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苦豆碱抑制胃癌HGC-27细胞和AGS细胞增殖的作用机制

2024-09-23 93 上传者：管理员

摘要：目的探讨苦豆碱（Aloperine,ALO）抑制胃癌HGC-27细胞、AGS细胞增殖的作用机制。方法用不同浓度ALO处理胃癌HGC-27细胞、AGS细胞。应用细胞毒性实验、细胞增殖实验和平板克隆实验评估增殖活性，应用划痕实验评估迁移与修复能力，应用侵袭实验检测迁移和侵袭能力，使用流式细胞术分析细胞周期变化情况，应用实时荧光定量聚合酶链反应实验测定GSPT1、CDK4、Cyclin D1和Caspase-3、Caspase-9、Bax、Bcl-2的mRNA表达水平，应用蛋白印迹实验评估GSPT1和Caspase-3、Caspase-9、Bax及Bcl-2的蛋白表达水平。结果细胞毒性、细胞增殖以及平板克隆实验结果显示，ALO抑制胃癌HGC-27细胞、AGS细胞增殖并呈现浓度依赖性：与对照组相比，用0.1 mM和0.25 mM ALO处理的HGC-27细胞、AGS细胞的增殖能力下降。划痕实验结果显示，ALO抑制了HGC-27细胞、AGS细胞的迁移修复能力。细胞侵袭检测结果显示，经ALO处理后的HGC-27细胞、AGS细胞的迁移、侵袭能力受到抑制。流式细胞术结果显示，经ALO作用后的HGC-27细胞、AGS细胞的周期发生变化。实时荧光定量聚合酶链反应实验和蛋白印迹实验结果显示，与对照组相比，经药物处理后的HGC-27细胞、AGS细胞中的GSPT1、Bcl-2、CDK4、Cyclin D1表达水平降低，Caspase-3、Caspase-9、Bax表达水平升高。结论 ALO可以通过调节GSPT1和Caspase-3、Caspase-9、Bax、Bcl-2的表达水平来抑制胃癌HGC-27细胞、AGS细胞的增殖。

关键词：
AGS
AlO
HGC-27
抑制
苦豆碱
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以往的研究认为，苦豆碱（Aloperine,ALO）的作用仅为抗炎、抗过敏、抗病毒活性[1-3]。最近的证据[4-8]表明，ALO还具有抗肿瘤活性[6-8]，但机制不明。本研究探讨ALO抑制胃癌HGC-27细胞、AGS细胞增殖的作用机制。

1、材料与方法

1.1 材料

人胃癌HGC-27细胞、AGS细胞购自武汉普诺赛公司。ALO购自MCE公司；特级胎牛血清、DMEM培养基购自武汉普诺赛公司；CCK8检测试剂盒和碘化丙锭（PI）试剂盒购自Elabscience公司；蛋白定量试剂盒购自Thermo公司；快速制胶试剂盒购自武汉塞维尔公司；PVDF膜、ECL超敏型发光液、抗体购自武汉三鹰公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养

将HGC-27细胞、AGS细胞复苏后接种于含10%胎牛血清和1%青霉素、1%链霉素的DMEM培养基中，置培养箱（37℃，5%CO2）培养（24 h换液1次）。细胞密度介于70%～80%时传代，取对数生长期细胞用于实验。

1.2.2 细胞活力测定

计数HGC-27细胞、AGS细胞，接种到96孔板中（5×103个/孔），置培养箱过夜，细胞密度介于70%～80%时加入不同剂量（0.00 m M、0.10 m M、0.25 m M)ALO的培养基。24 h后，向每个孔中加入10μL CCK-8溶液孵育（37℃，1 h）。使用酶标仪测量450 nm处的吸光度。重复测定3次取均值。

1.2.3 细胞增殖实验

将处于对数生长期的HGC-27细胞、AGS细胞接种在24孔板中用药物处理24 h。配置EDU工作液，将预热（37℃）的工作液（20μM）等体积加入24孔板中，置培养箱（37℃）继续培养2 h。用EDU标记后去除培养液，固定，洗涤，做通透化处理，检测EDU。在倒置荧光显微镜（40倍）下以拍照方式记录胃癌HGC-27细胞、AGS细胞中的阳性荧光表达（绿色）情况。然后使用DAPI试剂对细胞核染色，并在倒置荧光显微镜（40倍）下观察染色情况。

1.2.4 平板克隆实验

将各200个HGC-27细胞、AGS细胞接种到含有完全培养基（2 m L）的小皿中。为了均匀分布细胞，在细胞接种后缓慢旋转培养皿1 min。待细胞贴壁后，更换不同剂量（0.00 m M、0.10 m M、0.25 m M)ALO的培养基。48 h后，更换新鲜培养基。在培养过程中观察细胞生长状态及密度，培养基每两天更换一次。14天后，用4%多聚甲醛固定细胞后用0.1%结晶紫染色（10 min），然后在倒置显微镜（40倍）下观察细胞的集落形成情况。

1.2.5 细胞周期实验

取对数生长期HGC-27细胞、AGS细胞，接种到中皿，待细胞贴壁后，更换不同剂量（0.00 m M、0.10 m M、0.25 m M)ALO的培养基。24 h后收集约5×105个细胞，离心（1 000 r/min,5 min），洗涤（PBS），离心（1 000 r/min,5 min），弃上清液，加入0.3 m L的PBS重悬细胞；加入1.2 m L预冷（-20℃）的无水乙醇充分混匀后置冰箱（-20℃，1 h）；离心（1 000 r/min,5 min），弃上清液，用PBS重悬细胞后在室温下放置15 min；加入100μL的RNase A Reagent并使细胞充分悬浮，水浴（37℃，30 min）后加入400μL的PI Reagent(50μg/m L）并充分混匀，避光孵育（2℃～8℃，30 min），上机检测。

1.2.6 划痕实验

将HGC-27细胞（2×106个/孔）、AGS细胞（2×106个/孔）接种在6孔板中。在细胞密度接近100%时，使用200μL移液器吸头在板上划痕，然后用PBS洗涤细胞。向细胞中加入不同剂量（0.00 m M、0.10 m M、0.25 m M)ALO的培养基孵育24 h。用倒置显微镜分别在0 h、24 h、48 h时以4倍放大倍率拍摄划痕区域。

1.2.7 细胞侵袭实验

将基质胶解冻（4℃）后，与无血清培养基以1∶8的比例稀释，并将100μL稀释的基质胶均匀接种到上腔室中，在静置（37℃）0.5 h～1 h时形成凝胶。将HGC-27细胞（4×104个/孔）、AGS细胞（4×104个/孔）在上腔室中接种到100μL无血清培养基中，同时将500μL含有20%FBS的培养基作为化学引诱剂加入下腔室中。用棉签擦除在37℃下孵育16 h～18 h后残留在小室上表面的细胞，上腔室下表面的细胞为迁移、侵袭细胞。将迁移或侵入到上腔室下表面的细胞用4%多聚甲醛固定，用10%结晶紫染色，洗去结晶紫染液后，在倒置显微镜（40倍）下选取5个视野观察细胞并计数。

1.2.8 实时荧光定量聚合酶链反应实验

HGC-27细胞、AGS细胞的总RNA通过TRIzol试剂分离，随后使用RNA逆转录试剂逆转录成c D-NA。将c DNA、SYBR Green和无酶水及基因引物组成的q RT-PCR反应液加入8联管中，放入Roche仪中。反应条件设定如下：95℃，预变性2 min;95℃，变性5 s;58℃，退火/延伸15 s，共40个循环。以GAPDH为内参，计算2-△△Ct作为相对表达量来标示m RNA。合成引物的具体序列见表1。

表1 引物序列

1.2.9 蛋白印迹实验

收集经ALO处理24 h的HGC-27细胞、AGS细胞，用预冷（4℃）的PBS洗涤2次，加入补充有蛋白酶抑制剂混合物的RIPA试剂裂解细胞，在冰上孵育30 min后离心（4℃，14 000 r/min,15 min），用BCA蛋白测定试剂盒对蛋白进行定量，然后高温煮沸。使用12%SDS-PAGE分离蛋白，然后转移到活化的PVDF膜上。在室温下用5%脱脂牛奶封闭2 h后孵育一抗（4℃，过夜），转变条件（37℃，2 h）继续孵育二抗，用ECL发光液增强荧光信号，并使用Gel Doc™XR+成像系统（BIO-RAD,USA）检测蛋白条带。

1.2.10 统计学分析

所有数据均通过SPSS 28.0统计软件、Grapad Prism8.0统计软件处理，计量资料用±s表示。多组间比较采用单因素方差法分析组间差异。以P≤0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1 ALO抑制胃癌细胞的增殖

将胃癌HGC-27细胞、AGS细胞在不同浓度的ALO中处理24 h，使用细胞毒性实验评估ALO对胃癌细胞生长的抑制作用。结果表明，ALO在HGC-27细胞、AGS细胞中都表现出剂量依赖性（P<0.05,P<0.05）（表2，表3）。测定HGC-27细胞、AGS细胞的IC50值分别为0.28 m M、0.10 m M。此外，细胞增殖实验结果显示，在各自的IC50浓度下，HGC-27细胞、AGS细胞的增殖受到抑制（图1A，图1B）。此外，给予ALO药物处理后，HGC-27细胞、AGS细胞中的集落灶均减少（P<0.05,P<0.05）（图1C，表4）。

图1 ALO抑制胃癌HGC-27细胞、AGS细胞增殖图

表2 ALO对HGC-27细胞活性的影响（细胞毒性实验）/±s

表3 ALO对AGS细胞活性的影响（细胞毒性实验）/±s

表4 ALO对HGC-27细胞和AGS细胞活性的影响/克隆形成实验/±s

2.2 ALO阻滞胃癌细胞周期

用流式细胞术评估ALO对细胞周期分布的影响。最初，观察到用ALO处理的HGC-27细胞组、AGS细胞组进入停滞状态。如图2所示，对照组的细胞进展到G1期，而0.10m M ALO组的细胞保持在G2/M期（P<0.05,P<0.05）（表5，表6）。

图2 细胞周期图

表5 ALO对HGC-27细胞和AGS细胞活性的影响/克隆形成实验/±s

表6 ALO对AGS细胞周期的影响/细胞周期实验/±s

2.3 ALO抑制胃癌HGC-27细胞、AGS细胞的迁移、侵袭

通过细胞侵袭实验测定ALO对HGC-27细胞、AGS细胞迁移、侵袭的影响。结果显示，经ALO处理后抑制了HGC-27细胞和AGS细胞的迁移（P<0.05,P<0.05。图3A，图3B，表7）。当用浓度为0.10m M、0.25 m M的ALO处理时，与对照组相比，HGC-27细胞、AGS细胞的迁移数量减少（P<0.05,P<0.05）（图3C，表8）。此外，经ALO处理后，这些细胞的侵袭能力也下降（P<0.05,P<0.05。图3D，表8）。

图3 ALO抑制HGC-27细胞和AGS细胞的迁移、侵袭

表7 ALO对HGC-27细胞和AGS细胞伤口愈合能力的影响/划痕实验/±s

表8 ALO对HGC-27细胞和AGS细胞迁移及侵袭能力的影响/细胞侵袭实验/±s

2.4 ALO上调Caspase-3、Caspase-9和Bax的表达水平，下调GSPT1、Bcl-2的表达水平

经ALO作用24 h后导致Caspase-3、Caspase-9、Bax蛋白水平升高，GSPT1蛋白水平下降（图4）。此外，经ALO处理后，Caspase-3、Caspase-9、Bax的m RNA水平升高（P<0.05,P<0.05,P<0.05）。同时，Bcl-2、GSPT1、CDK4、Cyclin D1的m RNA水平下降（P<0.05,P<0.05,P<0.05,P<0.05）（表9，表10）。

图4 GSPT1、Caspase-3、Caspase-9、Bax、Bcl-2蛋白表达图

表9 ALO对胃癌HGC-27细胞相关因子m RNA水平表达的影响/实时荧光定量聚合酶链反应实验/±s

表10 ALO对AGS细胞相关因子m RNA水平表达的影响/实时荧光定量聚合酶链反应实验/±

3、讨论

化疗药物治疗晚期胃癌的有效率超过50%，但耐药性问题无法回避，使肿瘤治疗进一步复杂化[9-10]。因此，迫切需要开发新的治疗药物。从植物中提取的天然化合物已经成为解决耐药性问题的有效方法[11-13]。中药由于具有多成分、多环节和多靶点的特点，能够调节多个基因，解决复杂的肿瘤治疗过程[14]。

ALO是一种从苦豆子中提取的生物碱。苦豆子属豆科植物，已证实对多种肿瘤细胞有对抗作用[15,16]。研究表明，ALO能够阻滞肿瘤细胞的细胞周期，并影响与细胞周期相关的蛋白的表达[17]。本研究观察到经ALO处理24 h后的胃癌HGC-27细胞、AGS细胞周期发生改变。GSPT1是真核生物肽链释放因子家族的一员，在多种生物学过程中发挥作用。有研究表明，GSPT1可促进非小细胞肺癌细胞的增殖、侵袭和迁移[18,19]。此外，GSPT1的过度表达也有可能作为一种致癌因素[20]。本研究发现，在用ALO处理胃癌细胞24 h后，HGC-27细胞、AGS细胞中的GSPT1表达水平降低。同时，本研究结果显示，用ALO处理后，细胞周期停滞：ALO可能通过下调GSPT1诱导细胞周期停滞。

癌症转移的过程错综复杂，涉及多个步骤。最初的步骤被称为“侵袭”，包括癌细胞从原发肿瘤中分离并浸润到周围的基质中。蛋白水解已被确定为胃癌侵袭的一个关键的翻译后调控机制[21,22]。然而，侵袭的确切机制和关键因素仍不完全清楚。本研究旨在探讨ALO对胃癌HGC-27细胞、AGS细胞增殖的影响。细胞毒性实验结果显示，不同浓度ALO抑制胃癌细胞增殖的效果呈剂量依赖关系。此外，以前的研究发现[23],ALO具有抑制人乳腺癌细胞增殖、迁移和侵袭的能力。为了证实这些发现，对HGC-27细胞、AGS细胞进行了划痕实验和细胞侵袭实验。结果显示，经ALO处理后的HGC-27细胞、AGS细胞的迁移、侵袭能力均受到抑制。本研究的平板克隆实验和侵袭实验结果也表明，ALO抑制HGC-27细胞、AGS细胞的增殖、迁移和侵袭能力。

Bcl-2在胃癌中的上调可抑制细胞凋亡[24]。细胞凋亡是一个程序性死亡过程，可以通过外源性和内源性途径诱导。肿瘤耐药主要归因于抗凋亡途径的激活和肿瘤细胞对化疗药物引发的对细胞凋亡的不同敏感性。本研究观察到与凋亡相关的标志物的蛋白水平上调。这一发现与CHEN的研究结果一致[25]。ALO在人骨肉瘤中诱导细胞凋亡并抑制细胞生长[26]。细胞凋亡可以通过外源性或内源性途径启动，这两种途径均有Casepase-3的激活步骤[27]。内在通路主要由Bcl-2家族控制，Bcl-2、Bax分别作为关键蛋白发挥抗凋亡和促凋亡功能。Bax通过形成寡聚化的多跨单体，导致线粒体膜的透化，导致通常定位于膜间隙的蛋白质活化后释放到细胞质环境中[28]。此外，ALO诱导结肠癌细胞（SW480和HCT116）凋亡[29]。

Bcl-2家族由促凋亡蛋白Bax和抗凋亡蛋白Bcl-2组成。Bax通过激活半胱天冬酶和释放线粒体细胞色素c促进细胞凋亡，而Bcl-2通过阻止细胞色素c的释放抑制细胞凋亡。本研究观察到ALO处理组的Bcl-2水平下降，提示了HGC-27细胞、AGS细胞凋亡的潜在机制。这一发现与其他研究者的研究结果一致[30-32]。

综上所述，ALO抑制胃癌细胞的增殖、侵袭和迁移，诱导HGC-27细胞、AGS细胞凋亡。

参考文献:

[14]王馨楠,胡文秀,孙硕,等.缺氧微环境对乳腺癌的影响及中药的干预作用[J/OL].中国实验方剂学杂志:1-17[2024-04-12].

基金资助:国家自然科学基金项目(32360242); 青海省自然科学基金项目(NO.2023-ZJ-932M);

文章来源:锁丽娜,马海秀,易毅,等.苦豆碱抑制胃癌HGC-27细胞和AGS细胞增殖的作用机制[J].中国高原医学与生物学杂志,2024,45(04):235-245.