灯盏细辛为菊科植物短葶飞蓬Erigeron breviscapus (Vant.) Hand.-Mazz.的干燥全草，又名灯盏花、灯盏草。灯盏细辛始载于《滇南本草》，该植物味辛、微苦，性温，归心、肝经；具有活血通络止痛，祛风散寒等功效；用于治疗中风偏瘫、胸痹心痛、风湿痹痛、头痛、牙痛等病症[1]。灯盏细辛中主要含有咖啡酰酯类、黄酮类、挥发油类和香豆素类等成分[2]。现代药理学研究表明，灯盏细辛乙醇提取物具有较强的自由基清除能力[3]。灯盏细辛中的单体化合物具有广泛的药理作用如灯盏乙素、黄芩素具有神经保护作用[4,5]，灯盏乙素还可以保护心脑血管[6]和抑制癌细胞的转移和侵袭[7]。本研究对灯盏细辛80%甲醇提取物进行化学成分研究，利用NKA-2大孔树脂柱色谱、中压制备色谱、高压制备色谱等方法，从中分离得到4个化合物，分别鉴定为反式-4-咖啡酰氧基-3-羟基-6-咖啡酰氧甲基-7,8-二氧杂环[3.2.1]辛烷-1-羧酸（trans-4-caffeoyloxy-3-hydroxy-6-caffeoyloxymethyl-7,8-dioxabicyclo[3.2.1]octane-1-carboxylic acid,1）、异绿原酸A(isochlorogenic acid A,2）、绿原酸（chlorogenic acid,3）、新绿原酸（neochlorogenic acid,4），结构见图1。其中化合物1为1个新的咖啡酰酯类化合物，命名为新飞蓬酯乙；细胞活性筛选显示，化合物1具有较好的胶质母细胞瘤细胞和结肠癌细胞抑制活性。

图1 化合物1～4的结构  

1、仪器与材料

Bruker AV-600 MHz型核磁共振仪（BrukerBiospin公司）；Nicolet i S10型傅里叶红外光谱仪（美国Thermo Fisher Scientific公司）；1901PC型紫外可见分光光度计（上海棱光技术有限公司）；Orbitrap Exploris 240质谱仪（美国Thermo Fisher Scientific公司）；中压制备色谱仪（三泰科技常州有限公司）；高压制备色谱仪（上海纯华生物科技有限公司）；RE-52A型旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂）；SHB-III型循环水式多用真空泵（北京中兴伟业有限公司）；十万分之一电子分析天平（赛多利斯公司）；C18色谱柱（250 mm×4.6 mm,5μm，美国Thermo Fisher Scientific公司）；XB-C18色谱柱（250 mm×21.2 mm,5μm，月旭科技上海股份有限公司）；Free Zone型冷冻干燥机（美国LABCONCO公司）；NKA-2型大孔树脂（天津南开和成科技有限公司）；提取分离所用溶剂如无水乙醇、甲醇为分析纯，乙腈为色谱纯，水为超纯水；替莫唑胺（批号T2577）购自德国默克公司。

人胶质瘤U87细胞、人结肠癌HT29细胞和人胶质瘤A172细胞均购于武汉普诺赛生命科技有限公司。

灯盏细辛药材购买于安徽毫州（批号J2304C1659，津皖制药有限责任公司），经北京中医药大学刘勇教授鉴定为菊科植物短葶飞蓬E.breviscapus (Vant.) Hand.-Mazz.的干燥全草。

2、提取与分离

取灯盏细辛药材2 kg，加入80%甲醇10 L，浸泡5 d。滤液减压浓缩，浓缩液减压干燥成干浸膏（560 g）。干浸膏水分散后，用NKA-2大孔树脂进行成分富集，乙醇-水（0∶100→100∶0）梯度洗脱，合并相同流分，分别得到6个组分Fr.1～6。Fr.4经旋转蒸发仪减压浓缩和真空干燥箱干燥成干浸膏（9.4 g）。干浸膏以适当溶剂溶解后，在HPLC跟踪下经中压制备色谱进行分离和纯化，在327 nm的检测波长下，用10%甲醇平衡色谱柱（装填30μm ODS填料，80 g)15 min后上样，然后用甲醇-水（10∶90→70∶30）梯度洗脱，得到7个组分Fr.4-1～4-7。Fr.4-7浓缩，静置后滤过除去析出物，滤液经高压制备色谱进一步纯化，以乙腈-0.3%磷酸水（30∶70）为流动相洗脱，得到化合物1～4的溶液。将上述溶液减压浓缩，浓缩液分别经中压制备色谱除磷酸，在327 nm的检测波长下，用10%甲醇平衡色谱柱（装填30μm ODS填料，40 g)15min后上样，然后用10%甲醇等度洗脱15 min，除去磷酸，再用95%甲醇洗脱。洗脱液经减压浓缩，冷冻干燥得到化合物1(20.3 mg,t R=24.05 min）、2(15.3mg,t R=19.91 min）、3(55.4 mg,t R=3.99 min）、4(64.0 mg,t R=4.31 min）。

3、结构鉴定

化合物1：黄色粉末。[α]D23+37.1 (c 0.9,Me OH);UVλmaxMe OH(nm):323、303、246。HR-ESI-MS m/z545.128 85[M+H]+（理论值545.128 97），确定该化合物的分子式为C26H24O13，计算不饱和度为15。IRνKmaxBr(cm-1):3 423.73、1 685.70、1 630.46，提示含有羟基、酯羰基和羰基。

在1H-NMR (600 MHz,Me OD)谱（表1）中，显示2组相近的苯环上3个芳氢的ABX偶合信号[δH 6.98,6.91 (各1H,d,J=2.1 Hz,H-9′,9′′),6.87,6.76 (各1H,dd,J=8.2,2.1 Hz,H-5′,5′′),6.68,6.68(各1H,d,J=8.2 Hz,H-6′,6′′)]；2个双键烯氢信号[δH 7.56,7.44 (各1H,d,J=15.9 Hz,H-3′,3′′),6.21,6.16 (各1H,d,J=15.9 Hz,H-2′,2′′)]；2个亚甲基氢信号[δH 4.99 (1H,dd,J=14.4,6.5 Hz,H-9a),4.85(1H,dd,J=14.4,2.3 Hz,H-9b),2.38 (1H,dd,J=15.1,5.2 Hz,H-2b),2.32 (1H,d,J=15.1 Hz,H-2a)]和4个次甲基氢信号[δH 4.32 (1H,t,J=5.2 Hz,H-3),5.16(1H,t,J=5.2 Hz,H-4),4.73 (1H,t,J=4.2 Hz,H-5),4.45 (1H,td,J=6.6,4.2 Hz,H-6)]。同样，在13C-NMR(150 MHz,Me OD)谱（表1）中，显示存在2个苯环[δC 127.7 (C-4′),123.4 (C-5′),116.6 (C-6′),149.9(C-7′),148.0 (C-8′),115.4 (C-9′),127.7 (C-4′′),123.3(C-5′′),116.5 (C-6′′),149.7 (C-7′′),147.5 (C-8′′),115.2(C-9′′)]、2个双键[δC 114.7 (C-2′),146.9 (C-3′),114.5(C-2′′),146.8 (C-3′′)]、3个羰基碳[δC 170.7 (C-10),169.1 (C-1′),168.0 (C-1′′)]、2个亚甲基[δC 64.1(C-9),41.1 (C-2)]、4个次甲基[δC 80.2 (C-6),76.6(C-5),71.7 (C-4),64.3 (C-3)]和1个季碳δC 105.3(C-1)。  

表1 化合物1的1H-NMR和13C-NMR数据(600/150MHz,Me OD)  

HSQC谱中，δH 7.56 (1H,d,J=15.9 Hz,H-3′)、7.44 (1H,d,J=15.9 Hz,H-3′′)分别与C-3′(δC146.9)、C-3′′(δC 146.8)直接相关；δH 6.98 (1H,d,J=2.1 Hz,H-9′)、6.91 (各1H,d,J=2.1 Hz,H-9′′)分别与C-9′(δC 115.4)、C-9′′(δC 115.2)直接相关；δH6.87 (1H,dd,J=8.2,2.1 Hz,H-5′)、6.76 (1H,dd,J=8.2,2.1 Hz,H-5′′)分别与C-5′(δC 123.4)、C-5′′(δC123.3)直接相关；δH 6.68 (1H,d,J=8.2 Hz,H-6′)、6.68 (1H,d,J=8.2 Hz,H-6′′)分别与C-6′(δC 116.6)、C-6′′(δC 116.5)直接相关；δH 6.21 (1H,d,J=15.9Hz,H-2′)、6.16 (1H,d,J=15.9 Hz,H-2′′)分别与C-2′(δC 114.7)、C-2′′(δC 114.5)直接相关；δH 5.16 (1H,t,J=5.2 Hz,H-4)与C-4 (δC 71.7)直接相关；δH 4.73(1H,t,J=4.2 Hz,H-5)与C-5 (δC 76.6)直接相关；δH 4.45 (1H,td,J=6.6,4.2 Hz,H-6)与C-6 (δC 80.2)直接相关；δH 4.32 (1H,t,J=5.2 Hz,H-3)与C-3 (δC64.3)直接相关；δH 2.32 (1H,d,J=14.9 Hz,H-2a)、2.38 (1H,dd,J=15.1,5.2 Hz,H-2b)与C-2 (δC 41.1)直接相关。

HMBC谱（图2）中显示，δH 7.56 (1H,d,J=15.9 Hz,H-3′)与C-5′(δC 123.4)、C-9′(δC 115.4),δH7.44 (1H,d,J=15.9 Hz,H-3′′)与C-5′′(δC 123.3)、C-9′′(δC 115.2),δH 6.21 (1H,d,J=15.9 Hz,H-2′)与C-4′(δC 127.7)、C-1′(δC 169.1),δH 6.16 (1H,d,J=15.9 Hz,H-2′′)与C-4′′(δC 127.7)、C-1′′(δC 168.0)相关。1H-1H COSY谱（图2）中显示，δH 6.21 (1H,d,J=15.9 Hz,H-2′)与δH 7.56 (1H,d,J=15.9 Hz,H-3′)，δH 6.16 (1H,d,J=15.9 Hz,H-2′′)与δH 7.44 (1H,d,J=15.9 Hz,H-3′′)相关。以上NMR数据表明，该化合物由2条咖啡酰基团B和C以及母核A组成，初步推断为咖啡酰酯类化合物。

图2 化合物1的HMBC和1H-1H COSY相关   

通过查阅文献，发现其NMR数据与文献报道的化合物飞蓬酯乙[8]相似。不同之处在于化合物中C-3 (δC 64.3)和C-4 (δC 71.7)、δH 4.32 (1H,t,J=5.2Hz,H-3)和δH 5.16 (1H,t,J=5.2 Hz,H-4)信号与飞蓬酯乙存在明显差异。咖啡酰基团取代会使质子因酰化移位效应向低场方向移动。1H-1H COSY谱中，可以直接确定δH 2.38 (1H,dd,J=15.1,5.2 Hz,H-2b),2.32 (1H,d,J=14.9 Hz,H-2a)与δH 4.32 (1H,t,J=5.2 Hz,H-3)相关，δH 4.32 (1H,t,J=5.2 Hz,H-3)与δH 5.16 (1H,t,J=5.2 Hz,H-4)相关，δH 4.73 (1H,t,J=4.2 Hz,H-5)与δH 5.16 (1H,t,J=5.2 Hz,H-4)相关，其中δH 5.16 (1H,t,J=5.2 Hz,H-4)信号较δH4.32 (1H,t,J=5.2 Hz,H-3)信号位于低场，可以推断出新化合物中咖啡酰基团B取代在C-4 (δC 71.7)位上。HMBC谱中δH 5.16 (1H,t,J=5.2 Hz,H-4)与C-3 (δC 64.3)、C-5 (δC 76.6)相关，δH 4.45 (1H,td,J=6.6,4.2 Hz,H-6)与C-4 (δC 71.7)相关也支持了这一点。在确定了平面结构后考虑化合物的相对构型，在与化合物1结构极其相似的已知化合物飞蓬酯乙[8]中，H-3和H-4(J=5.1 Hz）为反式构型，由此判断化合物1中H-3和H-4的相对构型。若H-3、H-4为顺式相对构型，则H-3、H-4的二面角角度更大，偶合常数在0～2 Hz。而H-3和H-4的偶合常数为5.2 Hz，与飞蓬酯乙中H-3和H-4的偶合常数接近，由此推断H-3、H-4为反式相对构型。根据以上分析确定了该化合物的结构为反式-4-咖啡酰氧基-3-羟基-6-咖啡酰氧甲基-7,8-二氧杂环[3.2.1]辛烷-1-羧酸。经文献检索确定该化合物为新化合物，命名为新飞蓬酯乙。

化合物2：淡黄色粉末。HR-ESI-MS m/z516.1261 1[M+H]+（理论值516.126 23）。1H-NMR(600 MHz,Me OD) δ:7.58 (1H,d,J=15.9 Hz,H-7′),7.54 (1H,d,J=15.9 Hz,H-7″),7.03 (1H,d,J=2.0 Hz,H-2′),7.02 (1H,d,J=2.0 Hz,H-2″),6.97 (2H,dd,J=8.2,2.0 Hz,H-6′,6″),6.75 (1H,d,J=8.2 Hz,H-5′),6.74 (1H,d,J=8.2 Hz,H-5″),6.31 (1H,d,J=15.9 Hz,H-8′),6.23 (1H,d,J=15.9 Hz,H-8″),5.39 (1H,m,H-5),5.35 (1H,m,H-3),3.94 (1H,dd,J=7.4,3.3 Hz,H-4),2.28 (1H,m,H-6a),2.23～2.16 (2H,m,H-2),2.13(1H,m,H-6b);13C-NMR (150 MHz,Me OD) δ:177.5(C-7),169.0 (C-9′),168.5 (C-9″),149.7 (C-4′),149.6(C-4″),147.4 (C-3′),147.2 (C-3″),146.9 (C-7′,7″),128.1 (C-1′),127.9 (C-1″),123.2 (C-6′),123.1 (C-6″),116.6 (C-5′,5″),115.7 (C-2′),115.4 (C-2″),115.3 (C-8′),115.2 (C-8″),74.8 (C-1),72.7 (C-3),72.7 (C-5),72.2 (C-4),37.7 (C-6),36.1 (C-2)。以上数据与文献报道基本一致[9]，故鉴定化合物2为异绿原酸A。

化合物3：淡黄色粉末。HR-ESI-MS m/z354.094 41[M+H]+（理论值354.094 53）。1H-NMR(600 MHz,Me OD) δ:7.52 (1H,d,J=15.9 Hz,H-7′),7.01 (1H,d,J=2.1 Hz,H-2′),6.92 (1H,dd,J=8.3,2.0Hz,H-6′),6.74 (1H,d,J=8.1Hz,H-5′),6.22 (1H,d,J=15.9 Hz,H-8′),5.29 (1H,m,H-3),4.13 (1H,m,H-5),3.69 (1H,dd,J=8.5,3.1 Hz,H-4),2.22～1.98 (4H,m,H-2,6);13C-NMR (150 MHz,Me OD) δ:177.1 (C-7),168.8 (C-9′),149.7 (C-4′),147.2 (C-7′),147.0 (C-3′),127.9 (C-1′),123.1 (C-6′),116.6 (C-2′),115.4 (C-8′),115.3 (C-5′),76.3 (C-1),73.6 (C-3),72.1 (C-4),71.4 (C-5),38.9 (C-6),38.4 (C-2)。以上数据与文献报道基本一致[10]，故鉴定化合物3为绿原酸。

化合物4：白色粉末。HR-ESI-MS m/z 354.094 43[M+H]+（理论值354.094 53）。1H-NMR (600 MHz,Me OD) δ:7.55 (1H,d,J=15.9 Hz,H-7′),7.01 (1H,d,J=2.0 Hz,H-2′),6.90 (1H,dd,J=8.2,2.0 Hz,H-6′),6.73 (1H,d,J=8.1 Hz,H-5′),6.27 (1H,d,J=15.9 Hz,H-8′),5.31 (1H,m,H-5),4.12 (1H,m,H-3),3.60 (dd,J=8.6,3.4 Hz,1H,H-4),2.19～1.92 (4H,m,H-2,6);13C-NMR (150 MHz,Me OD) δ:178.3 (C-7),169.0 (C-9′),149.4 (C-4′),146.8 (C-7′),146.8 (C-3′),128.0 (C-1′),122.9 (C-6′),116.4 (C-5′),115.8 (C-8′),115.1 (C-2′),75.4 (C-1),74.8 (C-5),73.0 (C-4),68.3 (C-3),41.5(C-2),36.7 (C-6)。以上数据与文献报道基本一致[11]，故鉴定化合物4为新绿原酸。

4、化合物1的活性研究

4.1 对U87细胞的抗肿瘤活性

采用CCK-8法测定化合物1对U87细胞的抗肿瘤活性，替莫唑胺为阳性药。结果（图3）显示，化合物1对U87细胞随着浓度增加，细胞存活率大幅下降，半数抑制浓度（half inhibitory concentration,IC50）值为（13.31±0.77）μmol/L；替莫唑胺对U87细胞的IC50值为（11.33±1.05）μmol/L。表明化合物1具有较好的抗胶质母细胞瘤活性。

图3 化合物1对U87细胞的细胞毒活性  

4.2 对HT29细胞的抗肿瘤活性

采用CCK-8法测定化合物1对HT29细胞的抗肿瘤活性，替莫唑胺为阳性药。结果（图4）显示，化合物1对HT29细胞随着浓度增加，细胞存活率大幅下降，IC50值为（14.83±0.92）μmol/L；替莫唑胺对HT29细胞的IC50值为（11.97±0.82）μmol/L。表明化合物1具有较好的抗结肠癌活性。

图4 化合物1对HT29细胞的细胞毒活性

4.3 抗肿瘤活性机制探讨

对化合物1的抗肿瘤机制进行深入研究，发现化合物1可以诱导A172细胞发生肿胀（图5），随着时间的延长细胞膜破裂并观察到气泡的产生，这可能是由膜穿孔导致的细胞死亡。化合物1诱导肿瘤细胞死亡的机制值得后期进一步探索研究。

5、讨论

灯盏细辛所含化学成分复杂，药理作用广泛。主要用于治疗心脑血管疾病，可以止胸痹心痛、头痛、风湿痹痛、牙痛等，同时还具有神经保护、抗氧化、清除自由基、抗癌、抗炎等作用。本课题组对灯盏细辛的化学成分进行研究，分离鉴定了4个化合物，其中化合物1为新化合物。该化合物具有独特的结构骨架，由2条咖啡酰基团和母核组成。2条咖啡酰基团可以通过1H-NMR和13C-NMR谱中显示的2组特征峰信号鉴别，母核的结构可以通过以1个连有含氧官能团的质子基团为研究起点，结合1H-1H COSY谱、HMBC谱、HSQC谱提供的H-H、H-C相互关联的信息进行结构推导。化合物1中关键的2条咖啡酰基团结合位点的确定，是通过1H-1H COSY谱提供的质子相互关联信息初步推断以及HMBC谱提供的H-C远程相关信息进一步佐证实现的。这表明2D NMR在复杂化合物的结构鉴定中起着至关重要的作用。

图5 化合物1诱导A172细胞胀破死亡

对化合物1的抗肿瘤活性进行了测试，结果表明化合物1在低浓度（低于15μmol/L）下对U87细胞和HT29细胞活性具有明显的抑制作用。进一步研究发现其抗肿瘤活性与肿瘤细胞的裂解性死亡有关，化合物1可以诱导肿瘤细胞肿胀至膜破裂死亡，具体的分子机制值得进一步深入研究。

本研究确定了新化合物新飞蓬酯乙的结构，为一步阐明灯盏细辛的药效物质基础提供了帮助。生物活性测试表明该新化合物具有较好的抗胶质母细胞瘤和结肠癌活性，丰富了灯盏细辛在抗肿瘤方面的药理作用，临床转化前景广阔。

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基金资助:国家自然科学基金青年科学基金项目(82374076);国家自然科学基金青年科学基金项目(81703744); 北京市自然科学基金青年项目(7244493); 北京市科学技术协会2023-2025年度青年人才托举工程项目(BYESS2023354); 中国中医科学院中药研究所国家自然科学基金培育专项(ZXKT23003); 北京中医药大学实验技术(操作规程)标准化研究项目(2023-syjs-01);

文章来源:陈恒,王春国,饶沁玲,等.灯盏细辛中1个新咖啡酰酯类化合物的分离鉴定及抗肿瘤活性研究[J].中草药,2024,55(14):4650-4655.