猪流行性腹泻(porcine epidemic diarrhea, PED)是由猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)感染引起猪的一种急性烈性肠道传染病。该病呈世界性分布，以腹泻、脱水、呕吐为主要临床特征，常可导致仔猪死亡。PEDV感染严重影响动物的生产性能，自2010年以来，在包括中国在内的主要养猪国家暴发和流行，成为最重要的猪病毒性腹泻病之一，极大地阻碍了全球养猪业的健康发展[1]。对于PED的防控，最主要的措施是接种疫苗。然而，由于PEDV亚型多、具有很强的变异性，且存在持续性感染，接种疫苗并没有达到预期的预防效果。PEDV的致病机制复杂，临床上目前没有有效的治疗药物。因此，深入研究PEDV的致病机制对该病的防控具有重要意义。

细胞自噬是一种具有多种调节功能、可维持真核细胞稳态的正常细胞生理活动。目前研究发现，细胞自噬与病毒的感染与复制之间存在着密切的联系，如自噬可降解侵染细胞的病毒，同时病毒可阻碍自噬的发生，以逃避自噬对其本身复制的影响，甚至某些病毒会利用自噬体促进自我复制。目前对PEDV感染的致病机制，尤其是诱导细胞自噬的机制仍不十分清楚。Guo等[2]发现自噬有利于PEDV复制，并且自噬可能与炎性细胞因子的表达有关，在PEDV感染期间与NF-κB信号通路具有正反馈调节作用。用雷帕霉素诱导细胞自噬会抑制PEDV的感染，并减轻PEDV诱导上皮细胞的死亡[3]。Sun等[4]发现活性氧(reactive oxygen species, ROS)在PEDV感染期间在调节内质网(endoplasmic reticulum, ER)应激介导的自噬中发挥重要作用，并且PERK和IER1通路参与诱导ROS依赖性内质网应激介导的自噬。Lin等[5]筛选出PEDV非结构蛋白6(Nsp6) 可诱导IPEC-J2细胞发生细胞自噬，是能够引起细胞自噬的关键蛋白，然而其诱导细胞自噬的关键功能域尚未确定。因此，本研究获得了在大肠杆菌系统中重组表达的PEDV Nsp6重组蛋白，纯化后免疫小鼠制备相应的多克隆抗体，用于鉴定Nsp6 分段基因的真核表达情况，为进一步确定Nsp6蛋白诱导细胞自噬的关键功能域奠定基础。

1、材料与方法

1.1 试验材料

4周龄雌性BALB/c小鼠购自辽宁长生实验动物中心。PEDV毒株CH/HLJ/18(GenBank: MW561264.1)、猪小肠上皮细胞IPEC-J2购自上海信裕生物科技有限公司；鼠抗PEDV- N蛋白单克隆抗体、 pMD19-T Simple载体、pSUMO原核表达载体pCMV-HA真核表达载体、大肠杆菌DH5α感受态细胞及大肠杆菌Rosetta感受态细胞均由本实验室保存；小鼠抗His标签、HA标签单克隆抗体均购自赛默飞世尔科技公司；HRP/FITC标记山羊抗小鼠IgG抗体购自北京中杉金桥公司；T4 DNA连接酶、dNTP Mixture、 DNA Marker 及PageRulerTM Plus预染蛋白分子量标准购自宝生物工程(大连)公司；中剂量质粒提取试剂盒购自Promega公司；限制性内切酶BamHⅠ、XhoⅠ和EcoRⅠ均购自NEB公司；其他所用试剂均为分析纯。

1.2 PCR引物的设计与合成

参照GenBank中PEDV Nsp6基因序列(Gene ID:935181)及SMART网站对Nsp6基因功能域的预测，将Nsp6基因分为Nsp6-1、Nsp6-2、Nsp6-3段，并使用Oligo 6.0软件设计克隆引物对Nsp6-F/Nsp6-R、N1-F/N1-R、N2-F/N2-R和N3-F/N3-R(见表1),分别用于PEDV Nsp6、Nsp6-1、Nsp6-2、Nsp6-3基因的扩增。

表1 引物序列

1.3 目的基因的扩增及重组质粒的构建与鉴定

提取感染PEDV 的 IPEC-J2 细胞总RNA,经反转录成cDNA后，以Nsp6-F/Nsp6-R为引物对，扩增PEDV Nsp6基因。PCR扩增结束后，对PCR产物进行纯化并对回收片段双酶切(BamHⅠ和XhoⅠ),再利用T4 DNA连接酶在16 ℃下作用14 h, 连接到同样双酶切处理的pSUMO原核表达载体上。将连接产物热转化至大肠杆菌Rosetta感受态细胞，涂布在含卡那霉素抗性的LB固体培养基上，倒置于37 ℃培养箱中培养；12 h后随机挑取单菌落并进行扩大培养，提取质粒。一方面以质粒为模板进行PCR鉴定；另一方面进行双酶切鉴定，鉴定正确的质粒送吉林库美有限公司进行测序验证，测序正确的质粒命名为pSUMO-Nsp6,菌种命名为pSUMO-Nsp6/Rosetta。

以pSUMO-Nsp6质粒为模板，分别以Nsp6-F/Nsp6-R、N1-F/N1-R、N2-F/N2-R及N3-F/N3-R为引物对，PCR扩增PEDV Nsp6、Nsp6-1、Nsp6-2、Nsp6-3基因。将胶回收产物与pMD19-T Simple连接，再将连接产物热转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂布在含氨苄青霉素抗性的LB固体培养基上培养后随机挑取单菌落并进行扩大培养，提取质粒。一方面以质粒为模板进行PCR鉴定；另一方面进行单、双酶切鉴定，均正确的质粒送吉林库美有限公司进行测序验证，测序正确的质粒分别命名为pMD-19T-Nsp6、pMD-19T-Nsp6-1、pMD-19T-Nsp6-2、pMD-19T-Nsp6-3,菌种分别命名为pMD-19T-Nsp6/DH5α、pMD-19T-Nsp6-1/DH5α、pMD-19T-Nsp6-2/DH5α、pMD-19T-Nsp6-3/DH5α。

分别提取pMD-19T-Nsp6、pMD-19T-Nsp6-1、pMD-19T-Nsp6-2、pMD-19T-Nsp6-3及pCMV-HA质粒，利用限制性核酸内切酶EcoRⅠ和XhoⅠ进行双酶切，利用胶回收试剂盒回收目的片段。将胶回收的目的片段与pCMV-HA真核表达载体连接，并将连接产物热转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞培养；12 h后随机挑取单菌落并进行扩大培养，提取质粒。一方面以质粒为模板进行PCR鉴定；另一方面进行单、双酶切鉴定，均正确的质粒送吉林库美有限公司进行测序验证，测序正确的质粒分别命名为pCMV-Nsp6、pCMV-Nsp6-1、pCMV-Nsp6-2、pCMV-Nsp6-3,菌种分别命名为pCMV-Nsp6/DH5α、pCMV-Nsp6-1/DH5α、pCMV-Nsp6-2/DH5α、pCMV-Nsp6-3/DH5α。

1.4 PEDV Nsp6的原核表达及鉴定

将重组大肠杆菌pSUMO-Nsp6/Rosetta培养至OD600 nm为0.5时，取1 mL诱导前的菌体和上清液样品作为对照，其余加入IPTG进行诱导，使IPTG终浓度为1.0 mmol/L,于37 ℃震荡培养12 h后，离心收集菌体沉淀重悬并超声破碎，再次离心后分别收集超声后的沉淀和上清液，分别加入125 μL 5×SDS,混匀后置于沸水中作用10 min, 用于SDS-PAGE和Western blot鉴定。分别配制12%分离胶和5%积层胶，用于SDS-PAGE检测。点样后进行电泳，80 V电泳1 h, 120 V电泳2 h; 电泳结束，将凝胶放入考马斯亮蓝染色液中，置于室温染色30 min, 经脱色液脱色后，观察蛋白表达情况。用同样方法将电泳后的蛋白转印至0.2 μm PVDF膜，在100 V电压下湿转1.5 h; 放入5%脱脂乳在室温条件下封闭2 h后，利用 1×PBST反复清洗PEDV膜并加入小鼠抗His标签的单克隆抗体作为一抗，辣根过氧化物酶标记的标记山羊抗鼠IgG为二抗，依次经室温孵育1 h后进行ECL显色。

1.5 真核表达质粒的转染与蛋白表达和鉴定

使用Promega中剂量质粒提取试剂盒制备无内毒素质粒pCMV-Nsp6、pCMV-Nsp6-1、pCMV-Nsp6-2和pCMV-Nsp6-3备用，将IPEC-J2细胞铺至24孔板中，调整细胞密度为5×105个/孔，待细胞长成单层后进行转染。向无菌EP管中依次加入50 μL无血清Opti-MEM培养液、转染试剂Lipo3000(LipofectamineTM 3000 Transfection Reagent, Thermo, L3000001)3 μL及去内毒素的重组质粒1 μg, 轻柔混匀，室温作用5 min; 向EP管中加入P3000 (LipofectamineTM 3000 Transfection Reagent, Thermo, L3000001) 2 μL,轻柔混匀，室温作用20 min; 清洗IPEC-J2细胞单层，每孔加入150 μL无血清的DMEM培养液，并向孔板中均匀滴加转染试剂。转染 24 h收集细胞，再通过以鼠抗HA标签单抗为一抗的免疫荧光法(IFA)和以小鼠抗Nsp6多抗为一抗的Western blot检测法来判定Nsp6及截短蛋白在细胞中的表达情况。

1.6 PEDV Nsp6蛋白的纯化及多克隆抗体的制备

取200 mL诱导后的重组大肠杆菌pSUMO-Nsp6/Rosetta菌液，按照1.4所述方法制备蛋白样并进行SDS-PAGE;电泳结束后，将凝胶放入提前配制好的低温KCl溶液中染色10 s, 使用刀片切下白色的目的带并将其放入含2 mL电泳缓冲液的透析袋中浸没；正向100 V电泳2 h后，再反向电泳10 min, 使蛋白从胶中析出；取出剩余胶条，将透析袋浸没于1×PBS中，4 ℃平衡12 h; 收集透析袋中溶液获得纯化的目的蛋白。

每100 μg纯化的PEDV Nsp6蛋白与100 μL弗氏完全佐剂混合，充分乳化后分别在第0、7和14天按每只50、50和100 μg的剂量腹腔注射免疫4周龄BALB/c小鼠。第3次免疫完成后7 d, 采集小鼠血清，并采用间接ELISA方法测定血清抗体效价。以PEDV CH/HLJ/18株细胞培养毒包被酶标板，封闭后，按照1∶20、1∶40、1∶80……1∶20 480倍比稀释待检血清并孵育，再添加辣根过氧化物酶标记的山羊抗鼠IgG作为二抗，加入显色液作用后终止反应，并用全波长酶标仪读取各孔OD450 nm值。不同稀释度血清与阴性对照OD值比值(P/N)≥2的最大稀释度判定为血清抗体的效价。

1.7 鼠抗PEDV Nsp6蛋白多克隆抗体的特异性检测

通过Western blot首先验证鼠抗PEDV Nsp6蛋白多克隆抗体与Nsp6蛋白的结合情况。先将纯化的Nsp6蛋白样转印至PVDF膜，加入1∶200稀释的多克隆抗体孵育后再加入HRP标记山羊抗鼠IgG作为二抗，最后进行ECL显色。为检测多克隆抗体与PEDV培养物结合的情况，将PEDV细胞培养物及IPEC-J2细胞蛋白样转印至PVDF膜，按1∶200加入稀释后的多克隆抗体孵育，再加入HRP标记山羊抗鼠IgG作为二抗，最后进行ECL显色。

2、结果

2.1 目的基因的扩增及重组质粒的鉴定

提取PEDV的RNA,并反转录成cDNA,以cDNA为模板，扩增Nsp6基因片段并将其构建到重组质粒pSUMO-Nsp6,经过PCR鉴定，可获得大小为840 bp的目的条带(图1A)。再利用限制性内切酶BamHⅠ、XhoⅠ进行双酶切鉴定，可以获得大小约为5 598 bp的载体片段及大小约为840 bp的目的条带(图1B)。

以pSUMO-Nsp6质粒为模板，利用EcoRⅠ及XhoⅠ切割下Nsp6并连接至pCMV-HA真核表达载体上，获得重组质粒pCMV-Nsp6。根据SMART网站对Nsp6功能域的预测，将Nsp6基因分为3段，分别连接到pCMV-HA真核表达载体上，构建出pCMV-Nsp6-1、pCMV-Nsp6-2和pCMV-Nsp6-3三种重组质粒，并进一步进行PCR鉴定，获得长度分别为840、258、210 和402 bp的目的片段(图2A);再次经过限制性内切酶进行单、双酶切鉴定后获得相应大小的目的片段(图2B)。

图1 重组质粒pSUMO-Nsp6的PCR(A)和酶切鉴定(B)   

图2 重组质粒pCMV-Nsp6、pCMV-Nsp6-1、pCMV-Nsp6-2和pCMV-Nsp6-3的PCR (A）和酶切鉴定（B)

2.2 Nsp6蛋白原核表达及纯化鉴定

将鉴定正确的重组菌pSUMO-Nsp6/Rosetta进行大量培养，用IPTG诱导蛋白表达。经SDS-PAGE分析后结果如图3A所示，诱导后菌体和超声后菌体沉淀及上清液中，在47 kDa处可见目的蛋白表达条带。以带His标签的单克隆抗体为一抗通过Western blot对其进一步鉴定，结果表明可在正确位置出现特异性条带(图3B)。

图3 重组Nsp6蛋白SDS-PAGE分析(A)和Western blot鉴定(B)   

2.3 鼠抗Nsp6多克隆抗体的鉴定及效价的测定

将纯化的Nsp6蛋白免疫小鼠，3次免疫后收集小鼠血清。为了验证所制多抗是否能够与Nsp6蛋白相结合，利用Western blot法分别检测含有SUMO标签的Nsp6蛋白及PEDV病毒培养物中的Nsp6蛋白与制备的鼠抗PEDV Nsp6多克隆抗体的结合情况，结果如图4所示，分别检测到约为47 kDa大小的含SUMO标签的Nsp6及约为32 kDa大小的PEDV Nsp6 蛋白条带，说明所制多抗能够与含SUMO标签的Nsp6蛋白和PEDV的Nsp6蛋白相结合。利用间接ELISA检测免疫小鼠血清抗体效价，结果如图5所示，P/N≥2时，血清最大稀释比例为 1∶10 240,即制备的鼠抗Nsp6多克隆抗体的效价为1∶10 240。

2.4 Nsp6截短片段的真核表达及鉴定

为确定连接真核表达载体的Nsp-6及其截短蛋白在IPEC-J2细胞中的表达情况，首先利用IFA检测Nsp6及各截短片段转染至IPEC-J2细胞中的表达情况，结果如图6A所示。以鼠抗HA标签抗体作为一抗，FITC标记山羊抗小鼠IgG作为二抗，转染后4种质粒均可在IPEC-J2细胞中检测到绿色荧光，表明目的蛋白获得表达。再利用Western blot检测pCMV-Nsp6、pCMV-Nsp6-1、pCMV-Nsp6-2、pCMV-Nsp6-3在IPEC-J2细胞中的表达，结果如图6B所示。在鼠抗Nsp6多克隆抗体的作用下，分别在32、10.6、8.7和15 kDa的位置检出符合预期大小的蛋白条带，表明4种蛋白在IPEC-J2细胞中均获得表达。

图4 鼠抗Nsp6多克隆抗体的鉴定   

图5 间接ELISA方法检测鼠抗Nsp6多克隆抗体效价  

图6 Nsp6及其截短基因的真核表达(A,比例尺=100 μm)及Western blot鉴定(B)

3、讨论

PEDV是具有囊膜的单链正向RNA病毒，其RNA基因组大小约为28 kb[6]。PEDV基因组编码4种结构蛋白：刺突蛋白(S)、囊膜蛋白(E)、膜蛋白(M)和核衣壳蛋白(N),以及16种非结构蛋白(Nsp1～Nsp16)和辅助蛋白ORF3[7]。非结构蛋白是冠状病毒复制和形成转录复合物(RTC)以及逃避免疫系统的关键要素。通过劫持内质网膜，Nsps帮助病毒建立RTC[8]。目前对于与PEDV同属冠状病毒成员SARS-CoV2的研究表明，Nsp6蛋白也能够引起细胞自噬[9]。Cottam 等[10]发现Nsp6可以诱导宿主细胞中的内质网形成自噬体。通过突变Nsp6可以导致SARS-CoV-2的毒性降低，从而影响病毒的致病性[11]。对以传染性支气管炎病毒为代表的禽冠状病毒研究也证明了Nsp6损害了由饥饿诱导的自噬溶酶体的形成[12],进一步证明了Nsp6蛋白对自噬的复杂调节作用。Nsp6、 Nsp1及Nsp12蛋白具有干扰素拮抗作用[13]。此外， Nsp6能够与TANK激酶1(TBK1)结合并在不影响TBK1的磷酸化的基础上抑制IRF3的磷酸化，从而减少Ⅰ型干扰素的产生[14]。Nsp6和Nsp13能够通过抑制信号转导和转录激活因子1和2(STAT1和STAT2)的磷酸化进而抑制干扰素信号的传导[15]。

Nsp6 在PEDV感染IPEC-J2细胞的过程中也对诱发细胞自噬产生重要的作用[4],然而目前针对Nsp6蛋白引起细胞自噬产生的具体功能域研究则鲜有报道。为进一步确定Nsp6蛋白诱导细胞自噬产生的关键功能域，本试验通过SMART网站对Nsp6蛋白的潜在结构域进行预测，评估了蛋白可能的跨膜区域。在尽量不破坏其原有的结构域基础上，将Nsp6基因分段为3段，分别构建真核表达质粒，并转染至IPEC-J2细胞中表达。

为确定Nsp6及其分段基因的真核表达情况，本试验构建重组原核表达质粒pSUMO-Nsp6,并将其在大肠杆菌中原核表达，获得的蛋白用于制备抗Nsp6 蛋白的多克隆抗体。Western blot结果表明，该抗体既可以与含SUMO标签的Nsp6原核表达蛋白结合，又可以与PEDV的天然Nsp6蛋白相结合，说明该抗体能够用于识别PEDV,且通过Western blot确定了Nsp6及其分段基因在IPEC-J2细胞中均得到了表达。

总之，本文为进一步确定Nsp6蛋白诱导细胞自噬的关键功能域做好了铺垫，为阐明PEDV在感染宿主上皮细胞IPEC-J2过程中的分子机制提供理论基础，对深入了解PEDV的致病机理提供重要线索，也为研究PEDV的抗病毒药物提供重要的靶点。

基金资助:黑龙江省自然科学基金项目(LH2021C042);东北农业大学“青年才俊”项目(20QC19);

文章来源:陈东奇,郑殿重,魏志颖等.猪流行性腹泻病毒Nsp6蛋白的分段表达及多克隆抗体制备[J].畜牧与兽医,2024,56(01):91-97.