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芩百清肺浓缩丸对感染肺炎支原体小鼠TRPA1、P物质的影响

2022-07-08 528 上传者：管理员

摘要：目的:研究芩百清肺浓缩丸治疗小鼠感染肺炎支原体后咳嗽的作用机制。方法:实验分为正常对照组、模型组、阳对组(阿奇霉素0.03 g/kg)和芩百组(2.34 g/kg)，通过BALB/c小鼠鼻腔滴入20μL106CCU肺炎支原体造模，各组小鼠灌胃给予相应药物7 d。引咳实验观察各组小鼠咳嗽情况，HE染色观察各组小鼠肺组织变化，免疫组化观察各组小鼠肺组织TRPA1(瞬间受体电位离子通道)蛋白表达，RT-PCR检测小鼠肺组织TRPA1及P物质m RNA表达。结果:与模型组相比，芩百组和阳对组均能降低小鼠咳嗽次数，HE染色显示芩百组小鼠肺组织支气管黏膜水肿减轻，免疫组化结果显示芩百组小鼠肺组织TRPA1蛋白表达减弱(P<0.05),RT-PCR结果显示芩百组小鼠肺组织TRPA1和P物质m RNA表达减少(P<0.05)。结论:芩百清肺浓缩丸通过降低咳嗽蛋白TRPA1和气道神经源性炎症介质P物质的表达治疗肺炎支原体感染后咳嗽。

关键词：
TRPA1
咳嗽
病理学
肺炎支原体
芩百清肺浓缩丸
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肺炎支原体引发的咳嗽可持续数月，刺激气道上皮产生慢性炎症[1]，此时咳嗽蛋白TRPA1被激活，释放气道神经源性炎症介质P物质[2]。现阶段治疗主要以大环内酯类抗生素类为主，但是大环内酯类抗生素以治疗肺炎支原体感染为主，因此通常需要联合止咳药治疗。并且研究发现中国和日本过度使用大环内酯类抗生素，85%以上的肺炎支原体肺炎儿科病例对大环内酯类抗生素具有耐药性[3]。

芩百清肺浓缩丸由黄芩、百部等6味中药组成，具有清热解毒、润肺止咳之功效[4,5]。前期实验表明，芩百清肺浓缩丸可减少肺炎支原体感染的人肺癌细胞A549的增殖[6]，抑制肺部慢性炎症合并肺炎支原体肺炎小鼠纤维素沉积[7]，并且还可以抑制支原体黏附蛋白P1和P30表达[8]。本研究观察了芩百清肺丸对支原体感染小鼠的止咳作用，应用免疫组化和RT-PCR实验观察芩百清肺浓缩丸对感染肺炎支原体小鼠咳嗽蛋白TRPA1、P物质因子的影响。报道如下。

1、实验材料

1.1实验动物

40只SPF级6周龄BALB/c小鼠，雌雄各半，体质量20～22 g，购买于哈尔滨医科大学实验动物学部，动物合格证号:SCXK(黑) 2019-001，饲养于GLP实验室。严格按照《黑龙江省实验动物护理和使用指南》的建议进行本研究。该方案经黑龙江省中医科学院动物护理和使用委员会批准(许可编号:[2011]93号)。

1.2实验药品及试剂

芩百清肺浓缩丸:哈尔滨天合力制药有限公司，批号:200101，用生理盐水配成0.11 g/m L溶液;阿奇霉素分散片:石药集团欧意药业有限公司，批号:274180404，用生理盐水配成1.5 g/L溶液。一抗TRPA1:Proteintech公司;P物质:美国Abcam公司;兔超敏免疫组化试剂盒:北京中山金桥公司;RT-PCR试剂盒:Promega公司。

1.3实验仪器

恒温培养箱:北京市六一仪器厂公司;BX41-DP72生物显微镜:Olympus;超纯水制备仪:广州吉迪仪器有限公司;ST-16R型低温高速离心机:美国Thermo Fisher Scientific公司;BP211D型电子天平:Sartorius公司;DP73显微镜成像系统:O-lympus;多功能酶标仪:瑞士TECAN公司;Line Gene9600 Real-Time PCR仪:中国博日公司。

2、实验方法

2.1肺炎支原体的培养

肺炎支原体:American Type Culture Collection，批号:ATCC15531，于含20%胎牛血清PPLO培养基培养，每隔7 d传代1次，感染小鼠造模的菌种选用传代的第3代。

2.2动物分组、造模和给药

小鼠饲养3～5 d适应环境后，将40只小鼠随机分成4组，每组10只，分别为正常组、模型组、阳性对照组和芩百清肺浓缩丸组(芩百组)。除正常组外，其余各组小鼠鼻腔滴入20μL106CCU肺炎支原体培养液造模，连续3 d。阳对组予阿奇霉素(0.03 g/kg)灌胃，芩百组予芩百清肺浓缩丸(2.34 g/kg)灌胃，每日1次，正常组、模型组予等体积生理盐水，连续灌胃7 d。

2.3观察指标

2.3.1引咳实验

给药7 d后，将各组小鼠置于倒置的500 m L烧杯内，吸取0.5 m L氨水，滴加在棉球上，迅速扣严烧杯，观察和记录小鼠3 min内咳嗽次数。

2.3.2肺组织病理学变化

引咳实验结束后脱颈椎处死小鼠，取左肺，置于10%福尔马林24 h，石蜡包埋切片，于65℃烘箱烘烤1 h，依次用二甲苯脱蜡3次，每次10 min，无水乙醇3次，每次2 min,95%乙醇Ⅰ2～3 min,95%乙醇Ⅱ2～3 min,90%乙醇Ⅱ2 min,80%乙醇2 min,70%乙醇2 min，再放入蒸馏水5 min，苏木素染色液3～5 min，自来水冲洗5 min，置于1%盐酸乙醇30 s，自来水冲洗5 min，置于伊红染色液3～5 min，酒精梯度脱水、二甲苯透明，中性树脂封片。

2.3.3免疫组化法检测TRPA1蛋白表达

将小鼠肺组织石蜡切片于65℃烘箱烘1 h后，经过脱蜡后，放置于煮沸的0.01 mol/L枸橼酸缓冲液中，煮沸10 min，置冷水冷却后，将配制好的PBS缓冲液清洗3次，H2O2去离子水孵育10 min,PBS缓冲液冲洗3次，滴加一抗(TRPA1 1∶300)孵育，置于4℃冰箱过夜。第2天，根据免疫组化试剂盒说明书，滴加反应增强液孵育，再用PBS缓冲液冲洗3次，滴加二抗，孵育1 h，采用DAB显色8 min后，复染，封片。根据IHC评分标准进行评分统计，IHC评分标准:每张切片选取3个视野，从着色深浅程度及其面积进行评分。着色深浅程度:浅色计1分，棕黄色计2分，棕褐色计3分;着色细胞面积:在25%以下计1分，在25%～49%计2分，在50%以上计3分。以二者乘积为综合得分统计。

2.3.4 RT-PCR法检测肺组织TRPA1mRNA和P物质表达

取小鼠右肺组织50 mg置于研磨管中，加入1 m L Trizol溶液和2个钢珠，低温匀浆120 s，室温静置30 min，直至溶液变澄清。加入0.2 m L氯仿，振荡15 s并静置5 min，置于4℃离心机中以12 000 r/min的转速离心15 min，使用移液枪吸出上清液转移至另一离心管中，加入等体积的异丙醇，混匀管中液体，室温静置10 min后离心取上清，加入75%乙醇后离心舍弃上清，室温静置干燥15 min，加入20μLDEPC水，置于65℃水浴锅中促溶10～15 min。使用酶标仪测定各组m RNA浓度，根据m RNA浓度测定结果，用无核酸水稀释为100 mg/L，将PCR反应体系加样至8连排中，PCR反应体系的配制为:Go Taq q PCR Master Mix,2X:10μL;Supplement MgCl2,25 mmol/L:1.5μL;GoScript RT Mix for 1-step RT-Qpcr,50X:0.4μL;Supplement CXR Reference Dye,30 mmol/L:0.4μL;Nuclease-Free water:4.7μL;Forward Primer,10X:1μL;Reverse Primer,10X:1μL;RNA Template:1μL，以200 r/min转速离心1 min，使其充分混匀，取出后放置于PCR扩增仪中循环扩增。

反应扩增条件为:37℃(900 s)，循环1次;95℃(600 s)，循环1次;95℃(10 s)，循环40次;60℃(30 s)，循环40次;72℃(30 s)，循环40次。溶解曲线:起始温度为72℃.恒温10 s;采样模式:单次，台阶温度:0.5℃。反应结束后查看荧光定量PCR的扩增曲线和溶解曲线，输出Ct值，计算2-ΔΔCt值，以模型组为参比，设定表达量为1，计算其余组相对模型组数值，进行比较。

引物基因序列如下:TRPA1正向5’-GOGGTT-GGGGACATTGCTGAG-3’,TRPA1反向5’-TG-GATACACGATGGTGGACCTCTG-3’;P物质正向5’-TTGGTCCGACTGGTCCGACAG-3’,P物质反向5’-GAACTGCTGAGGCTTGGGTCTTC-3’;β-actin正向5’-GACGGCCAGGTCATCACTAT-3’,β-actin反向5’-AGGAAGGCTGGAAAAGAGCC-3’。

2.4统计学分析

本实验采用SPSS25.0软件进行统计学分析，数据用表示，用独立样本t检验比较，P<0.05为差异有统计学意义。

3、结果

3.1各组小鼠引咳实验结果

见表1。

表1各组小鼠氨水引咳实验结果

3.2各组小鼠肺组织HE染色结果

正常组小鼠肺组织结构完整，无感染现象。模型组小鼠肺组织可见大量炎细胞浸润，肺组织结构不完整，支气管黏膜水肿，间隙变窄。与模型组相比，芩百组和阳对组病变不同程度地减轻，芩百组支气管水肿减轻，有少量炎细胞浸润。见图1。

3.2各组小鼠肺组织HE染色结果

图2各组小鼠肺组织TRPA1蛋白表达的免疫组化检测结果(×40)

3.4各组小鼠肺组织TRPA1mRNA和P物质m RNA表达的RT-PCR检测结果

见表3。

表3各组小鼠肺组织TRPA1、P物质m RNA表达的比较

4、讨论

肺炎支原体主要通过空气飞沫传播进入人体呼吸道，使呼吸道黏膜上皮细胞受到破坏，上皮细胞纤毛活动变慢，甚至完全脱落，同时支气管壁肥厚，管腔变小，痰不易排出，进而引起剧烈咳嗽[9]。咳嗽是指迷走神经传入离子通道并被激活的一种反射，这些离子通道其中包括阳离子选择性通道的瞬时受体电位(TRP)家族[10]。TRP家族作为气道感觉神经元上咳嗽感受器，在咳嗽发病中发挥重要作用。TRPA1是一种电位依赖的Ca2+可渗透阳离子通道，其氨基端有14个蛋白重复，属于TRP家族较大的分支之一。主要激活模式是通过对N-末端半胱氨酸或赖氨酸的共价修饰，当TRPA1被激活活化后，释放更多的神经肽和气道神经源性炎症介质P物质，从而诱发咳嗽[11,12]。在临床试验和豚鼠模型中，TRPA1已被确认为促咳受体，可以选择此受体作为拮抗阻断剂[13,14]，为潜在的镇咳药物的研究开辟了一个全新的领域。

芩百清肺浓缩丸是以经方止嗽散为基础方，在临床研究基础上经加减而成的治疗肺炎支原体肺炎的有效方剂，本实验观察了芩百清肺浓缩丸对感染肺炎支原体小鼠咳嗽蛋白TRPA1及气道神经源性炎症介质P物质的影响。结果可见芩百组能够减少咳嗽次数，改善小鼠肺组织病理变化，降低咳嗽蛋白TRPA1蛋白表达，下调咳嗽蛋白TRPA1及气道神经源性炎症介质P物质m RNA表达。表明芩百清肺浓缩丸可有效缓解支原体肺炎的咳嗽症状，减少咳嗽因子TRPA1及气道神经源性炎症介质P物质的表达是其部分作用机制。

参考文献:

[1]于利,罗函渝,张伟忠,等. 130例肺炎支原体感染所致儿童慢性咳嗽的治疗研究[J].国际医药卫生导报,2013,19(10):1436-1439.

[2]杨建林,武阳,丁书茂,等｡TRPA1介导哮喘和咳嗽机制的研究进展[J].医学研究杂志,2011,40(10):134-137.

[4]姚琳,张俊威,王博,等｡百清肺浓缩丸对肺炎支原体感染大鼠肺组织中TGF-β和SP-A表达的影响[J].中国药理学通报,2016,32(4):564-569.

[5]杨志敏,蒙艳丽,王慧慧,等.百清肺浓缩丸对肺炎支原体感染的影响[J].中成药,2020,42(5):1150-1155.

[7]蒙艳丽,王晓溪,徐慧星,等.百清肺浓缩丸对小鼠肺部慢性炎症合并肺炎支原体肺炎的疗效观察[J].中南药学, 2019,17(11):1805-1808.

[9]冯金燕,陈志敏.肺炎支原体感染现状及其与哮喘的关系[J].国际儿科学杂志,2010(1):.7-19.

[12]王颖,史利卿,马建岭,等. TRP通道在慢性咳嗽中的作用机制探讨[J].临床肺科杂志,2019,24(10):1910-1913.

文章来源：王磊,蒙艳丽,王博,王晓溪,王欣,梁明川,王伟明.芩百清肺浓缩丸对感染肺炎支原体小鼠TRPA1、P物质的影响[J].中国中医药科技,2022,29(04):541-544.