肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae,Kp)作为一种人兽共患病原菌，广泛分布于动物呼吸道、泌尿生殖道、肠道以及土壤、水和各种植物[1]。通常情况下，肺炎克雷伯菌定殖于口咽、鼻咽和胃肠道黏膜表面，不会引起动物发病，但当机体免疫力降低时，该菌会迅速繁殖，导致发病甚至暴发流行性疾病[2,3]。2017年，世界卫生组织将肺炎克雷伯菌列为具有“危急威胁”的细菌[4]。研究表明，肺炎克雷伯菌可引起动物肺部和泌尿系统感染，严重时可导致败血症和菌血症[5]。肺炎克雷伯菌有明显荚膜，对外界抵抗力强，对抗生素易产生耐药性 ; 随着抗生素的滥用，多重耐药的肺炎克雷伯菌种类不断增加，给临床治疗带来更大的困难和障碍[6]。研究发现，从人和动物分离到的部分肺炎克雷伯菌具有相同分型和相似表型，表明肺炎克雷伯菌具有在人与动物之间传播的潜力[7]。肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶于1990年在美国被发现，产碳青霉烯酶的ST258型肺炎克雷伯菌在全球范围内传播，不仅危害动物健康，并通过环境生态链将其所携带的耐药基因传递至人类，给人类健康构成威胁[8]。因此，加强对不同动物源肺炎克雷伯菌的流行病学调查、耐药性和致病性的系统分析，对于控制耐药菌株的跨种传播、精准防控和指导临床用药具有重要的意义[9]。本试验从赛鸽肺组织中分离到1株肺炎克雷伯菌，并对其进行生物学特性分析，为肺炎克雷伯菌的临床诊断和菌株流行特点以及多重耐药菌株的防控和净化提供参考。

1、材料与方法

1.1 样品采集

自2021年5月—2022年4月采集江苏省某养鸽场患呼吸道疾病赛鸽的口鼻拭子48份(口拭子26份，鼻拭子22份),收集同一栋病死赛鸽10只，体表消毒后无菌条件下剖检，取肺组织10份，低温送至实验室。

1.2 标准菌株

药敏试验使用的质控菌株为大肠杆菌标准菌株ATCC25922、生物被膜形成能力试验使用的质控菌株为鼠伤寒沙门菌标准菌株ATCC14028,均由长江大学动物科学技术学院动物重要病原分子生物学实验室保存。

1.3 主要试剂

革兰染色剂、LB液体培养基和LB固体培养基，均购自北京索莱宝生物科技有限公司；细菌基因组提取试剂盒和病毒基因组提取试剂盒，均购自北京天根生化科技有限公司；DNA Marker和2×Taq PCR Master Mix酶，均购自北京聚合美生物科技有限公司；细菌微量生化管和药敏片，均购自杭州微生物试剂有限公司。

1.4 主要仪器

梯度PCR仪，美国伯乐BIO-RAD公司；恒温培养摇床，上海知楚仪器有限公司；凝胶成像系统，上海培清科技有限公司；电泳仪，莱普特科学仪器(北京)有限公司。

1.5 实验动物

80枚SPF级鸡胚，购自荆州市峪口禽业养殖公司(生产许可证号：421003204120009),鸡胚以孵化器进行孵化，孵化率达70%～75%。

1.6 试验方法

1.6.1 病原PCR鉴定

将口鼻拭子用LB液体培养基进行增菌，分别按照细菌和病毒基因组提取试剂盒说明书提取口鼻拭子和肺组织的核酸(RNA进行反转录);以提取的基因组为模板，通过PCR分别检测鸽圆环病毒(Pigeon circovirus, PiCV)(F:TGGTACAGCGAGGAAAA,R:CACTGTGGGACTCAACG)、新城疫病毒(Newcastle disease virus, NDV)(F:ACCAAACAGCGATTCTGTGAGTTAC,R:CAGGACTGA-TGCCATACCC)、大肠杆菌O157(F:GTGTCCATTTATACGGACATCCATG,R:CCTATAACGTCATGCCAATATTGCC)、肺炎克雷伯菌(F:TGATTGCATTCGCCACTGG,R:GGTCAACCCAACGATCCTG)和沙门菌(Salmonella)(F:AACAGTCACTTTGAGCATGGGTT,R:GAGTGACTTTGTCTGCTCTTCA),PCR反应体系和扩增条件参照参考文献[10,11]。

1.6.2 细菌的分离、形态学和生化鉴定

取PCR检测为阳性的样品，使用接种环蘸取样品在LB固体培养基上划线分离，37 ℃培养18 h, 连续纯化3代，观察菌落形态特征；取分离菌株进行涂片和革兰染色，在光学显微镜下观察菌体形态和染色特征；接种环挑取单菌落进行拉丝试验，测量拉丝长度；分离菌株经PBS清洗3次，2.5%戊二醛重悬，4 ℃固定24 h, 乙醇梯度脱水、冷冻干燥，喷金后在扫描电子显微镜下观察其形态特征；取10 μL分离菌株培养液接种到细菌微量生化管中，按照说明书进行生化反应并依据参考文献[12]进行结果判定。

1.6.3 分离菌株的PCR鉴定和16S rRNA基因测序

根据肺炎克雷伯菌特有的khe基因合成特异性引物[13],以提取的分离菌株DNA为模板进行PCR扩增。以16S rRNA通用引物27F和1492R进行PCR扩增，PCR反应体系和扩增条件参照参考文献[14]。PCR扩增产物送生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序，将测序结果上传至NCBI数据库的BLAST检索系统进行比对，用MEGA 11.0软件以邻接法构建进化发育树。

1.6.4 多位点序列分型(Multilocus sequence typing, MLST)分析

根据MLST网站提供的肺炎克雷伯菌信息，合成7对管家基因(tonB、phoE、mdh、pgi、infB、rpoB和gapA)的引物，以提取的分离菌株DNA为模板进行PCR扩增，PCR反应体系和扩增条件参照MLST网站。PCR扩增产物送生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序，将测序结果上传至MLST数据库进行比对，获取分离菌株的序列分型(Sequence type, ST)[15]。

1.6.5 毒力基因检测

合成肺炎克雷伯菌常见毒力基因的引物(表1)[16],以提取的分离菌株DNA为模板，通过PCR分析分离菌株携带毒力基因rmpA、magA、wcaG、uge、wabG、cf29a、fimH、KfuBC、ybt、allS、iroNB和iucB的情况，PCR反应体系和扩增条件参照参考文献[16]。

表1 肺炎克雷伯菌毒力基因引物序列

1.6.6 荚膜血清分型和wzi基因测序

合成肺炎克雷伯菌7种荚膜血清型基因和荚膜多糖基因座末端保守基因wzi的引物(表2)[17],以提取的分离菌株DNA为模板，通过PCR分析分离菌株的荚膜血清型和wzi基因。PCR反应体系和扩增条件参照参考文献[17]。同1.6.3对PCR扩增产物测序、对测序结果进行BLAST比对并构建wzi基因的进化发育树。

1.6.7 致病性分析

收集处于对数生长期的分离菌株菌液，平板计数后将菌液调整至攻毒浓度；40只孵化的1日龄健康雏鸡随机分成4个组，高剂量感染组(1×1010 CFU/mL)、中剂量感染组(1×109 CFU/mL)和低剂量感染组(1×108 CFU/mL)每只腹腔注射0.5 mL菌液；对照组雏鸡腹腔注射0.5 mL无菌生理盐水。人工感染7 d内观察各组雏鸡的临床症状，记录死亡数量，绘制生存曲线并计算半数致死量(Median lethal dose, LD50);剖检感染致死的雏鸡，观察各脏器组织的病理变化并进行细菌的分离和PCR鉴定；以多聚甲醛固定具有典型病变的肺脏、肝脏和小肠组织，制成石蜡切片后进行镜检观察病理组织学变化。

表2 荚膜血清型基因和wzi基因引物序列

1.6.8 生物被膜形成能力测定

在96孔板中加入处于生长稳定期的菌悬液200 μL,37 ℃培养24 h, 并以LB液体培养基作为阴性对照(Control),以鼠伤寒沙门菌标准菌株ATCC14028作为对照菌株；PBS洗涤后加入200 μL 0.5%结晶紫染色30 min; 弃液并加入200 μL冰醋酸，于550 nm处测量光密度(Optical density, OD)。按照以下标准判定生物被膜形成能力：OD≤ODc为无成膜能力；ODc<OD≤2ODc为弱成膜能力﹔2ODc<OD≤4ODc为中等成膜能力；OD>4ODc为强成膜能力(ODc为Control的平均值)[18]。

1.6.9 耐药基因检测

合成肺炎克雷伯菌常见耐药基因的引物[19],以提取的分离菌株DNA为模板，通过PCR分析分离菌株携带耐药基因blaSHV、blaCTX、blaTEM、blaIMP、blaOXA、blaDHA、β-NAD、β-IMP、tetA、tetB、tetC、tetM、sul1、sul2、sul3、gyrA、gyrB、ermF、ereD、aadA1、aadA2、aadB和lnuH的情况，PCR反应体系和扩增条件参照参考文献[19]。

1.6.10 药敏试验

取分离菌株菌液涂布在LB固体培养基上，采用纸片扩散法(Kirby-Bauer, K-B),将药敏片贴在培养基表面，37 ℃培养24 h, 测量抑菌圈直径；以大肠杆菌标准菌株ATCC25922进行质控试验，试验重复3次。根据杭州微生物试剂有限公司和美国临床实验室标准化委员会(Clinical and Laboratory Standards Institute, CLSI)的标准[20]判定分离菌株对氨苄西林、四环素、氧氟沙星、利福平、呋喃唑酮、头孢曲松、头孢美唑、丁胺卡那、复方新诺明和多黏菌素的敏感程度。

1.6.11 中药体外抑菌试验

选取中医和中兽医中常见的针对呼吸道和肠道感染病症的42种中药对分离菌株进行体外抑制试验：蒲公英、秦皮、五倍子、首乌藤、枳壳、款冬花、大叶青、黄芩、丁香、白术、五味子、鱼腥草、金银花、超僵蚕、茯苓、全蝎、羌活、乌梅、生地榆、连翘、天竺黄、桑皮、板蓝根、熟大黄、炙白附子、独活、罗汉果、桑白皮、川贝母、苏子、胖大海、荆芥、桔梗、黄连、明雄黄、肉桂、薄荷、半夏、槟榔、石榴皮、三七、朱砂。称量10 g中药剪碎并分别置于100 mL无菌蒸馏水中浸泡2 h, 大火煮沸转小火熬制2 h, 过滤取药渣再加入100 mL无菌蒸馏水，重复第1次熬制，合并2次滤液，浓缩至10 mL,制备成终浓度为1 g/mL的中药药液。将1 mL中药药液注入空白药敏纸片中，浸泡过夜取出烘干备用。取分离菌株菌液涂布在LB固体培养基上，将含中药药敏纸片贴在培养基表面，以无菌超纯水作为阴性对照，37 ℃培养24 h, 测量抑菌圈直径。在96孔板内每孔加入100 μL LB液体培养基，第1孔加入1 g/mL的中药药液100 μL,依次进行二倍稀释，每孔加入100 μL菌液，37 ℃培养24 h, 观察中药对分离菌株的最低抑菌浓度(Minimum inhibitory concentration, MIC),将孔内LB液体培养基清亮、无细菌生长判定为阴性，孔内混浊、有细菌生长判定为阳性。取20 μL孔内培养物在LB固体培养基上涂布均匀，37 ℃培养24 h, 以LB固体培养基上无细菌生长的最低浓度判定为最低杀菌浓度(Minimum bactericidal concentration, MBC)。

2、结果

2.1 病原PCR鉴定

病鸽口鼻拭子和肺组织的病原筛查PCR结果显示，病料中鸽圆环病毒、新城疫病毒、大肠杆菌O157和沙门菌均为阴性，肺炎克雷伯菌的检测结果为阳性，且条带大小与阳性模板所扩增出的条带大小一致(图1),初步判定该养殖场的病鸽疑似感染肺炎克雷伯菌。经PCR检测，58份样品中肺炎克雷伯菌为阳性的样品有7份(其中5份来源于肺组织，1份来源于口拭子，1份来源于鼻拭子)。在7份阳性样品中，最终分离到5株肺炎克雷伯菌，均来自肺组织。

图1 病原PCR检测   

2.2 细菌的分离、形态学和生化鉴定

挑取其中1株分离菌株进行革兰染色，在光学显微镜下可见呈单个、红色杆状的革兰阴性菌(图2A);分离菌株在LB固体培养基上生长为露珠样、表面光滑的灰白色黏液状菌落(图2B);拉丝试验结果显示，拉丝长度小于5 mm, 表明分离菌株为超黏阴性菌株(图2C);扫描电子显微镜下观察到分离菌株呈两端钝圆、杆状(图2D);生化鉴定结果显示，分离菌株发酵葡萄糖、D-核糖、阿拉伯糖、蔗糖、乳糖、果糖、蕈糖、密二糖和棉子糖；七叶苷水解试验和硝酸盐还原试验呈阳性；具有赖氨酸脱羧酶和精氨酸双水解酶活性；能利用甘露醇和山梨醇，与肺炎克雷伯菌的生化特性一致。

图2 细菌的分离鉴定和培养特性  

2.3 分离菌株的PCR鉴定和16S rRNA基因测序

分离菌株进行khe基因PCR鉴定，扩增出大小约为428 bp的特异性条带(图3A),与目的条带大小相符合；利用16S rRNA通用引物进行PCR扩增，分离菌株可扩增出约1 500 bp大小的条带(图3B);16S rRNA进化发育树如图3C所示，分离菌株与肺炎克雷伯菌MZ389265.1聚为一支，同源性为99.79%。综上，将分离菌株判定为肺炎克雷伯菌，命名为Kp0906。

图3 分离菌株Kp0906的分子鉴定   

2.4 MLST分析

管家基因序列比对结果显示，分离菌株Kp0906的7个等位基因gapA、infB、mdh、pgi、phoE、rpoB和tonB的编号分别为8、25、48、10、60、24和91,属于ST443型。

2.5 毒力基因检测

毒力基因PCR检测结果显示，分离菌株Kp0906携带fimH、uge和wabG三种毒力基因。

2.6 荚膜血清分型和wzi基因测序

荚膜血清型PCR检测结果显示，分离菌株Kp0906未检出K1、K2、K3、K5、K20、K54和K57基因；对wzi基因进行PCR扩增，在580 bp处出现特异性条带；wzi基因的进化发育树如图4所示，确定分离菌株Kp0906的wzi等位基因为wzi16(图4),即荚膜血清型是K16型。

2.7 致病性分析

分离菌株Kp0906感染健康雏鸡后，3个感染组雏鸡均出现精神沉郁、食欲减退、排出白色稀粪等临床症状；感染第4天，高剂量感染组(1×1010 CFU/mL)雏鸡全部死亡，中剂量感染组(1×109 CFU/mL)雏鸡死亡5只，低剂量感染组(1×108 CFU/mL)雏鸡死亡1只；感染第5天，低剂量感染组(1×108 CFU/mL)雏鸡死亡1只；感染第7天，感染组其余雏鸡均恢复正常；试验期间对照组雏鸡均未见异常(图5A)。剖检发现，感染组死亡雏鸡的肺脏、肝脏和小肠组织出现不同程度肿大、出血，以高剂量感染组雏鸡的病变最为显著(图5B)。病理组织学观察发现，与对照组相比，感染组雏鸡的肺泡隔毛细血管和小静脉扩张，管腔内充满红细胞；肝细胞肿大，中央静脉及周围肝窦扩张充血；小肠上皮细胞坏死、脱落，小肠绒毛断裂，小肠管壁变薄，表明感染分离菌株Kp0906具有一定致病性，可导致雏鸡肺脏、肝脏和小肠组织出现严重损伤(图5C)。经统计和计算，分离菌株Kp0906的LD50为4.68×109 CFU/mL。

图4 分离菌株Kp0906的血清型鉴定   

图5 分离菌株Kp0906的致病性分析   

2.8 生物被膜形成能力测定

结晶紫染色结果如图6所示，分离菌株Kp0906的OD550 nm为0.101,鼠伤寒沙门菌ATCC14028的OD550 nm为0.064,ODc为0.043,分离菌株Kp0906的OD550 nm值大于2ODc且小于4ODc, 判定分离菌株Kp0906具有中等成膜能力。

图6 分离菌株Kp0906的生物被膜形成能力   

2.9 耐药基因检测

耐药基因PCR检测结果显示，分离菌株Kp0906携带blaSHV、sul1、tetM和blaTEM四种耐药基因。

2.10 药敏试验

结果如表3所示，分离菌株Kp0906对氨苄西林、四环素、氧氟沙星、利福平和呋喃唑酮耐药；对头孢曲松、头孢美唑、丁胺卡那、复方新诺明和多黏菌素敏感。

2.11 中药体外抑菌试验

在体外抑菌试验中，中药明雄黄对分离菌株Kp0906抑菌作用最强，抑菌圈直径为20 mm, MIC值为15.63 mg/mL,MBC值为31.25 mg/mL;乌梅的抑菌圈直径为11 mm, MIC值为62.5 mg/mL,MBC值为125 mg/mL;黄连的抑菌圈直径为8 mm, MIC值为250 mg/mL,MBC值为500 mg/mL;金银花和款冬花对分离菌株Kp0906的抑菌效果较弱；蒲公英、秦皮、五倍子、首乌藤、枳壳、大叶青、黄芩、丁香、白术、五味子、鱼腥草、超僵蚕、茯苓、全蝎、羌活、生地榆、连翘、天竺黄、桑皮、板蓝根、熟大黄、炙白附子、独活、罗汉果、桑白皮、川贝母、苏子、胖大海、荆芥、桔梗、肉桂、薄荷、半夏、槟榔、石榴皮、三七和朱砂对分离菌株Kp0906无抑菌作用。

表3 分离菌株Kp0906的药敏试验

3、讨论

肺炎克雷伯菌是革兰阴性条件致病菌，属肠杆菌科(Enterobacteriaceae),可引起肺炎、肝脓肿和血液感染等[21]。目前，世界上肺炎克雷伯菌有2 000多种ST型，其中美国、瑞典和挪威等欧美国家以ST258型为主，ST11型是我国医院感染肺炎克雷伯菌的主要流行ST型，两者仅有1个管家基因(tonB)存在差异，属于同一个克隆复合体CC258[22]。本试验从患有呼吸道疾病的赛鸽肺组织中成功分离到1株肺炎克雷伯菌，通过MLST鉴定为ST443型，MLST数据库中该型主要分布于欧洲，来源于人。2022年欧洲卡芬贝格治疗中心从人的咽喉中分离到ST443型肺炎克雷伯菌，同年我国从2型糖尿病人群粪便标本中分离出8株ST443型肺炎克雷伯菌，从体检人群粪便标本中分离出6株ST443型肺炎克雷伯菌[23]。鸽源ST443型肺炎克雷伯菌病例的发现，提示肺炎克雷伯菌作为一种人兽共患病病原体，具有潜在的传染人和其他动物的风险，对人和动物健康及公共卫生安全存在潜在威胁，应引起高度重视。

肺炎克雷伯菌的致病性与编码特定毒力因子的毒力基因有关，这些基因使细菌靶向免疫系统，导致多种疾病[24]。本试验分离的鸽源肺炎克雷伯菌ST443型菌株携带fimH、uge和wabG三种毒力基因。fimH是编码1型菌毛的毒力基因，与黏附素有关，黏附素可促使细菌粘附于宿主表面形成生物被膜，进而增加致病风险[25];uge和wabG均为编码脂多糖的毒力基因，脂多糖可维持菌株细胞壁结构稳定性，抵抗吞噬作用[26]。在肺炎克雷伯菌感染过程中，荚膜是最重要的毒力因子之一；目前已知的荚膜血清型主要有80多种，最常见的血清型为K1、K2、K5、K20、K54和K57,其中K1和K2型约占肺炎克雷伯菌的70%[27]。本试验血清型鉴定发现，分离菌株Kp0906不属于常见的血清型，wzi基因测序分析发现其荚膜血清型是K16型。肺炎克雷伯菌的荚膜血清型与毒力强弱密切相关，其中K1、K2、K16和K28等荚膜血清型与高毒力肺炎克雷伯菌相关[28]。在雏鸡的致病性试验中，高剂量感染组可导致雏鸡在感染第4天全部死亡，剖检发现雏鸡肺脏、肝脏和小肠等脏器出现不同程度的肿大、出血，结合其携带的fimH、uge和wabG毒力基因情况，进一步说明该鸽源肺炎克雷伯菌分离菌株具有一定的致病性。

传统治疗肺炎克雷伯菌感染可选择多种抗生素，如环丙沙星、头孢菌素和妥布霉素等，杀菌效果显著[29]。随着广谱高效抗生素的问世和过度使用，细菌耐药性不断增强，耐药性肺炎克雷伯菌感染给养殖业的发展和临床治疗带来很大困难，因此了解和分析肺炎克雷伯菌耐药性迫在眉睫[30]。本试验分离的鸽源肺炎克雷伯ST443型菌株携带blaSHV、blaTEM、tetM和sul1四种耐药基因；药敏试验结果显示，分离菌株Kp0906对氨苄西林、四环素和氧氟沙星等抗生素耐药；生物被膜试验结果显示，分离菌株Kp0906具有中等生物被膜形成能力，与其在药敏试验中表现的多重耐药情况相符，预示着治疗该菌感染具有潜在的困难。中药大多为天然植物和矿物质药物组成，富含多种抑菌活性物质，毒副作用低，无耐药性，可广泛应用于畜禽疾病防治[31]。研究表明，明雄黄粉对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌具有明显抑制作用[32];乌梅和黄连对产色葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、大肠杆菌和无乳链球菌均具有抑制效果[33]。黄连、黄芩与恩诺沙星、沙拉沙星配伍，能显著提高药物的治疗效果，增强家禽体质[34]。42味中药的体外抑菌试验结果显示，中药明雄黄对分离菌株Kp0906抑菌作用最强，因此，在临床上治疗肺炎克雷伯菌感染时，应充分考虑其流行性和耐药性，在源头控制的基础上结合敏感抗生素和中药联合用药，做到精准防控和综合施治。

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基金资助:国家自然科学基金项目(32273006);

文章来源:陈瑞格,李赟辉,项维,等.鸽源ST443肺炎克雷伯菌的分离鉴定和生物学特性分析[J].中国兽医杂志,2024,60(05):46-55.