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彝药云南红药胶囊中毒性药味制黄草乌的质量控制研究

2024-08-22 136 上传者：管理员

摘要：目的：探索云南红药胶囊中毒性药味制黄草乌的质量控制方法，为制定质量标准提供依据。方法：采用显微鉴别方法筛选制剂中具专属性的显微特征，采用HPLC法对制黄草乌中滇乌碱进行限量检查。使用Eclipse Plus C18 （4.6 mm×250 mm,5μm）色谱柱，以甲醇-缓冲盐溶液（水-三乙胺-磷酸比例为600∶2∶1）(40∶60)为流动相，流速1.0 mL•min-1，检测波长260 nm，柱温30℃。结果：制黄草乌的石细胞特征具较强专属性。HPLC法测定时，滇乌碱进样量在12.24～367.18 ng范围内呈良好线性关系（r>0.9998），平均回收率为93.2%,RSD=1.96%（n=6）。15批次样品中滇乌碱的量均小于拟定限度。结论：石细胞特征可用于鉴别制黄草乌，滇乌碱限量检查方法分离效果好，可为复方制剂云南红药胶囊中制黄草乌的控制提供依据。

关键词：
云南红药胶囊
显微鉴别法
滇乌碱
高效液相色谱法
黄草乌
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云南红药胶囊是复方制剂，收载于《卫生部药品标准（中药成方制剂）第十五册》，处方由三七、重楼、制黄草乌、紫金龙、玉葡萄根、滑叶跌打、大麻药、金铁锁、滇黄芩、石菖蒲10味药组成，全生粉入药，具止血镇痛、活血散瘀、祛风除湿之功效，用于胃溃疡出血、支气管扩张咯血、功能性子宫出血、月经过多、眼底出血、眼结膜出血、鼻衄、痔疮出血、软组织挫伤、风湿性关节炎以及风湿性腰腿痛等[1-5]。

处方中制黄草乌系毒性药味，为毛茛科植物黄草乌Aconitum vilmorinianum Kom.块根的加工炮制品，执行标准为云南省中药饮片标准“云YPBZ-0203-2014制黄草乌”[6]。黄草乌含二萜生物碱，主要为滇乌碱、8-去乙酰滇乌碱、黄草乌碱甲等，其炮制后，滇乌碱部分转化成8-去乙酰滇乌碱[7-8]。滇乌碱既是有效成分也是毒性成分，其毒性为8-去乙酰滇乌碱的20倍[7]。本文从显微鉴别和HPLC法限量检查2个方面探讨云南红药胶囊中毒性药味制黄草乌的相关质量控制方法。

1、材料与仪器

1.1仪器

光学显微镜（50i型，NiKon公司）。

高效液相色谱仪（U3000，赛默飞世尔科技公司）；万分之一电子分析天平（BSA224S，赛多利斯科学仪器有限公司）；十万分之一电子分析天平（CPA225D，赛多利斯科学仪器有限公司）；超声波清洗机（SB-800 DTD，宁波新芝生物科技股份有限公司）。

1.2试剂

乙腈、甲醇为色谱纯；其余试剂均为分析纯，水为超纯水。

滇乌碱对照品：批号19102101，标示纯度98.96%，供含量测定用，森岚科技有限公司。

云南红药胶囊：批号20180805、20180813、20190103、20190401、20190402、20190403、20190405、20190406、20190501、20190606、20191101、20191102、20191103、20200201，规格0.25g·粒-1，云南植物药业有限公司。

阴性样品：不含制黄草乌的云南红药胶囊，云南植物药业有限公司。

2、显微鉴别

本品为全生粉入药的胶囊剂，采用显微鉴别方法控制制剂的有效性。

制黄草乌最典型的显微特征是具有长方形石细胞，而处方中滑叶跌打、大麻药、滇黄芩也具有石细胞的显微特征，为此采用比较法进行研究（见表1）。

表1云南红药胶囊中4味饮片的石细胞特征比较表

通过饮片与制剂的比较研究，制剂中均能检出制黄草乌、大麻药和滇黄芩的石细胞（图1），而根据其细胞结构的特殊差异，如细胞壁增厚方式、壁孔的构成等特点能够进行区别，以此控制制剂的有效性。

图1云南红药胶囊中所含石细胞显微图

3、云南红药胶囊中滇乌碱限量检查

3.1溶液制备

3.1.1对照品溶液

精密称取滇乌碱对照品15.46 mg，置100 mL量瓶中，加甲醇使溶解并稀释至刻度，摇匀，得对照品储备液（152.99μg·mL-1）；精密量取对照品储备液5 mL，置25 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得质量浓度为30.60μg·mL-1的对照品溶液（1）；精密量取对照品溶液（1)5 mL置25mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得质量浓度为6.12μg·mL-1的对照品溶液（2）。

3.1.2供试品溶液

取本品内容物约5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加浓氨水5 mL，加水10 mL润湿，加乙醚30mL，超声处理（功率800 W，频率45 kHz，冰浴）30 min，取出上清液，药渣再加乙醚超声提取2次（每次20 mL,15、10 min），合并乙醚液，挥干，残渣加甲醇溶解并转移至10 mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

3.1.3阴性样品溶液

将不含制黄草乌的云南红药胶囊按“3.1.2”项方法处理，即得阴性样品溶液。

3.2色谱条件

色谱柱：Eclipse Plus C18(4.6mm×250mm,5μm）；流动相：甲醇-缓冲盐溶液（水-三乙胺-磷酸比例为600∶2∶1)(40∶60）；流速：1.0mL·min-1；检测波长：260 nm；柱温：30℃；进样量：5μL。

3.3方法学考察

3.3.1专属性考察

精密吸取对照品溶液（1）、供试品溶液（样品批号20180813）、阴性样品溶液各5μL，按“3.2”项下色谱条件，注入液相色谱仪测定。结果显示，样品色谱图中检出与滇乌碱对照品保留时间一致的色谱峰，阴性样品色谱图中无相应色谱峰，说明方法专属性良好，见图2。

图2云南红药胶囊滇乌碱测定HPLC色谱图

A.滇乌碱对照品；B.样品（批号20180813);C.阴性样品。

3.3.2线性关系考察

分别精密吸取对照品溶液（1)(2）各2、4、8、10、12μL，按“3.2”项下色谱条件分别注入液相色谱仪，测定峰面积，以滇乌碱进样量（X,ng）为横坐标，以峰面积积分值（Y）为纵坐标，绘制标准曲线，得线性回归方程：Y=1.5135X-0.8398,r=0.9998，滇乌碱进样量在12.24～367.18 ng范围内呈良好线性关系。

3.3.3精密度试验

精密吸取对照品溶液（1)5μL，按“3.2”项下色谱条件连续进样6针，记录色谱峰面积，计算RSD值为0.3%(n=6），表明方法的精密度良好。

3.3.4稳定性试验

取制备好的同一供试品溶液（批号20180813），分别在配制后0、7、14、21、31、38、45 h，按“3.2”项下色谱条件进样测定，峰面积平均值为21.40,RSD值为0.5%，结果表明供试品溶液在45 h内稳定。

3.3.5检测限与定量限

精密称取未检出滇乌碱的样品（批号20190103)5 g共2份，分别精密加入质量浓度为3.07μg·mL-1的对照品溶液0.7、2 mL，照“3.1.2”项方法制备得到检测限溶液及方法定量限溶液；精密吸取5μL，按“3.2”项下色谱条件进行测定，记录色谱图。计算信噪比（S/N），按S/N=3∶1得到方法检测限为0.43μg·g-1,S/N=10∶1得到方法定量限为1.25μg·g-1。

3.3.6加样回收率试验

取未检出滇乌碱的样品（批号20190103)6份，每份约5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入质量浓度为306.58μg·mL-1的对照品溶液1.0 mL，按“3.1.2”项方法制成供试溶液，按“3.2”项下色谱条件测定，计算回收率。结果回收率平均值为93.2%,RSD=1.96%(n=6），详见表2。

表2加样回收率试验结果

3.4限度制定

根据云南省中药饮片标准“云YPBZ-0203-2014制黄草乌”[6]【含量测定】项规定含滇乌碱（C35H49NO11）应为0.020%～0.040%，云南红药胶囊中制黄草乌在制剂处方中占15%，按照滇乌碱高限0.04%折算，制剂中滇乌碱高限为60μg·g-1，低于万分之二，不宜进行含量测定，故作限量检查。

本品【用法与用量】规定[1]：口服，一次2～3粒，一日3次。一日用最大量为9粒，制黄草乌最大日用量为338 mg，按照滇乌碱高限0.04%折算，滇乌碱最大日用量为0.135 mg。

经查阅文献[5,7,9]，将文献中小鼠滇乌碱灌胃给药的LD50按等效剂量换算[10-11]得到成人（体质量60 kg计）服用滇乌碱的最小LD50=15.52 mg，为成年人单日服用最高量中含滇乌碱的高限（0.135 mg）的115倍，见表3。

表3成年人服用滇乌碱的LD50

注：成年人体质量按60 kg计算。

综上所述，成年人每日服用云南红药胶囊的最大剂量中含滇乌碱的高限远低于小鼠急性毒性实验中LD50的最低量。故以制剂中滇乌碱含量60μg·g-1作为限度，按供试品溶液制备法计算，规定供试品溶液中滇乌碱峰面积应小于30μg·mL-1的对照品溶液峰面积。

3.5样品测定

分别取不同批次的样品15批，按“3.1.2”项下方法制备供试品溶液，按“3.2”项下色谱条件分别进样，进行测定，记录色谱图及滇乌碱峰面积，均小于30μg·mL-1滇乌碱对照品溶液对应的峰面积。

4、讨论

4.1显微鉴别小结

对该制剂进行显微鉴别研究，结果显示制黄草乌的显微特征是石细胞，同时观察到其他药味的典型特征。

4.1.1处方中不同药味石细胞显微特征

处方中制黄草乌、滑叶跌打、大麻药和滇黄芩都有石细胞，根据制黄草乌胞腔空而宽大且壁上可见环状层纹、滑叶跌打石细胞壁多成链珠状增厚、大麻药石细胞类圆形及类方形且胞腔多呈空洞状、滇黄芩石细胞多成梭形且孔沟明显细密等特征可进行区分。

4.1.2制黄草乌与药典草乌石细胞比较[12]

二者石细胞主要区别：草乌石细胞较制黄草乌大，制黄草乌石细胞长80～160μm，草乌石细胞长至465μm；制黄草乌石细胞细胞壁增厚均匀，草乌石细胞壁厚薄不一。综上，可根据石细胞将制黄草乌和草乌予以区分。

4.1.3其他药味的显微特征

1）玉葡萄根和重楼的草酸钙结晶有明显区别，玉葡萄根的草酸钙针晶束有的存在于分泌细胞中，重楼的草酸钙针晶呈棒状。2）玉葡萄根中的导管也比较特殊，呈现超大型梯形导管，直径150～270μm，具较强的偏光性。

4.2滇乌碱限量检查中提取方法的选择[12-16]

本研究分别对样品的提取方法进行比较，参考《中国药典》2020年版一部“草乌”【含量测定】项，在碱性条件下用异丙醇-乙酸乙酯（1∶1）作溶剂提取样品[12]，结果HPLC色谱图中滇乌碱峰周围峰较多，难以分离。参考云南省中药饮片标准“云YPBZ-0203-2014制黄草乌”【含量测定】项，在碱性条件下用乙醚作溶剂提取样品，结果HPLC色谱图中滇乌碱峰与周围峰分离度在1.5以上，故以此条件作为云南红药胶囊滇乌碱限量检查的供试品溶液制备方法。

4.3流动相的选择

分别比较了流动相乙腈-0.2%三乙胺（磷酸调节pH至3.1)(31∶69)[16]、乙腈-40 mmol·L-1乙酸铵缓冲液（用氨水调pH至9.00)(35∶65)[8]、甲醇-缓冲盐溶液（水-三乙胺-磷酸比例为600∶2∶1)(40∶60)[17-18]。乙腈系统中，滇乌碱峰与周围杂峰较难分离；甲醇系统中，滇乌碱峰与周围杂峰分离好，分离度达到1.5以上。因此，选用甲醇-缓冲盐溶液（水-三乙胺-磷酸比例为600∶2∶1)(40∶60）作为流动相。

4.4耐用性试验

4.4.1不同色谱柱考察

取滇乌碱对照品溶液和供试品溶液，按“3.2”项下色谱条件，分别选用2支不同色谱柱[Eclipse Plus C18(4.6 mm×250 mm,5μm）和Agilent ZORBAX SB-C18(4.6 mm×100 mm,3.5μm）]进行测定，结果不同色谱柱的滇乌碱保留时间和峰形稍有不同，但滇乌碱峰与周围峰分离度均达到1.5以上，且计算滇乌碱的量的相对偏差<3.0%，表明色谱柱型号对检测结果影响不大。

4.4.2流速、柱温及检测波长的考察

按“3.2”项下色谱条件，分别改变流速（0.8、1.0、1.2 mL·min-1）、柱温（20、30、40℃）及检测波长（257、258、259、260、262、262、263 nm），其他条件不变，对滇乌碱对照品溶液和供试品溶液进样测定，记录色谱图，对云南红药胶囊中滇乌碱的量进行计算。结果显示：流速在0.8～1.2 mL·min-1、柱温在20～40℃、波长在257～263 nm范围内波动时，测定结果的RSD均<3.0%。

参考文献:

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