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锦灯笼果实总黄酮超声辅助提取工艺研究

2024-07-18 8 上传者：管理员

摘要：锦灯笼果实中黄酮类化合物具有抗肿瘤、抗氧化、抗菌、抗炎等生物活性。以锦灯笼果实为原料，乙醇溶液为提取剂，锦灯笼果实总黄酮得率为评价指标，采用超声波辅助乙醇溶剂提取法，分别对超声功率、提取温度、提取时间、乙醇体积分数、料液比进行单因素影响试验。在单因素实验基础上，结合正交试验优化工艺参数。结果表明：影响锦灯笼果实总黄酮提取效果因素的主次顺序为提取时间>乙醇体积分数>超声功率>料液比。在提取温度50℃、提取时间30 min、乙醇体积分数70%和液料比为1∶30的条件下，锦灯笼果实总黄酮得率为3.32%。

关键词：
总黄酮
挂金灯
正交试验
超声辅助提取
锦灯笼果实
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锦灯笼又名红菇娘、酸浆、挂金灯等，为茄科酸浆属植物。其果实在秋季成熟，呈表面光滑的球形，颜色为橙红色，味道微酸，内含丰富的矿物元素及维生素，同时具有清热解毒、利咽化痰、利尿通淋等功效[1]。锦灯笼是我国历史上兼具药食两用价值的草本野生浆果，其药用价值在《本草纲目》《神农本草经》中早有记载[2]。2020版《中国药典》中提到，锦灯笼全株均可入药[3]。锦灯笼虽在全国大部分地区均有分布，但因黑龙江省的地理位置和得天独厚的自然环境，以黑龙江地区的产量大、质量好。迄今，运用现代化检测分析技术已从锦灯笼中分离、鉴定出500余种化学成分，包括甾体类化合物、黄酮类化合物、含氮类化合物、苯丙素类化合物、萜类化合物、糖及糖苷类化合物等[4]。

在天然植物中，因黄酮类化合物安全、无毒并具有抗肿瘤、抗氧化、抗病毒、抗炎等生物活性而备受关注[5,6,7]。近年来，超声波技术被广泛应用于植物活性成分的提取，利用超声波产生的空化效应，增加溶剂的穿透力，促使目标提取物更易溶入提取溶剂中，从而提高提取效率[8],为了充分利用锦灯笼资源，提升其药用价值，本实验以生长在黑龙江地区草本植物锦灯笼为原料，采用超声波辅助溶剂提取法，通过单因素和正交试验法优化锦灯笼果实总黄酮类物质的提取工艺，为锦灯笼的深加工及综合利用提供研究依据。

1、材料与方法

1.1 材料与试剂

锦灯笼购买于黑龙江省哈尔滨市阿城区；芦丁标准品：北京索莱宝科技有限公司；无水乙醇：天津市科密欧化学试剂有限公司；亚硝酸钠、硝酸铝：天津市致远化学试剂有限公司；氢氧化钠：天津市北辰方正试剂厂。以上试剂均为分析纯。

1.2 仪器设备

DHG-9240型电热恒温鼓风干燥箱：上海一恒科技有限公司；ALC-1104电子分析天平：北京赛多利斯仪器系统有限公司；UV-2200紫外可见分光光度计：北京普析通用瑞利分析仪器有限公司；DFY-500型植物粉碎机：大德药剂有限公司；BCD-238(L)美菱电冰箱：合肥美菱股份有限公司；SK5210HP超声波清洗器：上海科导超声仪器有限公司；40目分样筛：思科仪器纱筛厂。

1.3 方法

1.3.1 样品预处理

新鲜成熟的锦灯笼果实，剔除腐烂、杂质及虫蛀等部分，以清水淘洗后沥干，置60 ℃烘箱中烘干，避免温度过高导致锦灯笼果实焦糖化；烘干后粉碎过40目筛。锦灯笼果实粉装袋密封置于干燥器中备用，防止吸湿受潮。

1.3.2 芦丁标准曲线的绘制

准确称取烘干至恒重的芦丁标准品10 mg, 用60%乙醇溶液溶解并定容至100 mL,得到浓度为0.1 mg/mL的芦丁标准溶液。分别取不同体积的标准溶液置于容量瓶中，并加入5%NaNO2、10%Al(NO3)3、1.0 mol/L NaOH溶液，60%乙醇定容混匀，以得到一系列不同浓度梯度的标准曲线工作溶液，以0 mg/mL的空白试剂为参比溶液，在510 nm波长处测吸光度。

1.3.3 总黄酮得率的测定

准确称取2.00 g锦灯笼果实粉末置于锥形瓶中，加入一定体积分数的乙醇浸提24 h, 超声波提取后真空抽滤，滤液定容后作为待测液。取0.5 mL待测溶液按“1.3.2”方法测定样品的吸光度，根据标准曲线计算出黄酮质量浓度，从而得到总黄酮的得率，公式如下：

总黄酮得率(%)=C×VW×103×100%

式中：C—根据标准曲线计算出的待测液黄酮质量浓度，mg/mL;V—黄酮提取液定容的总体积，mL;W—称取锦灯笼果实粉末质量，g。

1.3.4 单因素对锦灯笼果实总黄酮提取率的影响

称取一定质量的锦灯笼果实粉末，用一定体积分数的乙醇浸提24 h后，采用超声波辅助乙醇溶剂浸提法提取锦灯笼果实总黄酮。分别考察超声功率、提取时间、提取温度、料液比及乙醇体积分数五个因素对锦灯笼果实中总黄酮得率的影响，单因素试验设计见表1。

表1 单因素试验设计

1.3.5 正交试验法优化锦灯笼果实总黄酮提取工艺

根据上述对单因素试验结果的测定及数据结果分析，固定提取温度为50 ℃,选取超声功率、提取时间、乙醇体积分数、料液比为锦灯笼果实总黄酮提取效果主要影响因素，以总黄酮得率为考察指标，进行L9(34)正交试验，对锦灯笼果实总黄酮提取工艺进行优化。正交试验因素水平见表2。

表2 正交试验因素水平表

2、结果与分析

2.1 芦丁标准曲线

根据所得试验数据，以芦丁的质量浓度(mg/mL)作为横坐标，测定所得吸光度作为纵坐标，绘制芦丁的标准曲线，见图1。回归方程为y=11.771x+0.004,相关系数R2=0.999 4,线性关系良好。

图1 芦丁标准曲线

2.2 单因素对锦灯笼果实总黄酮得率的影响

2.2.1 超声功率对锦灯笼果实总黄酮得率的影响

称取相同质量的锦灯笼果实粉末2.00 g, 用60%乙醇溶液按料液比1∶20浸泡24 h, 在温度为50 ℃的条件下，分别在超声功率为100 W、130 W、160 W、190 W、220 W的条件下超声处理30 min, 对锦灯笼果实总黄酮进行提取，结果如图2所示。

图2 超声功率对总黄酮得率的影响

由图2可知，锦灯笼果实总黄酮得率随着超声功率的增大先上升后下降。较高的超声功率可有助于黄酮物质在溶剂中的释放和溶入，在超声功率为160 W时，锦灯笼果实黄酮的提取率最高可达到3.04%。而当超声功率超过160 W时，提取率呈现出大幅度下降的趋势，其原因可能是超声功率过高使黄酮类物质结构受到破坏[9],导致黄酮得率下降。

2.2.2 提取温度对锦灯笼果实总黄酮得率的影响

称取相同质量的锦灯笼果实粉末2.00 g, 用60%乙醇溶液按料液比1∶20浸泡24 h, 超声功率160 W,分别在提取温度为40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃的条件下超声处理30 min, 对锦灯笼果实总黄酮进行提取，结果如图3所示。

图3 提取温度对总黄酮得率的影响

由图3可知，锦灯笼果实总黄酮得率在提取温度为50 ℃时达到最高。随着提取温度的继续升高，接近乙醇溶剂的沸点，乙醇挥发严重，致使提取剂的有效浓度降低。同时提取温度过高醇溶性杂质的溶出增加，并伴随着黄酮类化合物的氧化反应，综合考虑，提取温度控制在50 ℃较为适宜。

2.2.3 超声时间对锦灯笼果实总黄酮得率的影响

称取相同质量的锦灯笼果实粉末2.00 g, 用60%乙醇溶液按料液比1∶20浸泡24 h, 超声功率160 W,提取温度为50 ℃的条件下，分别超声处理20 min、30 min、40 min、50 min、60 min, 对锦灯笼果实总黄酮进行提取，结果如图4所示。

图4 超声时间对总黄酮得率的影响

由图4可知，随着超声时间的增加，锦灯笼果实中的黄酮逐渐浸出到溶液中，其提取率呈逐渐上升的趋势。在超声时间为40 min时锦灯笼果实总黄酮提取率最高，可达到 3.08%。在50 min后，因超声时间过长，可能造成黄酮类化合物化学键断裂而发生降解，导致提取率急剧下降。

2.2.4 乙醇体积分数对锦灯笼果实总黄酮得率的影响

称取相同质量的锦灯笼果实粉末2.00 g, 分别用40%、50%、60%、70%、80%乙醇溶液按料液比1∶20浸泡24 h, 超声功率160 W,提取温度为50 ℃的条件下，超声处理30 min, 对锦灯笼果实总黄酮进行提取，结果如图5所示。

图5 乙醇体积分数对总黄酮得率的影响

由图5可知，锦灯笼果实总黄酮的提取率在乙醇体积分数小于70%时，随着乙醇体积分数的不断增加而随之上升。乙醇体积分数在40%—50%时，乙醇体积分数较低，锦灯笼果实总黄酮溶出不完全；随着乙醇体积分数的增加，样品中总黄酮逐渐充分溶出；当乙醇体积分数为70%时，总黄酮提取率达到最高为3.10%。而乙醇体积分数过高，会增加脂溶性和醇溶性物质溶出，从而影响总黄酮提取效果。

2.2.5 料液比对锦灯笼果实总黄酮得率的影响

称取相同质量的锦灯笼果实末2.00 g, 分别用60%乙醇溶液按料液比1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35浸泡24 h, 超声功率160 W,提取温度为50 ℃的条件下，超声处理30 min, 对锦灯笼果实总黄酮进行提取，结果如图6所示。

图6 料液比对总黄酮得率的影响

由图6可知，在料液比为1∶15—1∶30 范围内，随着液料比的逐渐增加，锦灯笼果实总黄酮得率呈上升趋势；当料液比为1∶30时，总黄酮得率达到最大值，其提取率为3.04%;继续增加液料比，总黄酮得率反而有所降低。在料液比较低时，溶剂量太少使锦灯笼果实粉末与溶剂接触不充分；而过高的料液比会使黄酮受到胞内其他化合物竞争性溶出的影响[10],降低总黄酮提取量。

2.3 锦灯笼果实总黄酮提取工艺正交试验优化结果

在单因素试验的基础上，选取4因素3水平进行正交试验，对锦灯笼果实总黄酮提取工艺进行优化，结果见表3。

表3 L9(34)正交试验结果与分析

由表3可知，影响提取率的因素主次顺序为提取时间>乙醇体积分数>超声功率>料液比。提取时间对锦灯笼总黄酮提取效果的影响最大，其次是乙醇体积分数，再次是超声功率，料液比的影响最小。正交试验法得出的最优方案为A2B1C2D3,即超声功率为160 W,提取时间为30 min, 乙醇体积分数为70%,料液比为1∶30。以筛选的最优方案进行3次验证试验，提取锦灯笼果实中的黄酮物质，平均得率为3.32%,高于表3中其他组合的提取结果。因此确定A2B1C2D3为锦灯笼果实总黄酮提取工艺的最优组合。

3、结论

黑龙江地区锦灯笼资源丰富，其果实多供生食，或被加工成罐头、果汁、果酱、果酒等，所含活性成分在保健食品、医药等领域的应用不足。本研究以黑龙江地区的锦灯笼果实为研究对象，在单因素试验基础上通过正交试验优化总黄酮提取工艺。结果表明，在固定提取温度的条件下，4 个因素对锦灯笼果实总黄酮得率影响的主次顺序为：提取时间>乙醇体积分数>超声功率>料液比。锦灯笼果实总黄酮最优提取工艺参数为：提取温度 50 ℃、提取时间 30 min、乙醇体积分数为70%、液料比为1∶30,在此条件下，锦灯笼果实总黄酮得率为 3.32%。运用超声波辅助技术从锦灯笼果实中提取黄酮类化合物，工艺条件简单，成本低，有利于提高锦灯笼的药用价值，可为后续锦灯笼果实总黄酮的分离与提纯提供参考。

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基金资助:中国(北方)现代林业职业教育集团科学研究资助课题项目“东北红铧头草功能活性成分及深加工产品研究”(LZJB2023KY006);