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红芪多糖对糖尿病肾病db/db小鼠肾损伤的改善作用

2024-07-19 17 上传者：管理员

摘要：目的研究红芪多糖（HPS）对糖尿病肾病（DN）db/db小鼠肾组织中转化生长因子-β1（TGF-β1）、smad同源物3重组蛋白（smad3）、smad7在肾组织表达的影响。方法根据体质量将雄性db/db小鼠随机分为模型组(0.9%NaCl 0.2 mL·d-1)、阳性对照组(22.75 mg·kg-1·d-1厄贝沙坦)和高、中、低剂量实验组(200、100、50 mg·kg-1·d-1 HPS),每组10只；另取10只同周龄SPF级雄性C57BL/6小鼠作为正常组(0.9%NaCl 0.2 mL·d-1)。6组小鼠每天灌胃1次，连续给药12周。于治疗前及治疗后第4、8、12周末检测小鼠血糖水平，用蛋白质印迹法检测TGF-β1、smad3、smad7蛋白的表达水平。结果治疗后，模型组小鼠血糖水平均较正常组显著升高（均P<0.01）;高、中剂量实验组小鼠的血糖水平均较模型组显著下降（P<0.05,P<0.01）。正常组、模型组、阳性对照组和高、中剂量实验组的TGF-β1蛋白相对表达水平分别为0.71±0.16、1.66±0.18、1.00±0.17、0.88±0.15和1.23±0.15,smad3蛋白相对表达水平分别为0.89±0.32、2.26±0.35、1.24±0.31、1.05±0.30和1.67±0.35,smad7蛋白相对表达水平分别为1.66±0.03、0.60±0.03、1.10±0.07、1.48±0.08和0.97±0.09。高、中剂量实验组的上述指标与模型组相比，在统计学上差异均有统计学意义（P<0.05,P<0.01）。结论 HPS可以通过调控血糖水平，抑制TGF-β1、smad3及升高smad7的表达，改善肾纤维化，延缓DN发展进程。

关键词：
db/db小鼠
smad同源物3重组蛋白
糖尿病肾病
红芪多糖
转化生长因子-β1
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糖尿病肾病(diabetic nephropathy, DN)是糖尿病重要的微血管并发症之一，其病理特性主要包括肾小球滤过屏障受损、肾小球足细胞上皮细胞-间充质转化(epithelial mesenchymal transition, EMT)等[1]。转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)/smad通路受多种机制特异性调控，不仅参与生物体细胞分化、增殖等生理活动，还是导致肾纤维化的关键途径，该通路的激活可持续合成细胞外基质，促进DN肾小球硬化与肾小管间质纤维化[2,3]。本研究旨在探讨红芪多糖(Hedysarum polysaccharides, HPS)对db/db小鼠肾组织结构及TGF-β1、smad同源物3重组蛋白(smad homologue 3 recombinant protein, smad3)和smad7表达水平的影响，为HPS防治DN提供实验依据。

一、材料与方法

1 材料

动物雄性SPF级db/db小鼠，鼠龄6周，体质量(35.34±0.87)g, 雄性SPF级C57BL/6小鼠，鼠龄6周，体质量(21.40±0.67)g, 均由江苏集萃药康生物科技股份有限公司提供。动物生产许可证号：SCXK(苏)2018-0008。本实验经甘肃中医药大学实验动物伦理委员会批准(伦理批号：2021-201)。

药品与试剂红芪饮片，批号：160627,产地：甘肃宕昌县，购自甘肃宕昌县合兴中药材有限责任公司，由甘肃中医药大学药学院杨扶德教授鉴定为豆科植物红芪的根茎。HPS,纯度：87.44%,批号：01,甘肃中医药大学药学院邵晶副教授提取；厄贝沙坦片，规格：每片0.15 g, 批号：201617JB,批准文号：国药准字H20000513,江苏恒瑞医药股份有限公司生产。甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH)抗体，购自美国GeneTex公司；辣根过氧化物酶标记山羊抗兔免疫球蛋白二抗，购自英国Abcam公司；TGF-β1抗体、smad7抗体，均购自武汉Proteintech公司；smad3抗体，购自江苏Affinity公司。

仪器Powerpac Basic 164-5050电泳仪、734BR2515凝胶成像分析系统、734BR2515荧光定量聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR)仪、Trans-Blot Turb全能型蛋白转印系统，均为美国Bio-Rad公司产品；Q5000微量紫外分析仪，美国Quawell公司产品。

2 实验方法

2.1 模型构建

db/db小鼠是国际公认的2型糖尿病肾病模型鼠，其出生6周后可出现明显肥胖，空腹血糖、饮水量、尿量逐渐增加，12～16周时最明显，8周后即可出现早期DN[4]。以db/db小鼠尿中微量蛋白尿含量显著高于C57BL/6小鼠，且空腹血糖≥11.1 mmol·L-1判定为模型成功[5]。

2.2 动物分组与给药方法

将db/db小鼠按体质量随机分为模型组(0.9%NaCl 0.2 mL·d-1)、阳性对照组(22.75 mg·kg-1·d-1厄贝沙坦)和高、中、低剂量实验组(200、100、50 mg·kg-1·d-1 HPS),每组10只；另取10只同周龄SPF级雄性C57BL/6小鼠作为正常组(0.9%NaCl 0.2 mL·d-1)。6组小鼠每天灌胃1次，连续给药12周。

2.3 样品采集

小鼠麻醉后心脏取血，吸取收集血液的上清液，置于-80 ℃保存，备用。取部分肾组织在4%多聚甲醛中固定，剩余肾组织过液氮，置于-80 ℃保存，备用。

2.4 血糖检测[6]6]

于治疗前及治疗后第4、8、12周末，小鼠尾静脉采血，用血糖仪检测血糖浓度。

2.5 过碘酸雪夫(periodic acid-Schiff, PAS)、马松(Masson)染色法观察肾组织病理学变化[4]4]

将肾组织石蜡包埋，经PAS、Masson染色、脱水、透明、封片，光镜下观察相关组织结构病理改变。

2.6 蛋白质印迹法检测肾组织TGF-β1、smad3、smad7蛋白的表达水平[7,8]7-8]

取小鼠肾组织0.12 g, 经研磨、裂解、离心、变性等步骤提取总蛋白，制胶上样并电泳，电转，封闭，一抗和二抗孵育，经ECL发光液显影，用凝胶成像分析仪曝光并摄取图像，用Image J图像分析系统进行目的条带灰度值和光密度分析。

2.7 实时荧光定量PCR法检测肾组织TGF-β1、smad3、smad7 mRNA的表达水平[7,8]7-8]

提取肾组织总RNA,按照实时荧光定量PCR试剂盒操作说明书逆转录合成第一链cDNA。按照SYBR Premix Ex TaqTMⅡ说明书进行PCR扩增反应，最后以相对定量值(相对表达水平2-ΔΔCt)进行统计分析。引物序列由NCBI Primerblast设计，并由苏州金唯智生物科技有限公司合成。

3 统计学处理

用SPSS 26.0软件进行统计分析。6组数据均符合正态分布方差齐性，以x¯±s

表示，组间比较用单因素方差分析。

二、结果

1 6组db/db小鼠治疗前后血糖变化

高、中、低剂量实验组分别给予200、100、50 mg·kg-1·d-1 HPS;阳性对照组给予22.75 mg·kg-1·d-1厄贝沙坦；模型组和正常组均给予0.9%NaCl 0.2 mL·d-1。

治疗前，除正常组外，其余6组血糖水平总体稳定。治疗后，模型组小鼠血糖水平均较正常组显著升高(均P<0.01);高、中剂量实验组小鼠血糖水平均较模型组显著降低，在统计学上差异均有统计学意义(P<0.05,P<0.01)。结果见表1。

2 6组小鼠肾组织PAS、Masson染色结果

正常组小鼠肾结构清晰完整，肾小球形态规则，基底膜平滑、无增生，肾小管内皮完整、管腔通畅；模型组小鼠肾小球体积增大，基底膜增厚，系膜基质增生，胶原纤维呈絮状，系膜区弥漫性增宽，管腔萎缩，可见系膜区纤维化增生及肾小管纤维化；低、中、高剂量实验组小鼠肾小球基质增生呈不同程度减轻，纤维化较模型组缩小，说明HPS能在一定程度上减轻肾的病理变化，改善肾纤维化。结果见图1。

3 HPS对db/db小鼠TGF-β1、smad3、smad7蛋白表达的影响

低、中、高剂量实验组和阳性对照组、模型组、正常组的TGF-β1蛋白相对表达水平分别为1.54±0.17、1.23±0.15、0.88±0.15、1.00±0.17、1.66±0.18和0.71±0.16,smad3蛋白相对表达水平分别为2.09±0.32、1.67±0.35、1.05±0.30、1.24±0.31、2.26±0.35和0.89±0.32,smad7蛋白相对表达水平分别为0.70±0.07、0.97±0.09、1.48±0.08、1.10±0.07、0.60±0.03和1.66±0.03。模型组与正常组比较，TGF-β1、smad3蛋白相对表达水平均显著升高，smad7蛋白相对表达水平显著降低(均P<0.01);高、中剂量实验组与模型组比较，TGF-β1、smad3蛋白相对表达水平均显著降低，smad7蛋白相对表达水平均显著升高(P<0.05,P<0.01)。结果见图2。

表1 6组db/db小鼠治疗前后血糖变化(x¯±s)

图2 HPS对小鼠转化生长因子-β1(TGF-β1)、smad同源物3重组蛋白(smad3)和smad7表达的影响

如表2所示：模型组与正常组比较，TGF-β1、smad3 mRNA表达水平均显著升高，smad7 mRNA表达水平显著降低(均P<0.01);高、中剂量实验组与模型组比较，TGF-β1、smad3 mRNA表达水平均显著降低，smad7 mRNA表达水平均显著升高(P<0.05,P<0.01)。

表2 HPS对db/db小鼠TGF-β1、smad3、smad7 mRNA表达的影响(x¯±s)

三、讨论

DN发病机制是体内平衡失常的结果，包括肾素-血管紧张素-醛固酮系统紊乱、糖脂代谢紊乱、内皮素紊乱、血流动力学异常及生长因子异生[9,10]。DN以肾小球滤过降低、尿蛋白排泄增加、肾动脉高压、钠/水代谢潴留、肾多功能丧失及病理改变为主要特征，以肾小球肥大、基底膜增厚、系膜基质扩张、肾小管萎缩、足细胞自噬与凋亡、上皮-间充质转分化为主要病理改变[11]。TGF-β1是导致肾纤维化的关键细胞因子，通过持续细胞外基质合成促进DN肾小球硬化和肾小管间质纤维化。smad3是TGF-β1信号通路执行转录的关键靶点，在氨基酸序列上具有高度相似性，沉默smad3能有效抑制TGF-β1对细胞增殖、迁移和细胞外基质合成的影响[2]。smad7是TGF-β1/smad通路中负反馈因子，TGF-β1不仅通过依赖性smad3上调smad7的表达，也能通过诱导泛素蛋白酶进而促进smad7的失活与降解，而smad7可以同R-smad对抗其与TGF-β受体的结合能力，通过募集E3泛素连接酶来降解TGF-β Ⅰ型受体，负反馈调控TGF-β1/smad3的活性水平[12,13,14,15]。

本研究提示，红芪多糖可以通过调控血糖水平，抑制DN db/db小鼠TGF-β1、smad3的表达水平及升高smad7的表达水平，减轻糖毒对肾的侵害，改善肾纤维化，延缓DN发展进程。随着研究的深入，红芪多糖更多的生物学关联机制会被发掘，而TGF-β1/smad信号通路可能成为DN的潜在治疗靶点。

参考文献:

[3]陈彦旭,姜晓雪,张钦媛,等.TGF-β/Smad信号通路在糖尿病肾病中的作用及中药干预的研究进展[J].中国中药杂志,2023,48(10):2630—2638.

[4]陈彦旭,金智生,姜晓雪,等.基于JAK2/STAT3信号通路探讨红芪多糖对糖尿病肾病db/db小鼠作用机制[J].中国实验方剂学杂志,2023,29(13):65—71.

[5]孙竹梅,梁伟时,康佳丽,等.2型糖尿病db/db小鼠肾动态病理特点[J].吉林大学学报(医学版),2018,44(3):499—503,695.

[6]陈彦旭,金彩云,金智生等.基于Wnt/β-catenin信号通路探讨红芪多糖对糖尿病肾病db/db小鼠作用机制[J].中国实验方剂学杂志,2022,28(21):74—80.

[7]潘艳伶,陈洪民,伏红颖,等.糖通饮经miRNA-21/TGF-β1/Smad信号转导对糖尿病肾病大鼠肾脏功能的保护作用[J].中药新药与临床药理,2023,34(4):452—458.

[8]白璐,陈志强,陈永哲,等.化瘀通络中药对糖尿病肾病大鼠肾脏病理及肾脏TGF-β1/Smad信号通路的影响[J].时珍国医国药,2020,31(6):1285—1288.

[9]宋卫国,彭璘,武雯雯,等.基于Wnt/β-catenin调控EMT探讨益肾化瘀方对糖尿病肾病大鼠肾小球足细胞损伤的干预机制[J].中国实验方剂学杂志,2021,27(10):44—50.

基金资助:国家自然科学基金地区基金资助项目(82360914); 甘肃省高等学校青年博士基金资助项目(2022QB-096); 甘肃中医药大学博士研究生创新基金资助项目;

文章来源:陈彦旭,张磊,金智生,等.红芪多糖对糖尿病肾病db/db小鼠肾损伤的改善作用[J].中国临床药理学杂志,2024,40(14):2078-2082.