肿瘤诊断对于癌症筛查、术后复发转移监测、疗效评估和治疗靶点筛选等有着重要的意义。然而，目前尚缺乏有效的检测手段。目前，影像学是肿瘤诊断及转移评估最常用的手段，但仍面临早期转移病灶小，影像学不易观察等瓶颈。此外，病理诊断对肿瘤分级和靶向药物筛选有重要的指导意义，但是无法避免肿瘤异质性带来的结果偏差，同时，穿刺或术中取样具有一定的创伤性，通常无法对患者实施多次取样随诊。因此，给预后评估等跟踪性监测带来困扰。

近期研究显示，肿瘤细胞可产生大量血浆胞外囊泡(extracellular vesicles,EVs)，释放入血液、尿液以及脑脊液等多种体液中，并携带来源于肿瘤的多种蛋白和RNA等肿瘤标志物。例如程序性细胞死亡蛋白1配体(programmed cell death ligand 1,PD-L1)、血清糖类抗原153(carbohrdyate antigen153,CA153)、糖类抗原125 (carbohrdyate antigen125,CA125)、癌胚抗原(carcinoembryonic antigen,CEA)、组织多肽特异性抗原(tissue polypeptide specific antigen,TPS)和磷脂酰肌醇蛋白聚糖1(glypican 1,GPC1)等多种EVs蛋白均被发现与肿瘤复发和转移相关[1,2,3,4]。其中，PD-L1抗体药物作为肿瘤免疫治疗的代表药物，在晚期恶性肿瘤治疗中取得了巨大的成功，因而备受瞩目。同时，有研究表明EVs上的PD-L1与肿瘤大小、淋巴结状态、转移和TNM分期等多个肿瘤进展指标相关[5]。而EVs上的PD-L1水平降低可激活抗肿瘤免疫，抑制肿瘤生长和转移[6]。可见，EVs肿瘤相关蛋白不仅对肿瘤预后随诊与用药评估有重要意义，同时，这种基于液体活检的辅助诊断给患者随诊取样带来极大便利，因此，基于EVs肿瘤相关蛋白的液体活检已成为近年来临床及基础研究的热点[7,8]。

由于临床上常用五年生存率进行各种肿瘤治疗方法的比较[9]，标本库长期存储样本常被用于回顾性研究肿瘤预后诊断与用药评估等相关研究。因而，已有大量研究探讨了保存时间对EVs的数量和形态的影响。MADISON等[10]表明，人类血浆或血清样本可以在-80℃下短时间储存，而不会对其中的EVs含量或生物活性产生显著影响。JEYARAM等[11]表明，新鲜血浆产生的EV样品比从冷冻和解冻的血浆样品中分离的样品更纯，囊泡产量更高。WU等[12]表明，EVs可能更适合在-20℃或-80℃下保存。而王婷婷等[13]通过纳米粒度颗粒跟踪分析仪和透射电镜观察发现，新鲜采集及在-80℃冰箱冻存1、3、5年的血浆及血清中外泌体粒径及形态变化差异不大。尽管这些报道对不同存储条件下体液中EVs的含量和生物活性进行了评估研究，但对存储条件及保存时间如何影响EVs携带的蛋白，尤其是肿瘤相关蛋白标志物的水平尚未充分阐明。因此，本研究选取超低温样本库(-80℃)存放不同时间(新鲜、1月、1年、3年、5年)的血浆作为研究对象。通过观察血浆中EVs的数量及形态以及EVs上肿瘤标志物PD-L1表达水平，以期探明不同保存时间对血浆EVs及肿瘤相关蛋白的影响，对后期回顾性研究及无创肿瘤预后监测提供参考。

1、材料与方法

1.1材料

本研究使用新鲜采集、-80℃存放1个月、1年、3年、5年的来自厦门医学院附属第二医院检验科生物样本库的血浆样本，每组25份。由于人血浆中EVs含量及PD-L1水平会受到吸烟[14]、炎症[15]、肿瘤[16]、化疗[17]和高血脂[18]等因素影响，为了减少组内差异，便于质控，我们把这些因素作为入组剔除条件。本研究符合伦理委员会所制定的伦理学标准，并获得受试对象知情同意。BCA试剂盒购自大连博格林生物科技有限公司(MA0082-2)，人总外泌体捕获和定量试剂盒购自辽宁润基生物科技有限公司(RGEXOP96-1)，人PD-L1高敏试剂盒购自联科生物公司(EK1261HS-96),SDS-PAGE凝胶快速配制试剂盒购自大连博格林生物科技有限公司(MA0159-Mar-20H)，一抗CD9、CD63、CD81和二抗均购自Affinity公司，PBS购自大连博格林生物科技有限公司(MA0015-May-24H),TBST购自大连博格林生物科技有限公司(MA0091)。

1.2方法

1.2.1 EVs离心提取

使用超高速冷冻离心机(日立himac CP70NE)分别提取各血浆样本中的EVs，具体操作如下:先取400μL血浆4℃、12 000×g离心1 0 min，留上清;接着，超高速冷冻离心机4℃、20 000×g离心30 min，留上清;然后，4℃、110 000×g离心70 min留沉淀;最后，取200μL PBS重悬EVs。

1.2.2透射电镜观察EVs形态

采用1%醋酸乙酰铀负染法对EVs进行透射电镜(日立Hitachi HT7700 EXALEN)观察。具体操作步骤如下:血浆冰上融化后，取10μL稀释10倍后，4%多聚甲醛固定10 min。将不同样品的EVs悬浮液(约5μL)滴至包被聚醋酸甲基乙烯脂的碳化铜网上，室温放置4～5 min，滤纸吸干残余液体。滴加负染液1%水醋酸双氧铀(5μL)于铜网上反应1 min，然后用滤纸吸干，清洗2遍。使用透射电镜进行拍照。

1.2.3纳米颗粒跟踪分析仪检测EVs浓度和大小

使用纳米颗粒跟踪分析仪(Particle Metrix/Zeta View)对从血浆中分离的EVs进行纳米颗粒跟踪分析(nanoparticle tracking analysis,NTA)。分离的EVs样品用PBS稀释500～2 000倍，以便在仪器的线性范围内计数。记录颗粒运动，并对所有样品进行三次分析，得到粒子大小和浓度。

1.2.4 BCA检测EVs总蛋白浓度

使用BCA蛋白浓度测定试剂盒(BCA Protein Assay Kit)测定EVs总蛋白浓度。将离心得到的EVs溶液稀释100倍后加入孔板中，加入工作液显色后，使用酶标仪在562 nm处检测蛋白标准品及样品溶液吸光度，根据标准曲线计算出样品总蛋白浓度。

1.2.5免疫吸附法测EVs浓度

采用人总外泌体捕获和定量试剂盒，根据说明书将特异性抗人总EVs捕获抗体包被酶标板上，直接加入各组样品或标准品，然后加入Biotin标记的检测抗体，洗涤后，加入辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素(Streptavidin-HRP)，洗涤后，加入显色底物TMB，避光显色。加终止液终止反应，在30min之内，使用酶标仪进行检测，读取各孔OD值。

1.2.6免疫印迹法(Western Blot,WB)测定EVs蛋白表达情况

离心得到的EVs溶液用PBS稀释3倍后煮样，每孔上样量3μL，用SDS-PAGE进行电泳分离，再通过转膜到PVDF膜上，用5%脱脂牛奶封闭1小时，用TBST洗膜三次之后在4℃下与一抗CD9、CD63、CD81孵育过夜，再次用TBST洗膜三次，与二抗室温下孵育1小时，再用TBST洗膜三次后ECL发光。用凝胶成像仪(Chemi Doc MP)进行显影，将显影所得图像经image J分析得灰度值，并将保存1个月、1年、3年、5年的样品灰度值与新鲜灰度值作比值得到相对表达率，所得数据用Graphpad Prism进行作图分析。

1.2.7酶联免疫吸附法测定EVs蛋白表达情况

利用人总外泌体捕获和定量试剂盒和人PD-L1高敏试剂盒检测血浆样本中不同EVs蛋白表达情况，操作方法遵循说明书，具体步骤如下:PD-L1+EVs的数量检测时，用洗液浸泡，提前包被PD-L1捕获抗体的酶标板，加样后用人总外泌体定量检测抗体进行孵育;EVs上PD-L1含量检测是用人总外泌体捕获抗体包被酶标板，加样后用PD-L1高敏检测抗体进行孵育。孵育结束后，洗涤并加入HRP标记的链霉亲和素进行孵育，洗涤，加显色剂使反应杯呈现蓝色，加终止液终止反应，在30 min之内，使用酶标仪(molecular devices)进行检测，读取各孔OD值。代入标准曲线，计算样品浓度。

2、结果

2.1不同保存时间对血浆中EVs形态的影响

为观察不同保存时间对血浆中EVs形态的影响，通过透射电镜放大2万倍(标尺500 nm)、3万倍(标尺200 nm)和6万倍(标尺100 nm)观察。如图1所示，储存时间为1个月以内的EVs形态变化不大，均为典型杯状结构。但保存时间超过1年，EVs形态发生变化，出现变形、聚集和碎裂的情况。负染后背景噪音较高，出现30～150 nm与EVs大小相当但形状不符的团块，疑似白蛋白聚集物。结果说明保存时间超过1年以上的冻存对EVs形态和血浆胶体稳定性产生影响。

图1 透射电镜下EVs的形态

2.2不同保存时间EVs粒径大小及颗粒数变化

为了分析保存时间对血浆EVs粒径大小及颗粒数的影响，我们进一步通过NTA对各组样本进行检测。结果显示，随着保存时间的延长，血浆EVs粒径大小无明显变化(图2A)。颗粒数量结果表明，新鲜样本(13.55±3.87)×1010个/m L，保存1个月(15.52±5.96)×1010个/m L以及1年的样本(14.90±5.47)×1010个/m L差异较小。而保存3年(21.17±9.22)×1010个/m L和5年(24.28±17.96)×1010个/m L的颗粒数有增加的趋势，但是标准差较大，与短期存储样本没有统计学意义(图2B)。结合电镜结果，3年和5年的血浆样本中存在与EVs大小相当的团块，我们推测这些团块可能是导致长期存储样本NTA检测结果差异的原因。

图2 EVs粒径大小及颗粒数变化

2.3不同保存时间对血浆蛋白水平的影响

为排除蛋白凝聚团块等对NTA中EVs数量检测的影响，明确时间对EVs数量和蛋白水平的影响，我们又通过特异性更强的免疫捕获的方法进行检测。首先，通过BCA测血浆总蛋白含量，结果显示，随着保存时间的延长，血浆中总蛋白含量无明显变化(图3A)。然而，免疫捕获试剂盒鉴定结果显示，存储时间3年和5年的样本，捕获的EVs颗粒数显著减少(图3B)。由于免疫捕获是通过EVs标志性蛋白CD9、CD63和CD81进行，因此我们又进一步通过WB对离心后获得的EVs上的标志性蛋白水平进行检测。结果显示，相同蛋白浓度上样量的样本中，CD63表达水平随保存时间的延长逐年减少，CD9、CD81表达水平虽然有逐年降低的趋势，但只有第5年的水平才较新鲜样本显著降低(图3C-F)。进一步证实了免疫捕获法检测到的EVs数量变少是由EVs表面标志蛋白变化，不易被捕获并检测引起的。结合电镜的结果，我们推测长时间的存储，可能会导致EVs形态变化同时其表面蛋白含量也会出现变化。

图3 不同保存时间血浆中蛋白含量变化

2.4不同保存时间对血浆中EVs上PD-L1表达的影响

由于长期存储导致能检测到的EVs上的标志蛋白减少，因而我们又分析了存储时间对EVs上的肿瘤标志蛋白PD-L1水平的影响。从整体来看，新鲜血浆肿瘤标志性蛋白PD-L1水平、PD-L1+EVs的数量和EVs上PD-L1表达量与经1个月以及1年保存的样本相应指标并无显著差异。然而，随着保存时间的延长，保存3年和5年的血浆PD-L1蛋白整体水平、PD-L1+EVs的数量和EVs上PD-L1表达均有显著下降(图4A-C)。

图4 不同保存时间对PD-L1表达的影响

3、讨论

肿瘤生物样本库对于回溯性研究发挥了非常重要的作用。而样本储存的一个重要问题是待检测样本和指标对存储期限的要求。理想的组织储存环境是大型液氮罐，在-196℃的液氮中组织样本可储存多年。但限于空间及经费等原因，并非所有机构都有能够满足建库要求的设备。因此，目前国内外大型生物样本库仍以-80℃的超低温冰箱储存为主。但在这样的低温环境下生物大分子活性保持的时间会明显缩短，具体能保存多久仍无定论。EVs作为肿瘤液体活检非常有潜力的手段，其保存条件及存储期限对其上蛋白的影响亟待确定。王婷婷等[13]发现电镜下不同保存时间的血浆中外泌体形态变化不明显，但保存时间达3年的血浆中的外泌体粒径较大(30～200 nm)。另有报道指出[19]，在4℃和-80℃储存条件下会导致EVs直径变大。卢姝言等[20]也曾指出外泌体在4℃条件下短期存储不会产生较大影响，且不会受到反复冻融对脂质膜的破坏，但外泌体数量会随着保存时间的延长而减少。此外，冷冻可能会引起外泌体的聚集，还可能形成多层膜结构。类似的，我们通过电镜观察发现，-80℃储存3年及5年的EVs形态发生变化，出现聚集、变形和碎裂。本研究进一步通过NTA检测发现，随着保存时间的延长，EVs颗粒数没有明显变化。而免疫捕获的方法检测却发现保存3年和5年的EVs颗粒数显著减少。我们根据电镜结果猜测是由于随着保存时间的延长，血浆中的杂质发生聚集，形成30～150 nm的聚合物，干扰了NTA的检测结果。

存储时间除了对EVs形态的影响外，我们还发现，尽管保存时间的延长未导致血浆中总蛋白含量发生明显变化，但使血浆中EVs表面蛋白CD9、CD63、CD81和肿瘤标志性蛋白PD-L1的表达减低。类似的，卢姝言等[20]同样发现外泌体中包裹的蛋白质、核酸等物质会随着保存时间的延长而减少，外泌体中的蛋白质在保存时会发生一定程度的降解，并提出在保存和提取过程中加入蛋白酶抑制剂可有效防止外泌体相关蛋白的降解。我们发现CD63表达水平随保存时间的延长逐年减少，CD9、CD81表达水平虽然有逐年降低的趋势，但只有第5年的水平才较新鲜样本显著降低。我们注意到CD63对时间变化较CD9和CD81更敏感。王婷婷等[13]也发现随着保存时间的延长，血浆及血清中外泌体蛋白TSG101及CD63含量发生降低，其中CD63降低尤其明显。MATHIEU等[21]在Hela细胞上发现，CD9、CD81和CD63的转运方式和EVs的种类分布是不同的。小EVs从质膜上以出芽方式形成，主要表达CD9和CD81，而CD63较少。而外泌体来源于内涵体，主要表达CD63和一些晚期核内体蛋白，而CD9较少。这种分布和EVs种类的不同是否是造成蛋白稳定性差异的原因，仍有待进一步研究。我们还发现，新鲜血浆肿瘤标志性蛋白PD-L1水平、PD-L1+EVs的数量和EVs上PD-L1表达量与保存1个月及1年的样本无显著差异。随着保存时间的延长，保存3年和5年的血浆PD-1蛋白整体水平，PD-L1+EVs的数量和EVs上PD-L1表达量均有显著下降。以上结果说明，存储时间对不同蛋白的影响会有一定差异，但从总体趋势来看，长期储存会降低血浆样本EVs蛋白含量。

综上，本研究对比了不同保存时间对血浆中EVs及蛋白的影响，结果显示保存1年以上的EVs上的蛋白，包括肿瘤标志性蛋白PD-L1的表达明显降低。因此，进行EVs蛋白检测时，应尽量选用保存在一年以内的样本。对于临床样本的回溯性研究中，应该选取同一时间保存的样本进行对比。因此，本研究对临床回溯性研究的样本选择和实验设计具有一定的指导意义。

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基金资助:福建省中青年教师教育科研项目(编号:JAT200713); 厦门医学院科技计划-医院联合资助项目(编号:K2023-04); 厦门医学院大学生创新创业训练计划资助项目(编号:202012631004,202312631060);

文章来源:林真亭,林榕,张娜,等.保存时间对血浆胞外囊泡及囊泡蛋白的影响[J].现代肿瘤医学,2024,32(13):2341-2346.