者CD44高、低表达组差异表达的基因进行通路富集；通过构建、包装慢病毒和运用电转核糖核蛋白复合体的方法在U87细胞中过表达(OE)、敲低(KD)以及敲除(KO)CD44;对U87和U87 CD44 OE细胞进行CD44的免疫荧光染色；敲低CD44对U87细胞的活力与凋亡进行检测，敲除CD44对U87细胞的迁移与侵袭能力进行检测。结果 CD44在GBM中表达较高与健康人差异明显(P<0.05),且HR>1。高表达CD44的GBM患者具有较高的基质细胞与免疫浸润评分以及较低的细胞干性，CD44高、低表达的GBM患者的树突状细胞、CD4+记忆T细胞和调节性T细胞具有明显差异，且与CD44表达呈正相关(P<0.05)。CD44高、低表达的GBM患者的差异基因富集在与细胞迁移与凋亡的相关通路(P<0.05)。U87细胞实验表明，CD44正常情况定位在细胞膜，但CD44 OE后会在细胞质中发生蓄积。CD44 KD会导致细胞活力下降，细胞发生凋亡，CD44KO的细胞迁移与侵袭能力也会下降(P<0.05)。结论 CD44表达降低可以促进U87细胞活力降低、凋亡比例升高，侵袭与迁移能力下降，可能是影响GBM患者预后的相关因素。

关键词：
CD44
泛癌
生物信息学
细胞功能
胶质母细胞瘤
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中枢神经系统肿瘤是14岁以下儿童最常见的肿瘤，而胶质母细胞瘤(glioblastoma, GBM)占所有恶性中枢神经系统肿瘤的49%,因其具有极高侵袭性，中位生存期仅为15个月[1]。大多数患者在GBM的发展过程中死亡，目前，临床一线治疗主要以手术切除，辅助放、化疗为主[2]。因此，亟需开发新型的分子、免疫疗法以辅助GBM患者获得更长的生存期。

CD44是一种表达在细胞膜上的非激酶单次跨膜糖蛋白，属于软骨连接蛋白家族[3,4]。CD44的主要配体是透明质酸(hyaluronan, HA),HA是细胞外基质的主要成分，由基质细胞表达[5]。肿瘤发生会导致HA的代谢发生改变，使HA的分子量与结构发生变化[6]。CD44可以通过与肿瘤细胞分泌的低分子量HA结合，激活Ras, PI3K和MAPK通路，进而调控肿瘤干细胞(cancer stem cells, CSCs)表面标志物的表达，促进肿瘤细胞发生上皮-间充质转化，导致肿瘤的转移与免疫逃避[7,8,9,10]。

根据研究表明，CD44在乳腺癌、胰腺癌、结肠癌等与肿瘤发生、发展及预后高度相关[11,12,13],但其在GBM中的研究尚少，其表达量对免疫细胞浸润以及肿瘤细胞功能的影响也不明确。实体瘤的通路激活，免疫浸润与细胞功能与患者预后以及药物开发紧密相关，因此研究CD44在GBM的高、低表达对其影响将对GBM临床治疗具有启示意义。本研究利用转录组数据对泛癌的CD44先进行差异表达及Cox分析，而后具体在GBM中对其免疫水平进一步探究，最后在细胞水平探究了CD44敲低与敲除对细胞活力、凋亡、侵袭与迁移的影响。

1、材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞系：

胶质母细胞瘤细胞系U87、人胚胎肾细胞系HEK 293T(中国医学科学院基础医学研究所细胞资源中心)。

1.1.2 试剂：

Anti-CD44抗体、Anti-β-actin抗体、HRP标记山羊抗兔二抗、HRP标记山羊抗鼠二抗(Proteintech公司);驴抗兔594 nm荧光二抗、Dapi染色液(Invitrogen公司);Fast Ligase酶、Infusion Cloning HD 试剂盒、T4 PNK(New England Biolabs公司);DH5a菌、Transetta菌(北京全式金生物技术有限公司);pLVX-EF1a-IRES-Puro、PLKO.1-BFP(Addgene公司);100 ku超滤管(Merck公司);真核电转试剂盒(Lonza公司);jetPRIME转染试剂(Polyplus公司);质粒提取试剂盒(北京天根生物科技有限公司);SYBR Green(Bio-Rad公司);胎牛血清、DMEM培养基、青霉素-链霉素混合液(Gibco公司);免疫染色封闭液、免疫染色通透液、免疫染色一抗稀释液、免疫染色二抗稀释液、BCA试剂、结晶紫染液(碧云天生物科技有限公司);细胞凋亡检测试剂盒(BD BioBioscience公司);细胞活力检测试剂盒(Promege公司);10 cm细胞培养皿、6孔细胞培养皿、transwell细胞培养板(Corning公司)。

1.1.3 生物信息数据收集：

泛癌转录组及生存数据收集于TCGA数据库,使用R 4.3.2进行分析。

1.2 方法

1.2.1 泛癌转录组分析：

使用limma包对肿瘤患者与健康人进行泛癌转录组的差异分析；应用survival包对泛癌转录组进行CD44的Cox分析，并用forestplot进行可视化。

1.2.2 免疫浸润与干性分析：

应用estimate包对CD44高、低表达的GBM患者的肿瘤基质与免疫成分进行估算；应用CIBERSORT函数对CD44高、低表达GBM患者进行免疫浸润细胞比例的估算；应用synapser包获取干细胞模型数据，利用gelnet包构造模型，对CD44高、低表达的GBM患者进行DNA与RNA的干细胞评分估算。

1.2.3 差异表达分析：

应用limma包对CD44高、低表达的两组GBM患者进行差异表达分析，取adj.P<0.05,logFoldChange>1的基因，再应用clusterProfiler包进行通路富集；应用survminer包对CD44高、低表达的GBM患者进行Kaplan-Meier生存曲线分析。

1.2.4 CD44免疫染色：

将载玻片以75%乙醇浸泡消毒15 min, PBS清洗后，置入6孔板。再将U87细胞以4×104个/孔的密度接种，隔天弃去培养基，以4%多聚甲醛固定。PBS清洗后，进行通透，再次清洗后室温下封闭30 min, 最后以一抗稀释液1∶500稀释CD44抗体，4 ℃过夜孵育。第2天PBS清洗后，以1∶1 000稀释驴抗兔594 nm荧光二抗，室温孵育1 h后，PBS清洗，将DAPI 1∶5 000以蒸馏水稀释，室温孵育5 min, 经蒸馏水清洗后封片。

1.2.5 CD44过表达，敲低与敲除验证：

通过NCBI获取CD44的转录本(NM_001001391.2),无缝克隆入pLVX-EF1a-IRES-Puro载体。通过Merck官网设计shRNA,经过退火和磷酸化连接到PLKO.1-BFP载体。接种1×106个/孔293T细胞于10 cm细胞培养皿，贴壁后用jetPRIME试剂转染10 μg(PLKO.1-CD44sh/pLVX-EF1a-CD44-mCherry-IRES-Puro∶psPAX2∶pMD2G=10∶7∶3)质粒，6 h换液，2 d后收获慢病毒，100 ku超滤管，4 ℃,5 000×g浓缩慢病毒。

将U87细胞以5×104个/孔的浓度接种于24孔板接种慢病毒，1∶1 000加入polybrene试剂。2 d后，经流式分选出蓝色荧光蛋白阳性的细胞或使用puromycin 以1∶5 000加入培养基以获得稳转细胞株，而后应用qPCR检测敲低(knock down, KD)效率或Western blot验证过表达(over-expression, OE)效果。

利用Benchling官网(https: //www.benchling. com/)在CD44的第2个外显子上设计并合成3条sgRNA。而后将100 pmol的Cas9蛋白与120 pmol的sgRNA混合溶于10 μL Cas9 buffer(20 mmol/L HEPES,150 mmol/L KCl, 1 mmol/L MgCl2,10% glycerol, 1 mmol/L TCEP),室温孵育10 min。而后将2×105个U87细胞以20 μL Lonza solution重悬，两者混合后用真核细胞电转仪，选择E0-115程序进行电转。而后将其转移进预热的培养基1 000 rpm离心5 min, 分单克隆进行培养后，以Western blot鉴定敲除(knockout, KO)效果。

1.2.6 荧光素检测实验：

24孔板接种2×104 个/孔U87 野生型(wild type, WT)细胞并加入CD44 KD病毒，48 h后加入细胞活力检测试剂，吹打细胞后，转移到96孔，用微孔板化学发光检测仪检测荧光素化学发光强度。

1.2.7 流式细胞术测定实验：

24孔板接种2×104个/孔U87 WT细胞，将CD44 KD病毒以及对照(srcamble)病毒感染细胞，6 h换液，48 h后收取上清并消化细胞，500×g离心5 min, 染色7-AAD和annexin V,调补偿后进行上机流式细胞仪。

1.2.8 细胞划痕实验：

6孔板接种4×105 个/孔U87 WT和U87 CD44 KO细胞，贴壁长满后，进行划痕处理，0 h, 6 h, 10 h后，对划痕面积进行统计。

1.2.9 Transwell侵袭实验：

2×104 个/孔U87 WT和CD44 KO细胞以100 μL DMEM无血清培养基重悬接种与24孔transwell小室，下室放入500 μL DMEM完全培养基，12 h后，以4%多聚甲醛固定15 min, 擦去上层未迁移的细胞。最后用结晶紫染色液染色30 min, 随机选取4个位置，统计细胞个数。

1.3 统计学分析

实验统计均在Prism 9中以t-test完成检验，实验数据用平均值±标准差表示，以P<0.05认为差异具有统计学意义。

2、结果

2.1 泛癌转录组显示CD44作为风险基因在GBM高表达，且是表达差异最显著的癌种

泛癌(pancancers)分析是指跨多种癌症类型或者亚型的整合分析，其中的各种癌症类型称之为癌种[14]。泛癌分析结果显示， CD44在31个癌种中的表达显著升高，按表达量由高到低依次为眼部黑色素瘤(UVM)、头颈部鳞状细胞癌(HNSC)、皮肤黑色素瘤(SKCM)、急性髓性白血病(LAML)、肺鳞状细胞癌(LUSC)、胶质母细胞瘤(GBM)、食管癌(ESCA)、甲状腺癌(THCA)、宫颈鳞癌和腺癌(CESC)、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBC)、胰腺癌(PAAD)、结肠癌(COAD)、肉瘤(SARC)、直肠腺癌(READ)、胃腺癌(STAD)、肺腺癌(LUAD)、嗜铬细胞瘤和副神经节瘤(PCPG)、膀胱移行细胞癌(BLCA)、间皮瘤(MESO)、前列腺腺癌(PRAD)、脑低级别胶质瘤(LGG)、子宫内膜癌(UCEC)、肾嫌色细胞癌(KICH)、胆管癌(CHOL)、子宫癌肉瘤(UCS)、肾乳头状细胞(KIRP)、睾丸生殖细胞瘤(TGCT)、胸腺瘤(THYM)、卵巢浆液性囊腺癌(OV)、肾上腺皮质癌(ACC)和肝细胞癌(LIHC),GBM排在第6位(图1A)。肿瘤患者与健康人的CD44的表达在GBM中差异显著 (图1B)。CD44在大部分的癌种中的风险比都大于1(图1C),提示其是一个与不良预后相关的基因。生存曲线结果显示，相较低表达CD44的GBM患者，CD44高表达的患者生存期更短(图1D)。

图1 CD44的泛癌转录组分析

2.2 CD44高表达的GBM患者具有更高的免疫浸润以及较低的细胞干性

Estimate的结果显示，GBM的CD44高表达组具有更高的基质细胞评分，免疫浸润以及较低的肿瘤纯度(图2A)。免疫浸润与基质细胞在肿瘤的迁移、侵袭与生长中具有重要作用， CIBERSORT结果显示，免疫细胞亚群中的CD4+记忆T细胞，树突状细胞与调节性T细胞具有差异(图2B)。CD44表达与免疫细胞浸润的共表达分析再次证明了相同结果(图2C)。此外，干性分析结果显示，CD44高表达的GBM患者具有较低的细胞干性(图2D)。

图2 GBM中CD44高、低表达对免疫浸润及细胞干性的影响

2.3 CD44的高、低表达会导致免疫浸润，凋亡以及细胞迁移的通路富集

CD44高、低表达组的差异分析表明：包括NAMPT、C1R、C1S、SOD2等在内的多个基因表达具有显著差异(图3A)。这些基因导致与细胞迁移，细胞粘附，整合素结合，胶质细胞发生，细胞凋亡等的通路发生富集(图3B)。

2.4 CD44的过表达，敲低与敲除效率鉴定

qPCR结果显示CD44 KD效率均达到10%以下(图4A)。Western blot结果显示CD44 OE细胞株构建成功(图4B)。将sgRNA和Cas9蛋白转入细胞后，经测序显示CD44基因发生移码突变(图4C)。Westen bolt结果显示，CD44敲除成功， CD44 KO细胞株构建成功(图4D)。

2.5 过表达的CD44会在细胞质中发生蓄积

免疫荧光结果显示，CD44主要表达并定位在细胞膜上(图5A)。但是当CD44过表达时，细胞质中也具有CD44的蓄积(图5B)。

图3 CD44高、低表达组在GBM中的差异表达

图4 CD44的过表达，敲低与敲除验证

图5 细胞质中发生蓄积的CD44

2.7 CD44 KD会导致U87细胞活力下降，凋亡细胞比例上升CD44 KO的U87细胞体外迁移与侵袭能力下降

细胞活力测定表明，CD44 KD会导致细胞活力下降(图6A)。凋亡结果统计，CD44 KD会导致凋亡细胞增多(图6B)。划痕实验结果表明，与U87 WT细胞相比，CD44 KO的细胞划痕愈合能力显著下降(图6C)。侵袭实验结果表明，与U87 WT细胞相比，CD44 KO的细胞迁移到下室的细胞数显著降低(图6D)。

3、讨论

本文通过对CD44的泛癌转录组分析，发现CD44在GBM患者中具有较高的表达量并与预后相关。CD44高、低表达的GBM患者的Estimate评分，免疫浸润及干性分析结果显示，CD44高表达的GBM患者具有较多的基质细胞与免疫浸润，且细胞干性较低，提示CD44高表达可能与GBM的发生、发展密切相关。对CD44表达量分组后的差异基因的富集结果也显示与细胞迁移、细胞黏附、胶质细胞发生、细胞凋亡等通路上调表达。

为了进一步研究CD44在GBM细胞系U87的定位以及其影响的表型，本研究构建了CD44过表达，敲低以及敲除的细胞株。免疫荧光结果显示，CD44主要定位于细胞膜，过表达后CD44会在细胞质中蓄积。敲低CD44后，U87细胞的活力下降，凋亡细胞增多。敲除CD44会导致U87细胞的迁移和侵袭能力下降。

目前，有关CD44的研究主要集中于其位于胞质的信号尾，其可以通过MAPK, Hippo, β-catenin等激活转录因子，介导EMT,代替细胞骨架，以及药物抵抗作用[15]。本实验虽然就CD44高、低表达影响的综合细胞功能进行了验证，但是过表达CD44后，蓄积在细胞质中的CD44如何对下游信号产生影响并未探究。据报道，CD44的跨膜区域可以发生寡聚化，导致其并入富含糖脂的微结构域(glycolipid-enriched microdomains, GEMs)中，而GEMs与CD44结合可以导致GEMs内的受体或者信号分子释放，如SRC家族[16]。综上所述， CD44高表达可以促进U87细胞的多种导致GBM恶化的功能活化，可能是影响GBM患者预后的相关因素。

图6 CD44影响的细胞增殖、凋亡、侵袭与迁移

基金资助:国家自然科学基金(82388201);

文章来源:孙旭,李顺顺,王殿恒,等.CD44差异表达在胶质母细胞瘤中的生物信息学分析及细胞实验验证[J].基础医学与临床,2024,44(06):800-808.