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两色金鸡菊提取物对四氯化碳诱导小鼠急性肝损伤的保护作用

2024-04-26 12 上传者：管理员

摘要：目的探讨两色金鸡菊提取物对四氯化碳(CCl4)诱导小鼠急性肝损伤的保护作用及其作用机制。方法通过正交试验得到两色金鸡菊的最佳提取工艺，利用LC-MS分析两色金鸡菊提取物的活性成分；应用CCl4诱导小鼠急性肝损伤模型，考察两色金鸡菊提取物对急性化学性肝损伤的保护作用；利用HE染色观察对肝脏组织损伤情况，考察小鼠体内ALT(谷丙转氨酶)、AST(谷草转氨酶)、SOD(超氧化物歧化酶)、MDA(丙二醛)、TNF-α(肿瘤坏死因子-α)、IL-6(白介素-6)及IL-1β(白介素-1β)等指标的变化情况。结果 LC-MS分析结果显示，两色金鸡菊提取物中含有32种主要活性成分。动物试验结果显示，与空白组比较，模型组小鼠肝脏有明显病理性改变，两组小鼠ALT、AST、MDA、SOD、TNF-α、IL-6及IL-1β水平比较差异具有统计学意义(P<0.01)。与模型组比较，两色金鸡菊给药组小鼠肝脏病理性改变及生化指标均有所改善，其中，ALT、AST、TNF-α、IL-6及IL-1β显著降低(P<0.01或P<0.05),MDA的含量显著下降(P<0.01或P<0.05),SOD的活力显著上升(P<0.01或P<0.05)。结论两色金鸡菊提取物对CCl4诱导的小鼠急性肝损伤具有明显的保护作用，作用机制可能与其抗炎、抗氧化作用相关。

关键词：
两色金鸡菊
四氯化碳
急性肝损伤
抗氧化
抗衰老
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两色金鸡菊(Coreopsis tinctoria Nutt.)又名雪菊、蛇目菊，一年生草本植物，原产于北美洲，目前在中国各地均有栽培[1]。两色金鸡菊花期较长，花色多而艳丽，颇具观赏性；同时兼具药用价值，作为茶饮已有数百年历史，常用于心血管疾病的预防和保健[2,3]。《中国壮药图鉴》记载：两色金鸡菊可清热毒、除湿毒，主治目赤肿痛、疮疡肿毒等。近年来的研究[4]发现，两色金鸡菊中主要含有黄酮、多糖、多酚等活性化合物，具有降脂、降压、抗炎、抗氧化、抗衰老等多种药理活性，具有较大的研究价值。

肝脏具有代谢、解毒、转化、合成、免疫防御等多项重要生理功能[5],化学药物、酗酒、不良生活习惯等致病因素均会引起肝损伤[6]。研究[7]发现，许多天然药物对化学性肝损伤具有一定的保护作用，但作用机制有待明确。本研究通过动物试验，探讨两色金鸡菊提取物对CCl4诱导急性肝损伤的保护作用及机制，为两色金鸡菊的开发和利用提供新的思路。

1、材料与方法

1.1 试验动物

90只SPF级健康的ICR雄性小鼠(长春市亿斯实验动物技术有限责任公司，动物合格证号：SCXK(吉)-2020-0002),6～8周龄，体质量(20±2)g, 在温度20～25 ℃、湿度50%～60%条件下分笼喂养，12 h昼夜交替，适应性饲养3 d后开始试验。试验符合动物伦理的有关规定。

1.2 材料与仪器

两色金鸡菊(佳木斯凛香农业科技发展有限公司);无水乙醇(吉林市欣利化学试剂有限公司);ALT、AST、MDA、SOD、TNF-α、IL-6及IL-1β测定试剂盒(南京建成生物工程研究所)。

AL204分析天平(上海梅特勒-托利多仪器有限公司);旋转蒸发仪(上海泉杰仪器有限公司);低温高速离心机(Eppendorf公司，美国);Infinite M200型酶标仪(TECAN公司，瑞士);台式离心机(Eppendorf公司，美国);U3000型超高效液相色谱仪(Thermo Scientific公司，美国);TripleTOF5600质谱仪(AB SCIEX公司，美国)。

2、试验方法

2.1 两色金鸡菊提取物最佳制备条件筛选

通过单因素试验考察，选取提取温度(A)、料液比(B)、乙醇浓度(C)为考察因素，以干浸膏得率为评价指标，应用L9(34)正交表设计正交试验，因素水平条件见表1,确定两色金鸡菊提取物的最佳制备条件。

表1 正交试验因素水平条件

2.2 两色金鸡菊提取物活性成分测定

称取两色金鸡菊提取物0.1 g, 加入1 mL的50%甲醇水溶液，超声30 min; 于4 ℃下1 200 r/min离心10 min, 取上清10 μL进样。

液相条件：色谱柱Waters BEH C18 Column(150 mm×2.1 mm, 1.7 μm);柱温35 ℃,流速0.3 mL/min。采取梯度脱水(流动相A:0.1%甲酸-水，流动相B:乙腈),0～10 min 95%A;10～15 min 50%A;15～20 min 5%A;20～25 min 95%A。

质谱条件：离子源温度500 ℃(正离子)和450 ℃(负离子);喷雾电压5 500 V(正离子)和4 400 V(负离子);TOF-MS扫描范围为100～1 200 Da; 样品离子扫描范围为50～1 000 Da; TOF-MS扫描时间0.2 s; 样品扫描时间0.01 s; 二级质谱采用IDA方式获得，并采用高灵敏度模式；去簇电压(DP)±60 V;碰撞能量(CE):(35±15)eV。

将LC-MS获得的原始数据导入MS-DIAL4.60软件进行预处理后，导出CSV格式的三维数据矩阵。将提取的峰信息(样品信息、保留时间、质核比和峰面积)导入质谱数据库进行检索，通过匹配度分析得到两色金鸡菊提取物活性成分组成信息，利用各组分峰面积计算其相对含量。

2.3 试验动物

2.3.1 动物分组及给药方法

随机将90只ICR小鼠(雌、雄各半)随机平均分为空白组(CON)、模型组(MOD)、阳性药物组(Y组)、两色金鸡菊低剂量组(LCT组)、两色金鸡菊中剂量组(MCT组)、两色金鸡菊高剂量组(HCT组),Y组小鼠按体质量每天灌胃，给予200 mg/kg剂量的联苯双酯；LCT、MCT和HCT组小鼠每天分别灌胃，给予25、100及400 mg/kg剂量的两色金鸡菊提取物；CON组和MOD组给予相同体积的蒸馏水灌胃，连续给药7 d。末次给药1 h后，除CON组外，其余各组小鼠腹腔注射0.2%CCl4橄榄油溶液造模，造模后继续饲养24 h(禁食不禁水),然后取各组小鼠眼球血及肝脏组织，用于后续试验[8,9,10]。

2.3.2 病理切片观察

取小鼠肝脏较大、较完整的一叶作为包埋原材，以不同梯度浓度乙醇进行脱水处理：75%2 h、85%2 h、90%1 h、95%50 min、100%50 min。脱水完成后以二甲苯进行透明化处理：V(乙醇):V(二甲苯)=1:1处理30 min、二甲苯20 min、二甲苯15 min。然后将原材65 ℃ V(浸蜡)V(二甲苯):V(石蜡)=1:1:1处理1 h一次、石蜡1 h两次。完成后以切面向下在石蜡包埋机上将原材包埋，冷却后取出模具。切片并进行HE染色，在400倍显微镜下观察肝组织病理切片[11]。

2.3.3 生化指标测定

取各组小鼠眼球血及肝脏组织，应用试剂盒检测小鼠ALT、AST、MDA、SOD、TNF-α、IL-6及IL-1β水平。

2.4 统计学分析

应用SPSS 22.0对数据进行处理与统计学分析。计量数据以均数±标准差

表示，多组间样本均数比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用t检验。P<0.05为差异具有统计学意义。

3、试验结果

3.1 两色金鸡菊的最佳提取条件

由正交试验结果可知，各因素对于两色金鸡菊干浸膏提取率的影响程度依次为A>C>B,最终确定两色金鸡菊的最佳提取条件为A2B1C1,即温度70 ℃、料液比1:30、60%乙醇，见表2。

表2 正交试验结果

3.2 LC-MS分析结果

LC-MS测定结果显示，两色金鸡菊提取物含有32种活性成分，见表3。

表3 两色金鸡菊提取物活性成分分析结果

3.3 肝组织病理切片HE染色结果

取小鼠肝组织进行病理学切片及HE 染色，结果显示：CON组肝细胞结构完整，排列规律；MOD组肝细胞严重破裂，排列紊乱，细胞核缺失浑浊，细胞间隙改变；与MOD组比较，MCT、HCT组肝细胞损伤程度明显减弱[12],其中，以HCT组最为明显，肝组织结构清晰、无明显损伤。提示两色金鸡菊提取物对CCl4诱导的急性肝损伤具有保护作用，见图1。

图1 小鼠肝组织HE染色结果 (400×)

3.4 两色金鸡菊提取物对小鼠ALT、AST的影响

应用试剂盒检测各组小鼠血清中ALT、AST的活力，结果显示，与CON组比较，MOD组小鼠ALT和AST活力显著增加(P<0.01),造模成功；与MOD组比较，两色金鸡菊各给药组ALT、AST活力均明显降低(P<0.05或P<0.01),其中，MCT、HCT组更显著(P<0.1),见图2。

3.5 两色金鸡菊提取物对小鼠肝组织中MDA和SOD的影响

与CON组比较，MOD组小鼠肝组织中MDA含量显著增加、SOD活力显著下降(P<0.01);与MOD 组比较，各给药组的MDA含量明显降低、SOD活力明显上升(P<0.05或P<0.01),见图3。

3.6 两色金鸡菊提取物对小鼠TNF-α、IL-6、IL-1β含量的影响

与CON组比较，MOD组小鼠肝组织中TNF-α、IL-6、IL-1β含量显著增加(P<0.01);与MOD组比较，各给药组小鼠肝组织中TNF-α、IL-6、IL-1β含量均明显下降(P<0.05或P<0.01),见图4。

图2 各组小鼠肝组织中ALT、AST的活力水平

图3 各组小鼠肝组织中的MDA、SOD水平

图4 各组小鼠肝组织中TNF-α、IL-6、IL-1β的含量

4、讨论

本研究利用CCl4诱导的小鼠肝损伤模型，考察两色金鸡菊提取物对急性化学系肝损伤的保护作用，并对其机制进行初步研究。通过正交试验确定了两色金鸡菊提取物的最佳制备条件：以60%乙醇为溶剂，温度70 ℃,料液比m(g):V(mL)=1:30,冷凝回流提取1 h以上。通过LC-MS对提取物进行分析，结果显示：两色金鸡菊提取物主要含有根皮苷、栀子苷、木犀草素、5-去甲基诺比林、高圣草酚和己酸羟孕酮等32种活性化合物，其中多数化合物均具有抗炎、抗氧化的药理作用[13,14,15],提示两色金鸡菊提取物的相关活性很可能和抗炎、抗氧化有关。

给小鼠腹腔注射CCl4数h后，可稳定诱导急性化学性肝损伤，是常用护肝药物评价的动物模型[16]。转氨酶是肝脏功能的重要临床指标，可通过检测血清中的ALT、AST变化考察肝损伤情况。SOD是人体内以自由基为底物的抗氧化酶，能清除体内自由基，保护肝脏，临床上也将超氧化物歧化酶作为检验肝脏功能的指标。MDA是体内自由基作用于脂质过氧化反应的最终产物，具有细胞毒性，可以反映肝脏组织过氧化损伤的程度[17]。TNF-α、IL-6、IL-1β是常见的细胞炎症因子，在多种疾病通路中表达，与化学性肝损伤息息相关[18]。

本研究中，经腹腔注射CCl4的模型组小鼠肝细胞出现了明显改变，细胞结构不完整且排列不规则，同时小鼠血清中转氨酶AST和ALT明显升高，急性肝损伤模型诱导成功；进一步的指标检测发现，模型组小鼠血清中SOD降低、MDA升高，肝组织中炎症因子TNF-α、IL-6和IL-1β均明显上升(P<0.05或P<0.01),提示其氧化应激能力下降并伴有急性炎症反应。两色金鸡菊提取物低、中、高剂量组的肝细胞损伤程度均低于模型组，血清中AST和ALT水平也低于模型组(P<0.05或P<0.01);与模型组比较，各给药组小鼠血清中SOD明显升高，MDA含量显著下降，肝组织中的3个炎症因子水平也明显降低(P<0.05或P<0.01)。试验结果显示，两色金鸡菊提取物可提高机体的氧化应激能力，减少由于过氧化引起的肝脏炎症反应，保护肝脏，缓解肝损伤。

综上所述，两色金鸡菊提取物对急性化学性肝损伤具有明显的保护作用，其作用机制可能与抗炎、抗氧化有关。本研究结果可为两色金鸡菊的进一步开发和探索肝损伤治疗新方法提供更多的可能性。

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