HIV复制周期短，具有高突变率、高重组率和高复制率等特点，在复制过程中其反转录酶缺乏校正活性，因此容易不断重组产生新的亚型、循环重组株（Circulating Recombinant Forms,CRFs）和特殊重组株（Unique Recombinant Forms,URFs)[1]。目前我国HIV-1基因型构成主要以CRF01＿AE亚型和CRF07＿BC亚型为主[2]。有研究表明，胃肠道是HIV感染后持续复制的主要场所，充当着HIV储存库的作用，随之而来的便是肠上皮屏障的破坏、肠道微生物群的失调以及免疫系统的慢性激活[3]。近年来，肠道菌群作为新的潜在治疗靶点，为HIV的治疗带来了新的曙光，研究肠道菌群与HIV感染之间的相互作用可以更好地研究发病机制。已有研究表明，HIV感染者的血脂异常发生率比正常人更高[4]，这显著增加了患者发生非艾滋病定义性疾病（non-AIDS-defining diseases,NADs）的风险。目前对于HIV与肠道菌群的研究多集中于性别、传播途径方面，对于不同基因亚型的HIV感染者的研究仍处于探索阶段，然而，由于艾滋病患者地域流动性增强等因素，HIV仍在不断重组产生新的基因亚型，且具有不同的疾病进展和致病特点，为治疗和疫苗研发带来了巨大的挑战。因此，本研究旨在了解不同基因亚型的HIV感染者肠道菌群特征的差异，并分析肠道菌群和血脂指标的关联，为不同基因亚型HIV感染者的治疗提供新思路。

1、对象与方法

1.1 对象

招募2017-2019年由浦东新区艾滋病中心实验室经蛋白印迹法确证的男性HIV-1抗体阳性患者（HIV+组）47例作为研究对象，随后对研究对象进行基因测序并采集粪便和外周血样本，同时纳入47例年龄、BMI与之相匹配的浦东新区疾病预防控制中心VCT门诊就诊者作为HIV阴性对照组（HIV-组）进行研究。两组纳入标准：(1)无内分泌疾病，无消化内科疾病，无结缔组织疾病及重大疾病史；(2)近1个月未出现慢性腹泻、腹痛症状；(3)近1个月未服用抗生素、益生菌等制剂。排除标准：(1)18岁以下或母婴传播者；(2)有严重心理疾病或精神疾病、智力缺陷、语言障碍等不能自主参与调查者。此外，本研究招募的所有研究对象均知情同意，研究方案经上海市浦东新区疾病预防控制中心医学伦理委员会批准（编号：PW2018B-41）。

1.2 方法

1.2.1 基因测序

使用QIAGEN公司QIAamp Viral RNA Mini Kit提取RNA，采用巢式反转录聚合酶链式反应（Nested reverse transcription polymerase chain reaction,Nested RT-PCR）扩增HIV pol区。两轮PCR均使用日本Ta Ka Ra公司生产的试剂盒。取第二轮PCR产物5u L缓慢加入电泳孔中，同时在电泳孔中加入5μL分子量为2 000的Marker，判断PCR扩增产物的正确位置。电泳仪电压设量为100V，恒压电泳，40 min左右观察结果。基因产物送至北京六合华大基因科技有限公司上海分公司进行PCR扩增产物的纯化及基因测序。采用DNASTAR Lasergene 17.0.2.1软件Seq Man程序，对基因序列进行编辑和拼接，将拼接好的序列提交至美国HIV数据库，使用HIV-Blast在线软件初步判定亚型。使用Clustal W 2.0.10软件将待分析序列与各亚型参考株序列多重排列和比对，利用Mega 7.0.26软件，采用Neighbor-Joining(N-J）法构建系统进化树，使用ITOL在线工具标注。使用Sequence 4.9等软件进行序列的排列、比对和编辑，并用Mega7.0进行系统树进化分析（BOOTSTRAP大于70%），最终确定HIV-1基因亚型。抗病毒pol基因扩增引物及反应条件见表1。

1.2.2 粪便采集

根据粪便采集管说明书，在研究对象居住地或当地医院将粪便样本采集于无菌粪便采集管中。调查人员收集后于采集管侧壁贴好编号标签并记录采样时间，尽快送检或保存于-80℃冰箱。

1.2.3 外周血采集及生化指标检测

采集前12 h内禁食，于次日清晨抽取空腹静脉血5 m L，分离血清，测定TC、TG、HDL-C、LDL-C的水平。

1.2.4 诊断标准

根据《中国成人血脂异常防治指南（2016年修订版）》[6]，总胆固醇水平异常定义为TC≥5.2 mmol/L；甘油三酯水平异常定义为TG≥1.7mmol/L；高密度脂蛋白胆固醇水平异常定义为HDL-C<1.0 mmol/L；低密度脂蛋白胆固醇水平异常定义为LDL-C≥3.4 mmol/L，其中任意一项血脂指标异常定义为血脂异常。  

表1 2017-2019年浦东新区新报告HIV/AIDS患者抗病毒pol基因扩增引物及反应条件[5] 

1.2.5 DNA提取及肠道菌群16S r DNA基因测序

使用CTAB/SDS方法提取样本的总基因组DNA。通过1%琼脂糖凝胶测定DNA浓度和纯度。根据浓度，用无菌水将DNA稀释至1 ng/μL。对细菌16S r DNA V4区域进行PCR扩增，上下游引物序列分别为：341F(CCTAYGGGRBGCASCAG）和806R(GGACTACNNGGGTATCTAAT）。扩增程序所有PCR反应均在30μL反应液中进行，反应液为15μL Phusion®High-Fidelity PCR Master Mix(New England Biolabs）、0.2μM的正向和反向引物以及约10 ng模板DNA。热循环包括：在98℃下初始变性1 min，然后在98℃下进行30个循环：98℃变性10 s,50℃退火30 s,72℃延伸30 s。最后72℃延伸5 min。

1.2.6 生物信息学分析

使用开源软件QIIME 1.7.0软件先对数据低质量部分剪切，再采用Barcode核苷酸序列标记样品，从得到的数据中拆分出各样品数据，截去Barcode和引物序列初步质控得到原始数据。通过VSEARCH 2.23.0与物种注释数据库进行比对并过滤嵌合体，使用Uparse 7.0.1001将序列相似性≥97%的聚类形成可操作分类单元（Operational Taxonomic Units,OTUs），并采用Silva数据库对每个OTU的代表性序列注释，分类注释方法为mothur法。在R 4.3.1中根据OTUs分析微生物alpha多样性、Beta多样性、物种组成结构和差异物种。其中，alpha多样性分析选择观察物种数（Observed species),ACE指数、Chao1指数计算菌群丰度，并使用Shannon指数和Simpson指数计算菌群多样性。Beta多样性采用Uni Frac算法，利用样本间微生物序列的进化信息计算样品间距离，得到距离矩阵，并基于unweightedunifrac相异度进行主坐标分析（Principal Co-ordinates Analysis,PCo A）选取贡献率最大的主坐标组合作图，以衡量不同组间肠道菌群物种组成差异，采用Adonis方法检验不同组间群落结构差异。通过线性判别效应分析（Linear discriminant analysis Effect Size,LEf Se）筛选不同组间的差异物种。

1.3 统计分析

使用R 4.3.1进行统计学分析。分类资料采用χ2检验；计量资料采用M(P25,P75）描述，使用Wilcoxon符号秩和检验；采用Spearman相关性分析展示肠道菌群-血脂指标之间的关系，进行统计学检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1 研究对象基本情况

HIV+组与HIV-组各47例，其中HIV+组按照基因亚型分为CRF01＿AE组25例，CRF07＿BC组22例。HIV+组和HIV-组组间年龄、血脂异常情况差异均无统计学意义。见表2。

对HIV+组不同基因亚型的研究对象分析发现：CRF01＿AE组有15例（60.0%)HDL-C发生异常，而CRF07＿BC组中有6例（27.3%)HDL-C发生异常，差异有统计学意义（P<0.05）。见表2。

2.2 HIV感染者肠道菌群结构比较

不同HIV感染状态组间和不同基因亚型组间肠道细菌α多样性各项指标差异均无统计学意义。采用Adonis法对肠道菌群的β多样性分析结果表明，HIV+组和HIV-组发生明显聚类（R2=0.034 6,P=0.001），不同HIV感染状态解释了3.5%的肠道菌群结构差异，而CRF01＿AE组和CRF07＿BC组未观察到明显聚类现象（R2=0.023 53,P=0.296）（图1）。

进一步比较肠道菌群物种注释分类结果，在门水平上（图2A）观察到四组丰度最高的前五个门占菌群总数均超过总体的97%，包括拟杆菌门（Bacteroidota）、厚壁菌门（Firmicutes）、梭杆菌门（Fusobacteriota）、变形菌门（Proteobacteria）和放线菌门（Actinobacteriota）。其中，HIV-组中梭杆菌门丰度低于HIV+组（2.8%vs.6.8%,P<0.01），变形菌门丰度高于HIV+组（4.2%vs.3.0%,P<0.01），差异有统计学意义。在HIV感染者中，CRF07＿BC组相较CRF01＿AE组拟杆菌门（57.0%vs.54.6%）、梭杆菌门（7.5%vs.6.1%）和放线菌门（2.1%vs.1.2%）比例增加，厚壁菌门（29.9%vs.33.2%）和变形菌门（2.7%vs.3.2%）的比例减少，但差异均无统计学意义。  

表2 不同HIV感染状态、基因亚型HIV感染者基本信息及血脂异常情况[例（构成比/%）]  

图1 不同HIV感染状态、基因亚型的肠道菌群Beta多样性比较   

在属水平上显示了相对丰度最高的8种肠道细菌。与HIV-组相比，HIV+组拟杆菌属（Bacteroides）相对丰度较低（21.1%vs.32.1%,P=0.03），而梭杆菌属（Fusobacterium)(6.6%vs.2.2%,P<0.01）、巨单胞菌属（Megamonas)(4.6%vs.1.9%,P=0.01）相对丰度较高。此外，与CRF01＿AE组相比，CRF07＿BC组拟杆菌属（Bacteroides)(17.5%vs.24.9%）相对丰度较低，而普氏菌属（Prevotella)(37.0%vs.23.9%）、梭杆菌属（7.5%vs.5.9%）、巨单胞菌属（5.7%vs.3.7%）相对丰度较高，但差异均无统计学意义，见图2B。

2.3 不同基因亚型HIV感染者肠道菌群差异物种分析

如图3所示，不同基因亚型的HIV感染者肠道菌群差异物种分析发现了15种肠道菌群在CRF01＿AE组和CRF07＿BC组间存在统计学差异，可作为判断不同基因亚型HIV感染者肠道菌群的生物标志物。在CRF07＿BC组中，观察到来自厚壁菌门（p＿Firmicutes）的5种肠道细菌富集（LDA均>2.0），包括gauvreauii瘤胃球菌属（g＿Ruminococcus＿＿gauvreauii＿group)(P=0.02）、Dorea属（g＿Dorea)(P=0.03）、颤杆菌克属（g＿Oribacterium)(P=0.01）、CAG＿56菌属（P=0.03）、乳球菌属（g＿Lactococcus)(P=0.01），同时也观察到来自拟杆菌门（p＿Bacteroidota）的3种肠道菌群富集（LDA均>2.0），包括噬几丁质菌目（o＿Chitinophagales)(P=0.01）、红噬细胞菌属（g＿Rhodocytophaga)(P=0.03）、Prevotella＿copri菌（P=0.01），还有来自变形杆菌门（p＿Proteobacteria）的3种肠道菌群富集（LDA均>2.0），包括伯克菌科（f＿Burkholderiaceae)(P=0.03）、红环菌科（f＿Rhodocyclaceae)(P=0.03）、莓实假单胞菌（s＿Pseudomonas＿fragi)(P=0.01），以及来自放线菌门（p＿Actinobacteriota）的2种肠道菌群富集（LDA均>2.1），包括大理石雕菌属（g＿Marmoricola)(P=0.03）和两歧双歧杆菌（s＿Bifidobacterium＿bifidum)(P=0.02）。CRF01＿AE组的两种差异菌分别是黄曲霉属（g＿Flavonifractor)(LDA>2.6,P=0.03）和bacterium＿NLAE＿zl＿P872菌（LDA>2.2,P=0.01）。

图2 不同HIV感染状态和不同基因亚型组间肠道菌群门/属水平相对丰度比较   

2.4 HIV感染者肠道菌群和血脂指标关联分析

如图4所示，对HIV感染者的肠道菌群与血脂指标进行关联性分析，观察到菌群-血脂指标关联，Dorea菌的相对丰度与HDL-C指标显示出正相关关系（r=0.302,P=0.039）。

图3 不同基因亚型HIV感染者肠道菌群差异物种分析   

3、讨论

本研究结果表明，不同HIV感染状态组间肠道菌群的α多样性没有显著差异，与其他研究一致[7]，可能是由于HIV感染者均接受了c ART，导致其肠道菌群物种多样性升高所致。近年来，关于HIV感染后肠道菌群的α多样性和组成情况仍存在争议。部分研究显示，HIV+状态与肠道微生物组α多样性下降有关[8]。然而最近的研究证明，HIV感染者的α多样性升高与接受c ART状态有关，[9]。Beta多样性结果揭示了HIV+组和HIV-组间肠道菌群的聚类，与之前的报道一致[10]，但本研究没有发现CRF01＿AE组和CRF07＿BC组之间的肠道菌群结构出现明显差异，这强调了HIV感染对肠道菌群结构的影响，后续研究考虑增加患者样本量再行分析。对肠道菌相对丰度分析结果显示，在门水平上，各组的肠道菌群优势菌均为拟杆菌门和厚壁菌门，占菌群总数的85%以上，其次分别为梭杆菌门、变形菌门、放线菌门。其中，HIV+组中梭杆菌门高于HIV-组。梭杆菌通常被认为是一种致病菌，已被证实可以促进结肠肿瘤的形成[11]。HIV感染者中梭杆菌的富集可能与慢性免疫激活和持续的肠道菌群失调有关[12]。在属水平上，与其他横断面研究结果一致[13,14]，本次研究也发现HIV感染者中存在拟杆菌属减少，梭杆菌属和巨单胞菌属富集的特征。拟杆菌属作为核心微生物组成部分，表现出调节性T细胞的功能，通过调节淋巴细胞和细胞因子的表达来减轻炎症[15]，而梭杆菌的富集可能影响HIV感染者免疫恢复[16]。

尽管不同基因亚型感染者之间Beta多样性差异无统计学意义，但LEf Se分析结果仍然显示出具有相对丰度差异的物种。CRF07＿BC组肠道菌群中有五种差异菌属均来自厚壁菌门。厚壁菌门多数由革兰阳性菌构成，广泛存在于人体肠道内，主要包括一些能够产生短链脂肪酸（SCFAs）和其他被认为有益的代谢活动的厌氧菌[17]，产SCFAs属的菌群富集可能有助于保护肠道上皮屏障、减少炎性反应[18]。gauvreauii瘤胃球菌属、颤杆菌克属、乳球菌属已被证明是丁酸盐的重要生产者，参与结肠中不可消化的膳食纤维和抗性淀粉的厌氧发酵[19],Dorea菌也被报道能产生乙酸和乳酸，作为丁酸生产的底物[20]。丁酸盐作为结肠细胞的能量来源，具有增强紧密连接蛋白的表达，促进肠道上皮细胞黏液的产生和抗菌肽的分泌，保护肠道黏膜屏障的特点[21]，推测CRF07＿BC较慢的疾病进展可能与产丁酸盐属的菌群相对丰度增加有关。

图4 HIV感染者肠道菌群与血脂指标的关联分析   

c ART的普及显著延长了HIV感染者的寿命，然而这一人群罹患NADs的风险也在增加，尤其是心血管疾病（Cardiovascular diseases,CVDs)[22]。本研究对血脂指标的分析结果显示，无论是否感染HIV，血脂异常个体的比例都很高（>53.2%），与其他研究结果类似[23]，这可能是因为生活水平的提高，采取不良生活方式所致。尽管HIV+和HIV-的人群中血脂异常的情况没有差异，但CRF01＿AE组的血脂指标HDL-C异常情况明显高于CRF07＿BC组，且肠道菌群和血脂指标关联性分析结果显示，Dorea菌属与HDL-C水平呈正相关关系。既往研究发现，HIV感染后导致免疫系统功能障碍，影响了高密度脂蛋白的活性，致使HDL-C水平降低，且低水平的HDL-C与CVDs发病高度相关[24]。FU等[25]的研究指出，Dorea菌可能诱导Treg细胞并抑制Th2和Th17细胞的分化和功能，从而调节肠道免疫反应，在维持肠道黏膜屏障的完整性和稳定性上发挥着重要的作用，揭示了Dorea菌在肠道菌群中的积极作用。此外，YANG等[26]通过对小鼠补充益生菌的实验也发现了与本研究类似的HDL-C—Dorea菌的正关联模式。

本研究为探索性研究，样本量较小，且可能存在样本来源、饮食情况等因素带来的数据偏倚。今后需对混杂因素进行控制及增加样本量，开展进一步研究。

综上所述，感染HIV后肠道菌群结构发生明显变化，与健康人群相比，HIV感染者更容易出现有益菌减少，条件致病菌富集的现象。相较于感染CRF07＿BC毒株的HIV感染者，感染CRF01＿AE毒株的患者更容易出现HDL-C异常现象，同时，CRF07＿BC组中维持肠道正常代谢、保护肠黏膜屏障功能完整的有益菌丰度增加，如gauvreauii瘤胃球菌、颤杆菌克菌、乳球菌、Dorea菌丰度升高，初步推测这些菌种可能保护肠道上皮屏障、减少免疫反应。此外，我们还发现了HDL-C—Dorea菌的正相关关系，潜在提示Dorea菌的富集可能改善HDL-C水平，降低NADs的风险，有待进一步实验性研究辅以支撑。

参考文献:

[5]徐璐璐,沈伟伟,陈潇潇,等.台州市2016-2018年新报告HIV/AIDS抗病毒治疗前HIV-1耐药及亚型流行特征分析[J].中华流行病学杂志,2021, 42(4):711-715.

[6]中国成人血脂异常防治指南修订联合委员会.中国成人血脂异常防治指南(2016年修订版)[J].中国循环杂志,2016, 31(10):937-950.

[14]吴雪琪,徐园红,阳凤娇,等.不同性传播途径的HIV感染者肠道微生态差异研究[J].现代预防医学,2022, 49(13):2430-2440.

[18]韩晓旭,吴苑妮,张瑞,等. HIV-1感染者肠道菌群对机体影响的研究进展[J].中国艾滋病性病,2022, 28(2):228-233.

基金资助:浦东新区卫生系统学科带头人培养计划(PWRd2022-01);浦东新区卫生系统医学学科建设资助(PWYgts2021-04);上海市浦东新区卫生健康委员会卫生科技项目(PW2018B-41);浦东新区科技发展基金民生科研专项(PKJ2023-Y71)~~;

文章来源:张浩然,陈盼盼,陈婧,等.浦东新区HIV-1不同亚型感染者的肠道菌群特征及其与血脂异常的关联[J].中国艾滋病性病,2024,30(03):240-246.