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灵芝三萜和灵芝多糖的提取及分离纯化研究概述

2023-09-20 97 上传者：管理员

摘要：灵芝在我国有上千年的药用历史，具有较高的药用价值。近年来关于灵芝三萜和多糖的报道越来越多，因其具备临床疗效，更是引起了广泛关注。概括灵芝不同用药部位三萜、多糖的含量差异，及其当前常用的提取、分离纯化方法的优点和不足，以期为灵芝三萜、多糖等活性物质的定向开发、利用提供理论指导。

关键词：
三萜
中药学
分离纯化
多糖
灵芝
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灵芝Ganoderma lucidum，是我国传统的药用真菌，含有三萜、多糖等多种活性成分。这些活性成分在抗肿瘤、抗癌，以及改善慢性病、提高机体免疫力等方面均有显著效果。近年来，随着人们生活水平稳步提高，保健意识逐步增强，保健产品的需求量也日益加大。灵芝保健产品的开发成为目前研究的热点之一。

从灵芝子实体、菌丝体、孢子粉、发酵液中分离获得灵芝三萜、多糖，可用于保健品、美白抗衰类化妆品等功能产品的开发。灵芝不同类型材料中的三萜、多糖种类及含量存在差异，如子实体中三萜种类和含量最丰富，菌丝体中多糖、芝酮三醇、灵芝醇A含量较高。灵芝三萜和多糖提取及分离纯化方法的差异会制约灵芝三萜和多糖的开发利用。因此，笔者分析归纳灵芝三萜、多糖的不同提取及分离纯化方法，以期为其开发、利用提供理论指导。

1、灵芝三萜提取及分离纯化方法

1.1灵芝三萜提取方法

三萜类化合物广泛存在，因其具有抗菌、抗炎、抗肿瘤、抗病毒和免疫调节等多种药理活性而受到广泛关注。灵芝三萜多具脂溶特性，不易溶于水。如果只选择传统提取方法从灵芝的子实体以及孢子粉等材料中提取三萜类化合物，不仅花费时间较长、三萜得率较低，而且所提取的三萜类化合物结构也会由于提取方式不同而受到不同程度的破坏。因此，提取工艺需要综合考虑灵芝三萜的吸附力、蒸汽压、溶解度以及酶解和超声空化作用等特性，根据实际情况选择传统溶剂提取、超声波辅助、超临界萃取、微波辅助和微波-超声波协同等不同的提取方法[1]。

1.1.1灵芝子实体三萜提取方法

彭小芳等[2]基于超高效液相色谱-三重四级杆质谱联用（UPLC-MS-MS）定量检测法，对sd-2灵芝子实体中三萜类化合物热回流提取工艺进行优化改进：提取时间2.5 h，液（m L）料（g）比14∶1，乙醇体积分数75%，提取2次，所得三萜为11.859 1 mg/g。丁霄霄等[3]以灵芝子实体为原料，用复合酶提取灵芝总三萜的工艺为酶解处理90 min，温度50℃、p H5，酶解后的子实体继续用无水乙醇在80℃水浴中回流提取2 h，灵芝总三萜的得率为1.29%±0.04%。此方法简单、效率高，可以用于提取灵芝总三萜，但是试验只对复合酶提取灵芝总三萜工艺进行研究，而复合酶对灵芝总三萜成分组成是否有影响还有待进一步研究。李波等[4]以灵芝子实体为原料采用传统醇提法提取三萜，最佳条件为10倍无水乙醇，温度60℃，时间60 min，提取2次，三萜的提取率为0.76%，在此醇提法的基础上进行超声辅助，提取率可提高20.5%。马婧嘉等[5]在超声波协同半仿生法的研究中，优化提取灵芝子实体三萜工艺，在乙醇体积分数85%，液（m L）料（g）比30∶1，提取温度为60℃，超声时间30 min的条件下，灵芝三萜提取率为2.99%，该工艺提取率较高且稳定。徐树来等[6]优化超高压辅助提取灵芝三萜的工艺：液（m L）料（g）比20∶1，压力为350 MPa，保压时间7 min，乙醇体积分数90%，灵芝三萜得率为1.154%。

1.1.2灵芝菌丝体三萜提取方法

郑苗欣等[7]以灵芝菌丝体为原料，通过正交试验优化超声辅助的最佳工艺条件：乙醇体积分数为85%，液（m L）料（/g）比为30∶1，提取时间为30 min，灵芝菌丝体三萜的平均得率达3.50%。刘奇等[8]通过正交试验和Box-Behnken响应面设计法优化超声辅助提取灵芝菌丝体三萜工艺，得出超声辅助提取灵芝菌丝体总三萜正交试验最佳工艺为超声时间50 min，超声功率90 W,p H 8，液（m L）料（g）比40∶1，在此条件下灵芝菌丝体三萜平均提取率为0.76%；超声辅助提取灵芝菌丝体总三萜响应面试验最佳工艺为超声时间42 min，超声功率90 W,p H 8，液（m L）料（g）比30∶1，在此条件下，灵芝菌丝体总三萜平均提取率为1.09%。这两种提取工艺参数可靠，可为灵芝三萜工业化生产提供技术参考。

1.1.3灵芝孢子粉三萜提取方法

孢子粉包括未破壁孢子粉和破壁孢子粉。李康等[9]研究破壁灵芝孢子粉中总三萜的最佳提取工艺，优化提取工艺条件为乙醇体积分数95%，液（m L）料（g）比60∶1，在85℃条件下回流提取2 h，提取2次，总三萜的含量可达6.45%。崔馨戈等[10]以赤芝、紫芝破壁孢子粉（破壁率≥98%）为原料，采用超声辅助法优化后，赤芝破壁孢子粉超声提取最优方案：提取溶剂为无水乙醇，液（m L）料（g）比65∶1，提取温度42℃，提取时间60 min；紫芝破壁孢子粉超声提取最优方案：提取溶剂为无水乙醇，液（m L）料（g）比50∶1，提取温度40℃，提取时间42 min；采用超声辅助提取赤芝、紫芝孢子粉中的总三萜，相较于传统的溶剂浸提法和回流提取法，提取时间缩短且提取率提高，高效省时，原料利用率高，且不会因为提取温度太高而破坏有效成分，适用于工业生产。此外，温艳艳等[11]研究优化CO2超临界提取破壁灵芝孢子粉中三萜类成分工艺，最佳提取工艺：无水乙醇为提取溶剂，提取温度为50℃，液（m L）料（g）比为20∶1，提取时间为1.5 h，提取2次，三萜提取率最高为12.29%；为进一步分析灵芝破壁孢子粉在CO2超临界萃取孢子油前后三萜类成分含量差异提供理论依据和参考。

1.1.4灵芝发酵物三萜提取方法

刘海良等[12]利用有机溶剂萃取法，从树舌灵芝发酵液中的醇溶物、醇沉物提取灵芝酸，得率分别为0.022 mg/g、0.049 mg/g。高文庚等[13]、胡琼方等[14]分别采用回流法、超声波辅助法，从灵芝发酵粉中提取三萜类物质，其平均得率分别为0.676 0 mg/g、0.612 8 mg/g。

1.2灵芝三萜分离纯化方法

根据灵芝三萜类物质为醇溶性、弱酸性的特性，通常采用色谱法对其分离纯化，包括高效液相色谱（High performance liquid chromatography,HPLC）、高速逆流色谱（High speed counter current chromatogra‐phy,HSCCC）、大孔吸附树脂色谱（Macro-porous res‐in column chromatography）、柱层析（Column chroma‐tography）、薄层色谱分离纯化法（Thin-layer chroma‐tography）等。

高效液相色谱方法精密度高，分离纯化度高，稳定性和重复性好。梁锐等[15]采用优化后的HPLC纯化条件：以乙腈-乙酸水溶液（0.01%）为流动相梯度洗脱，流速为1.0 m L/min，柱温30℃，检测波长252 nm，从灵芝子实体水提物中分离纯化获得不同的灵芝酸单体。大孔吸附树脂色谱法具有高效简便、快捷、节约成本等优点，但不同类型的大孔树脂分离纯化三萜类化合物效果，存在较大的差异。钱竹[16]用大孔吸附树脂色谱AB-8吸附发酵液中灵芝三萜，在流速为2 m L/min，上样p H 2的条件下，吸附并纯化获得灵芝酸8.837 mg/g；祝朋玲等[17]利用HPD-500型大孔树脂吸附灵芝子实体总三萜，在上样液1.0 g/m L（干样），最大上样量2 BV，用8.5 BV的75%乙醇进行洗脱时，灵芝子实体总三萜纯度达60.59%。

由此可见，应根据具体需求选择适合的大孔树脂类型。HSCCC法可以在乙醇、石油醚提取的灵芝三萜粗提液中，纯化分离出灵芝酸S、T、B，并且将HSCCC与大孔吸附树脂HZ-816结合使用，可分离得到高纯度的灵芝酸F、C1、A、C2。半制备HPLC和薄层、硅胶柱层析法，可以用于分离纯化灵芝菌丝体中的灵芝酸Mc、TMk、Mf、S、R等灵芝酸单体。

2、灵芝多糖提取及分离纯化方法

2.1灵芝多糖提取方法

灵芝多糖是灵芝的主要活性成分之一，具有抗氧化、降血糖、抗肿瘤、免疫调节、降血脂与抗衰老等作用。灵芝多糖大多为杂多糖，虽不易溶于有机溶剂，但易溶于水。提取灵芝多糖的方式除了传统的热水和稀酸碱提取法外，还有微波、超声波、微波辅助超声波和超声波辅助碱提法等。采用不同提取方法提取多糖的得率及理化表征均不同，其分子量、单糖的化学及物理结构改变，会影响其抗氧化活性等特性。因而选择灵芝多糖的提取方法，应综合考虑该方法所提取的多糖产量及活性等是否满足要求。

2.1.1灵芝子实体多糖提取方法

灵芝子实体多糖存在于细胞内，采用传统的浸提方式提取灵芝多糖难度较大。李波等[4]采用超声波辅助提取的方法，将灵芝多糖的提取率提高13.2%。王锋等[18]采用优化后的超声辅助碱提取工艺：超声功率为105 W，超声时间为20 min，水浴提取温度为100℃，水浴时间为80 min，液（m L）料（g）比为40∶1，灵芝子实体中多糖提取率为传统水提法的三倍左右，多糖提取率为67.8 mg/g。孙小梅[19]综合考虑水浴回流法、加速溶剂萃取法、超声波辅助法以及微波辅助提取法的多糖得率、对多糖结构的破坏性、实际应用性等因素，最终选择采用超声波辅助法提取灵芝子实体多糖，并构建其指纹图谱。此外，张倩倩[20]研究表明，灵芝子实体菌盖、菌肉、菌管、菌柄，以及孢子粉（破壁和未破壁）多糖的含量有差异，破壁孢子粉的多糖含量较高，子实体组织中菌柄的多糖含量较高。

2.1.2灵芝菌丝体及孢子粉多糖提取方法

灵芝菌丝体生长较快，生产周期短，可用于集约化提取多糖。杨光成等[21]利用I2-DMSO溶液去除菌丝体从培养基中夹带的糖类物质，并用标准菌丝体进行校正，保证菌丝体中多糖的准确测定。訾鸿威[22]采用超高压技术同时进行灵芝孢子破壁与多糖的提取，提取剂在灵芝孢子细胞短时间内快速破裂的同时，将多糖带出胞外，在压力360 MPa，液（m L）料（g）比为25∶1，保压时间为4.5 min时，灵芝多糖得率为2.79%。

2.2灵芝多糖的分离纯化方法

灵芝多糖分离纯化方法有乙醇分级沉淀法、超滤膜分离法、离子交换层析法、凝胶层析法（分子筛层析法）等。李康强等[23]以分级醇沉方法从灵芝子实体水提物中分离出80%以上的灵芝多糖。

灵芝多糖结构极为复杂，多糖结构会因为灵芝多糖原料以及纯化方法的不同，而导致其结构的差异。刘艳芳等[24]采用乙醇沉淀和柱层析方法，分别从灵芝子实体、孢子粉中分离纯化获得免疫调节活性存在差异的β-葡聚糖。为了分离纯化出灵芝胞外多糖，在实际操作过程中往往会综合利用多种分离纯化方法。李平作等[25]利用蛋白酶法和Sevage法结合除去杂蛋白，然后经Sepharose CL-6B凝胶过滤色谱和DEAE-纤维柱层析，多糖回收率达78.2%。超滤膜分离法可以利用不同孔径的滤膜按照多糖分子质量初步分级，但分级精度不够高。杨祖金等[26]采用超滤膜分离法分离得到分子量6000 Da的灵芝多糖，纯度为73.5%。

3、展望

灵芝是极具药用价值的真菌，其三萜、多糖在医药领域和保健食品的开发有很大应用潜力。

灵芝三萜、多糖的提取，以及分离、纯化流程优化，多种方法联合提高灵芝三萜、多糖的提取率，降低生产成本，仍是现阶段研究的难点，也是未来的研究方向。同时应加强灵芝三萜、多糖的结构与生物活性、作用机理、医疗保健开发等的研究。

参考文献:

[1]赵佳敏,陈泓鑫,林宇冲,等.灵芝三菇的提取工艺及其抗氧化研究进展[J.安傲化工,2021,47(1):11-12;16.

[2]彭小芳,程池露,唐庆九,等.基于UPLC-MSIMS定量检测法优化灵芝三菇热回流提取工艺的研究[J].菌物学报,2021,40(9);2480-2494.

[3]丁霄霄,李凤伟,余晓红.响应面法优化复合酶提取灵芝总三菇工艺[J].食品工业,2018,39(8):40-44.

[4]李波,张亚茹,周娅丽,等.灵芝三砧和多糖提取工艺研究[J].食用菌,2022,44(2):54-57.

[5]马婧嘉,李雅茹,张文隽,等.超声波协同半仿生法提取灵芝三菇工艺优化[J].食用菌,2022,44(6):66-68.

[6]徐树来,徐瑶,尤婷婷,等.超高压辅助提取灵芝三赭的工艺优化及抗氧化活性评价[J].食品工业科技,2022,43(20):274-280.

[7]郑苗欣,张振伟,王雪婷,等.灵芝三菇提取工艺优化[J].中国食用菌,2022,41(4):64-68.

基金资助:聊城市重点研发计划(农业良种工程)项目(2021LZ01);