心肌梗死(myocardial infarction,MI)引起的大量心肌细胞丢失导致心脏病理性重构和心力衰竭的发生，如何促进心肌再生是修复受损心脏的关键问题，也是生物医学研究的前沿和热点问题。类似的再生医学挑战同样存在于其他重要领域。例如在神经科学方面，研究人员对如何有效促进神经元和神经组织再生以治疗神经退行性疾病和神经损伤进行了积极探索。这些努力显示了再生医学在生物医学研究中的广泛应用和重要性。经过近20年的探索，心肌细胞再生主要源于原有心肌细胞的增殖已经得到广泛共识。近年来该领域研究的迅猛发展使人们对心肌细胞再生有了更深入的认识。心肌细胞再生的内源性细胞和微环境特征、外源性影响因素，以及分子生物学机制和干预策略等方面的知识在不断地更新和丰富。因此，我们认为有必要对哺乳动物心肌细胞再生的定义、特征、评价和研究方法、调控机制和干预策略等进行梳理，形成共识，并明确尚需进一步阐明的重要问题，以推动该领域研究的进一步深化和转化应用。

该共识声明重点聚焦于心肌细胞的内源性再生，也涉及一些基于细胞疗法激活内源性心肌细胞再生的研究进展。因无法包含该领域中所有的出版物，在本共识中主要引用了一些支撑共识的代表性研究。

一、心肌细胞再生研究变迁

传统观点认为，成年哺乳动物的心肌细胞是终末分化细胞，不具有增殖或自我更新的能力，个体成熟后心肌细胞数量保持不变。因此，MI发生后，心肌难以自我修复。

为了找到替代损失心肌细胞的方法，研究者开始探索成体干细胞/心脏前体细胞移植的可能性。这些细胞类型因其独特的定向分化潜能，被广泛认为是新生心肌细胞的理想来源。然而，尽管在动物模型和初步的临床试验中观察到了心功能的改善，但进一步研究显示，这些细胞并不能直接分化为心肌细胞，而主要是通过旁分泌机制促进血管新生和抗心肌细胞死亡等方式对心脏产生有益效应[1,2]。基于这一认识，研究者尝试将具有高分化潜力的多能干细胞——包括胚胎干细胞(embryonic stem cells,ESCs)和诱导性多能干细胞(induced pluripotent stem cells,i PSCs)在体外诱导分化成为心肌细胞，再移植到受损的心脏中。实验结果显示由多能干细胞分化的心肌细胞可以与受体心脏心肌细胞实现一定的功能整合，但其在移植后难以长期驻留，并存在发生心律失常的风险[3]。

在20世纪50年代到60年代，由于核武器试验，试验区域大气中的碳-14 (14C)水平急剧增加，这些14C被植物吸收并通过食物链进入人体，整合到新形成的DNA中。随着核试验停止，大气中的14C水平逐渐下降。利用这一现象，2009年Bergmann等研究者通过测量不同出生年份的人心肌细胞中的14C水平，来估计这些细胞的形成时间。研究结果令人惊讶地发现，心肌细胞在成年后存在更新和再生的可能性，尽管这一增殖率随着年龄逐渐降低：25岁的人每年大约有1%的心肌细胞得到更新，到75岁则降低到0.45%[4]。这一发现挑战了心肌细胞是不再增殖的终末分化细胞这一传统观点，证明了人终身均存在心肌细胞更新的可能性，从而为心肌再生研究提供了重要依据。

低等动物，如斑马鱼和两栖类动物在其一生中具有强大的心脏再生能力。在这些非哺乳动物物种中，较低的循环氧浓度[5]和体温[6]等潜在因素可能与其心脏再生能力有关。新生心肌细胞主要来源于原有心肌细胞去分化和增殖[7]。然而，哺乳动物与非哺乳动物在心脏再生方面的差异机制仍不完全清楚。

2011年，Porrello等[8]报道了哺乳动物在出生后特定时间窗内短暂具有心肌再生能力。他们对出生1天的小鼠进行了部分心尖切除，以模拟心脏损伤。随后的观察显示，这些小鼠的心脏发生了明显的再生现象，损伤部分被新生的心肌细胞所替代。更为重要的是，谱系示踪表明这些新的心肌细胞是由原有的心肌细胞增殖而来的。这种心肌的再生能力随着小鼠的年龄增长而迅速减退，在出生第7天后，小鼠的心脏再生能力显著降低，不足以修复损伤心肌[8]。“哺乳动物心肌再生的主要来源为原有心肌细胞”这一结论随后被多同位素成像质谱(multi-isotope imaging mass spectrometry,MIMS)[9]，以及多种谱系示踪工具所证实[10]。这一结论随后在大动物实验模型中被进一步证实：新生猪在出生2天内进行MI手术，可在术后30天观察到显著的心肌细胞再生与心肌修复[11]。这些研究为心肌再生和心脏修复领域开辟了新的方向，吸引了全球研究者对原位心肌细胞再生调控的深入探讨。

二、心肌细胞再生定义

内源性心肌细胞增殖是哺乳动物心肌再生的主要方式。多项研究表明，哺乳动物成年心脏的心肌细胞更新来源于原有心肌细胞有限的有丝分裂[9,12,13]。通过预先对心肌细胞进行Lac Z标记，再对新生小鼠进行心尖切除，发现在心尖区的新生心肌组织中，绝大部分心肌细胞表达Lac Z，表明新生的心肌细胞来源于原有心肌细胞的增殖[8]。MIMS同样揭示，MI后8周内，梗死边缘区23%的心肌细胞发生DNA复制，3.2%的心肌细胞最终完成增殖[9]。成体干细胞不参与成年心肌细胞再生[14,15]。

在本共识声明中，“心肌细胞再生”定义为“通过原有心肌细胞增殖，产生新的心肌细胞并获得成熟心肌细胞功能，以补充已损失心肌细胞”的过程。值得注意的是，该过程不同于心肌细胞的多核化(细胞核发生复制但未发生细胞分裂)，以及多倍体化(单个心肌细胞核含有超过两套染色体)。

成年心肌细胞再生经历一系列特征性步骤，即去分化、增殖和再分化[8]，整个过程涉及到结构、功能及基因表达的动态变化。去分化是指相对成熟心肌细胞在形态、细胞结构、表达谱及功能等方面向幼稚阶段心肌细胞转变，表现为肌小节结构的解聚、线粒体的排出或减少、兴奋-收缩解耦联，以及呈现接近于胚胎期未成熟心肌细胞的表达谱，例如重新表达Runx1、α-SMA、Dab2、Gata4、Nkx2.5等胚胎期基因[16,17]。去分化被认为是成年心肌细胞发生增殖的必经步骤，为心肌细胞增殖提供全方位的准备。

心肌细胞增殖过程指心肌细胞重新进入细胞周期，经历有丝分裂并最终形成新的子代心肌细胞。尽管成年心肌细胞可重新进入细胞周期，但最终完成有丝分裂的比例却极低，多数细胞代之以“多核化”或“多倍体化”，即细胞核复制但不发生胞质分裂，或仅发生DNA复制。增殖后的子代心肌细胞由于各方面仍处于相对幼稚状态，尚不能与周围成熟心肌整合并参与收缩。

再分化过程指增殖后的子代心肌细胞，在基因表达、形态和功能上由相对幼稚状态重新向成熟心肌细胞分化，最终重新获得肌小节结构，与周围成熟心肌细胞建立细胞间连接，恢复兴奋-收缩耦联及正常收缩功能的过程。心肌细胞的去分化、增殖及再分化是心肌细胞再生所必经的动态过程，全面认识该过程有助于推动心肌细胞再生研究及应用转化。

三、增殖心肌细胞的特征及研究方法

具有增殖能力，或正在发生增殖的心肌细胞相较非增殖心肌细胞在细胞形态、结构、电生理、基因表达谱和代谢方式等方面表现出明显的特征。通过对这些特征进行深入研究和干预，有望寻找到促进心肌细胞增殖的关键靶点和方法。

1增殖心肌细胞的特征

1.1结构特征

1.1.1肌小节/细胞骨架蛋白

从哺乳动物胚胎期、出生后到成年阶段，伴随着心肌增殖能力的减退，心肌细胞的肌小节结构逐渐成熟，其特征为肌纤维数量和密度的增加，肌小节排列更加有序，肌小节结构蛋白的构成更加复杂。相反，新生个体心肌细胞通常体积较小，肌小节等内部结构缺乏有序排列。肌小节结构的解聚是心肌细胞发生增殖的前提，所有观察到的正在进行有丝分裂的心肌细胞都显示出肌纤维排列的紊乱，肌小节结构的消失，该过程涉及一系列肌动蛋白的解聚[18]。这些结构改变究竟是心肌细胞增殖的诱因，还是仅为心肌细胞增殖的固有步骤，尚有待进一步阐明。有研究报道，干预肌动蛋白的聚合调控心肌细胞增殖：增殖心肌细胞与非增殖心肌细胞相比，单体形式的G-actin水平升高而聚合形式的F-actin水平减少，抑制G-actin聚合为F-actin，可促进心肌细胞的去分化-增殖-再分化[19]。针对其他骨架蛋白/肌动蛋白的干预研究有助进一步探索细胞结构变化与心肌细胞增殖的关系。

1.1.2核型/多倍体型

哺乳动物出生后心肌细胞增殖能力的减退伴随着多核化与多倍体化的发生，单核2倍体心肌细胞(mononuclear diploid cardiomyocytes,MNDCMs)被认为拥有较强的增殖能力；相反，多核/多倍体心肌细胞的增殖能力较弱。通过基因工程诱导的“多倍体”斑马鱼心肌在损伤后不能再生[20]。通过对120个小鼠近交系进行研究，发现成年MNDCMs的频率在各品系差异显著(可超过7倍)。MI后心肌细胞的增殖和心脏功能恢复都与MNDCMs含量相关。全基因组关联分析揭示了Tnni3k是影响这种组成变化的基因之一，敲除Tnni3k导致MNDCMs含量升高和MI后心肌细胞增殖增加。相反，斑马鱼中Tnni3k的过度表达促进了心肌细胞的多倍体化并损害了心脏再生[21]。然而，在不同的实验模型中也观察到小鼠双核心肌细胞具有与单核心肌细胞相当的增殖能力[16]。利用更加先进的检测工具，在更多实验模型进行探索有助于进一步阐明该问题。

1.1.3线粒体结构与功能

具有再生能力的斑马鱼与新生小鼠心肌都表现出极少的线粒体含量和更少的线粒体嵴，这些结构特征导致了线粒体氧化磷酸化和细胞内活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平的减少[22]。此外，线粒体还可通过与细胞核“通讯”，以不依赖于ROS的方式调控心肌增殖。线粒体蛋白翻译被抑制引起的适度线粒体应激，可通过e IF2α激活转录因子Atf4，后者进入细胞核后上调胞质分裂相关基因Knl1表达，促进心肌细胞再生[23]。

1.2基因表达谱特征

多项针对心肌组织的RNA测序研究发现，与出生后1天(post-natal day 1,P1，依次类推)小鼠相比，P7小鼠心肌组织的细胞周期基因、糖酵解相关基因显著下调；相反，脂肪酸代谢、氧化磷酸化相关基因则表达上调[24,25]。Porrello等进一步将小鼠心肌细胞分离纯化后进行测序证实，P1与P56心肌细胞表达谱的差异表达基因主要富集在细胞周期、线粒体、细胞代谢、转录因子、心肌收缩/细胞骨架等通路。在MI后，P1与P56小鼠心肌细胞之间表达谱的主要差异表现在Wnt信号通路、细胞周期相关E2F、Foxm1转录调控网络以及自噬相关基因。MI并不能刺激P56心肌细胞获得类似于P1心肌细胞“幼稚状态”的表达谱。分离心肌细胞的ATAC-seq (Assay for Transposase-Accessible Chromatin with high throughput sequencing)揭示，P56与P1心肌细胞相比，细胞周期、炎症反应、细胞外基质(extracellular matrix,ECM)相关基因的染色质可及性降低，而有氧代谢、心肌成熟与收缩相关基因的染色质开放，是上述现象的可能机制[26]。

单细胞RNA测序技术(single-cell RNA sequencing,sc RNA-seq)为研究心肌细胞增殖提供了单细胞层面的解析精度。通过对P1和P8小鼠MI后的心脏进行单个心肌细胞核测序，发现心肌细胞可分为5个亚群(CM1～5)，其中CM4亚群在MI后变化最为显著，幼稚心肌细胞的特征性基因/细胞周期相关基因(如Mki67和CCNB1)在该亚群高表达，而成熟心肌细胞的特征性基因(如肌小节结构蛋白)在该亚群低表达，G2/M期心肌细胞在CM4亚群显著富集。该亚群心肌细胞被认为是新生小鼠心肌损伤后心肌增殖的主要来源[27]。单细胞测序联合单细胞转座酶染色质可及性测序(single-cell Assay for Transposase-Accessible Chromatin using sequencing,sc ATAC-seq)分析发现，增殖心肌细胞基因组的Tead3、Myc N以及Gli1等转录因子的染色质可及性增加，帮助揭示了增殖心肌细胞转录组变化的深层机制。基于单细胞测序结果的细胞互作分析还揭示了调控心肌增殖的细胞间信号网络，例如心外膜、心内膜、巨噬细胞来源的分泌因子参与心肌损伤后的修复[28]。

sc RNA-seq同样运用于研究大动物心肌再生。通过对P1心尖切除的猪心肌组织进行单个细胞核测序，分析得到了6个不同的心肌细胞亚群。其中两个心肌细胞亚群(CM4和CM5)的细胞周期基因的表达和心肌细胞增殖能力显著增加，参与心肌损伤后的再生。受限于细胞体积的限制，该结果未包含细胞质RNA数据[29]。

1.3电生理特性

增殖和非增殖心肌细胞之间的电生理特性存在明显差异。新生心肌细胞通常具有更长的复极化时间和动作电位时程。从P1到成年心肌，外向K+电流和快Na+电流幅度逐渐增加，导致复极化时间缩短[30]。目前尚不清楚这些电生理特性是否参与调控心肌增殖，以及增殖心肌细胞的以上电生理特征是否直接导致心律失常的发生。

增殖心肌细胞与非增殖心肌细胞的钙电流特征也具有显著差异。与成年、未受损斑马鱼心肌相比，胚胎期及损伤边缘区的斑马鱼心肌的L型钙电流(ICa-L)密度减弱，钙内流时间延长而外流时程缩短，最终导致动作电位时程增加。富含亮氨酸重复序列蛋白10 (leucine-rich repeat containing 10,LRRC10)下调导致的L型钙通道(L-type calcium channel,LTCC)从Z盘解离是导致该现象的内在机制。LRRC10水平的降低以及ICa-L的减弱有利于心肌细胞增殖，相反，较高水平的LRRC10和ICa-L则促进心肌的成熟与分化[31]。

1.4代谢特征

心肌收缩功能的维持需要大量能量供给，其能量来源具有“底物灵活性(substrate flexibility)”：心肌细胞可根据供能需求、环境氧浓度、可用底物的变化来调整其能量代谢途径，而这些代谢途径显示出对心肌细胞增殖差异化调控作用。在胚胎期/新生个体心脏，心肌以耗氧较少、但有利于心肌细胞增殖的糖代谢为主[25,32]，敲除心肌糖代谢关键酶Pkm2可抑制新生小鼠的心肌再生能力[33]；在出生后，小鼠心肌代谢则以耗氧较多、产能较高，但同时阻碍心肌细胞增殖的脂肪酸氧化为主[25]，剥夺出生后小鼠饮食中的脂肪酸[24]，或敲除成年小鼠心肌中的脂肪酸代谢关键酶Cpt1b[34]，具有促进心肌细胞增殖的作用。尽管氨基酸不是心肌细胞的主要能量来源，但在长期禁食、剧烈或长时间运动以及某些病理状态下，心肌细胞也会利用氨基酸供能。代谢组学发现，P1与P7心肌心肌细胞相比，其谷氨酰胺、犬尿酸水平更高。在成年心肌细胞补充谷氨酰胺或犬尿酸可分别通过刺激哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,m TOR)或Yap信号促进其增殖[35,36]。此外，增殖心肌细胞的组氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢更为旺盛，而S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosyl methionine,SAM)和牛磺酸(Taurine)代谢降低[25]，但这些变化是否与心肌细胞增殖相关尚不清楚。

2心肌细胞再生的评价与研究方法

2.1研究心肌细胞再生的动物模型

2.1.1心尖切除模型

心尖切除手术是在新生个体的心尖部位切除约15%～20%的左心室心肌组织，主要用于研究心肌组织的再生能力。心尖切除手术一般在P1和P7/P8小鼠心脏进行，以检测心肌再生能力是否足以修复受损心肌[37]。结果显示，在P1小鼠中，心肌在心尖切除术后的21天内几乎完全修复，而在P7小鼠中，心肌无法再生并发展为显著的纤维化。这一发现，使得在新生小鼠、大鼠进行心尖切除手术成为了研究心肌增殖的典型模型[8,38]。

心尖切除手术同样可成功地应用于新生猪的实验模型。其具体操作为，通过胸骨正中线切开暴露新生猪的心脏，并从心尖部切除4～5 mm的心肌组织。值得注意的是，在P1接受心尖切除手术的新生猪，在P28再次接受MI手术时，与对照组相比显示出更为显著的心肌再生能力。该模型进一步证实了心尖切除手术对心肌增殖能力的刺激效果[39]。

2.1.2冷冻损伤模型

冷冻诱导的心肌损伤(cyro-injury)模型是通过将冷冻探头(例如液氮冷冻的探头)直接接触到心脏的特定区域的心肌损伤模型，具有可重复性好，操作难度相对较低等特点。通过调整探头的温度、接触时间和接触压力以产生不同程度的损伤。冷冻损伤模型也被运用于心肌再生研究，由于其损伤的规模和深度可控，可以产生透壁(从心内膜到心外膜的全层)或非透壁(只损伤到部分心肌层)的损伤。P1小鼠心脏在经历冷冻诱导的非透壁损伤后能够完全自我修复，但在受到透壁损伤后却没有显著的再生现象，这一现象的内在机制尚不清楚[40]。

2.1.3 MI模型

MI模型是对冠状动脉进行永久性结扎，造成心肌缺血损伤，以模拟临床MI病理状态的实验模型。在P1小鼠心脏诱导的MI模型同样可刺激心肌再生[37]。P1新生小鼠的心脏在MI后第21天进行检测，可观察到类似于心尖切除模型的自我修复，相反，P8小鼠心脏在MI后则表现出广泛的纤维化、心壁变薄和心室扩张。对P1新生猪进行永久性的冠状动脉结扎，发现其心脏能够完全再生并持续恢复心脏功能，而在P7进行冠状动脉结扎的猪则发展出完全的心肌瘢痕和变薄的心壁[11]，表明MI同样是新生个体心肌损伤的有效模型。

成年小鼠在MI后，梗死边缘区重新进入细胞周期的心肌细胞明显增加，表现为Ki67、磷酸化组蛋白H3 (phospho-histone H3,PH3)、Aurora B、Brd U和Ed U等增殖标志物阳性的心肌细胞数目增多[41]。成年小鼠MI模型可用于检测特定干预措施对心肌增殖能力的影响。

在猪等大型实验动物，对冠状动脉前降支第二对角支开口的远端进行结扎造成的急性MI模型是研究猪心肌再生能力的常用模型。基于该模型的研究揭示了猪在出生后同样存在心肌再生时间窗。在P2以内接受MI手术的猪心脏可通过原有心肌细胞增殖实现心肌再生[11]。

2.1.4心肌缺血/再灌注(ischemia/reperfusion,I/R)模型

I/R与永久性结扎MI模型不同，I/R模型包括两个阶段：第一阶段是暂时性的冠状动脉闭塞造成局部心肌缺血，第二阶段是随后的血流恢复，即再灌注和由之引起的再灌注损伤。由于MI患者通常会接受介入手术或溶栓治疗来恢复梗死区域的血流。因此，与MI模型相比，I/R模型更加贴近临床情况，并且能够关注再灌注损伤的特点。I/R模型同样被运用于研究心肌细胞增殖，成年小鼠在缺血60 min的心肌I/R损伤后14天进行检测，梗死边缘区Ki67阳性心肌细胞是假手术组的3.5倍，且单个与成对Ki67阳性细胞的比例为9:1，表明I/R损伤刺激心肌细胞重新进入细胞周期，但仅极少部分完成有丝分裂[42]。I/R和MI损伤对成年心肌细胞周期的激活是否存在差异尚无报道。

在猪等大动物模型，通过冠状动脉球囊封堵的方法建立的I/R损伤模型同样被用于检测刺激心肌细胞增殖的治疗效果，例如在猪的I/R模型中，前降支内给与重组Agrin可刺激成年心肌细胞重回细胞周期，并将梗死面积缩小约50%[43]。

2.1.5压力负荷模型

主动脉缩窄(transverse aortic constriction,TAC)构建的压力过载模型显示，P1时对小鼠进行TAC可刺激心肌细胞增殖。相反，P7时进行TAC导致纤维化和心脏功能障碍。此外，压力负荷的程度也与心肌细胞增殖相关，使用30号针诱导的轻度压力负荷刺激了心肌细胞增殖和心肌肥大，但两者对心脏增大的贡献比例没有明确的报道。使用32号和34号针诱导的中-中重度压力负荷在术后出现病理性心肌肥大甚至死亡[44]。在成年小鼠，TAC同样在术后2～7天诱导了心肌细胞PH3阳性率的增加，但这一变化趋势在术后28天消失[45]。

2.2心肌细胞再生的检测方法和研究体系

为了评估和研究心肌细胞的再生能力，研究者们开发了一系列技术方法和研究体系。这些方法包括分离心肌细胞计数、活细胞工作站的应用、细胞周期标志物的免疫染色、MIMS技术、谱系示踪技术、以及各种测序与组学技术的应用。每种技术既有其独特的优势，同时也存在相应的局限性。这些研究工具和方法为我们研究心肌细胞再生提供了重要基础(表1)。

2.2.1分离心肌细胞计数

将胶原酶/胰酶通过Langendorff系统进行主动脉逆行灌注，以消化分离心肌细胞，制备细胞悬液并计数，估算其绝对心肌细胞数量的方法，也被用于评估心肌细胞增殖。但该方法依赖于操作人员的熟练度和可重复性，以最大限度保证分离心肌细胞的活性/数目具有可比性。此外，在小鼠MI模型中，存在因部分心肌灌注不完全、前降支血管结扎位置、梗死面积个体差异导致心肌细胞绝对计数不同的可能。

2.2.2活细胞工作站

通过将荧光蛋白(例如td Tomato)标记的成年心肌细胞与一定比例的新生乳鼠心室肌细胞(neonatal rat ventricular myocytes,NRVMs)进行共培养，并联合延时摄像(time lapse video)技术，可实现对体外培养成年心肌细胞命运，特别是胞质分裂的全程示踪。该系统发现成年心肌细胞在体外的增殖比例可达7%。利用活细胞核染料Draq5对成年心肌细胞核数目进行标记，并测算心肌细胞初始大小，该系统还发现不同细胞核数目(单核/多核)以及不同大小心肌细胞的增殖能力并无明显差异。通过对完成胞质分裂的子代心肌细胞进行c Tn I等心肌标志物染色，该系统发现并非所有子代心肌细胞都能重新表达c Tn I，在c Tn I阳性的子代细胞中，仅有部分可获得肌小节的重新排列，表明增殖后的子代心肌细胞并不能完全获得重新分化。该技术还被用于检验心肌增殖标志物的可靠性[16]。

2.2.3细胞周期标志物的免疫染色

2.2.3.1 Ki67、PH3、Aurora B

Ki67抗原最初是在二十世纪八十年代初由Gerdes和他的同事们发现，他们使用一种来自霍奇金淋巴瘤细胞系的核抗原的小鼠单克隆抗体进行了研究。这种蛋白质的命名是根据研究者的所在地来的，Ki代表着德国基尔大学(Kiel University)，而67则表示96孔板上的克隆编号[46]。Ki67在非G0期(非休眠期)，即细胞周期G1、S、G2和M期中广泛表达，因此Ki67蛋白可被用来标记细胞是否正在活跃地进行DNA复制和是否进入细胞周期。

PH3是在第10位丝氨酸(Ser10)位置上发生磷酸化的组蛋白H3。PH3是一种M期特异的标志物，尤其是在有丝分裂过程中的前期和中期。因此，检测PH3可作为评估细胞处于有丝分裂过程中的有效方法。

Aurora B也称为“Aurora kinase B”，属于极光激酶(Aurora kinases)家族的一员。Aurora kinases最早是在果蝇中被发现，其突变导致细胞在有丝分裂过程中，中心小体不能正常分离，出现单极纺锤体而得名。Aurora B在细胞有丝分裂的各个阶段，特别是在染色体的分离和纺锤体的形成中发挥重要的调控作用，因此其功能对细胞分裂的顺利进行至关重要。Aurora B的表达和活性在M期达到高峰，并具有特征性的定位。在有丝分裂后期至终末期，Aurora B从着丝粒移向中心体，参与胞质分裂。因此，Aurora B被用于检测心肌细胞有丝分裂/胞质分裂[18]。

2.2.3.2 Brd U/Ed U染色

5-溴-2'-脱氧尿苷(5-bromo-2'-deoxyuridine,Brd U)和5-乙炔基-2'-脱氧尿嘧啶(5-bromo-2'-deoxyuridine,Ed U)是两种合成的核苷类似物。它们可以被细胞摄取并嵌入到新合成的DNA中，因此被广泛用于标记正在合成DNA的细胞，从而检测心肌细胞增殖。然后，由于心肌细胞DNA复制并不代表细胞增殖，并且DNA修复也会导致Brd U/Ed U阳性，因此单独使用该指标评估心肌细胞增殖可能并不准确，一般需联合其它指标或谱系示踪技术。Brd U/Ed U检测不仅可以在组织切片中进行，还可以通过胰酶/胶原酶对全心进行消化制备心肌细胞悬液进行。Brd U/Ed U阳性的单核心肌细胞被认为更可能是增殖的心肌细胞[18]。

2.2.3.3细胞周期标记与心肌特异性标记的联合应用

在心脏组织切片中，确定细胞周期标记阳性的细胞核是属于心肌细胞还是相邻的间质细胞具有一定难度。通过共染色技术，可显著提高标记心肌细胞的准确性。例如，使用小麦胚芽凝集素(wheat germ agglutinin,WGA)染色来环绕细胞膜，以及使用心肌细胞核的特异性标记，如PCM1、Nkx2.5、MEF2和GATA4，都可明显提高标记细胞周期活跃的心肌细胞的准确性[47]。

2.2.4 MIMS技术

MIMS是结合了离子显微镜和质谱的高分辨率成像技术。在给与小鼠15N同位素标记的胸腺嘧啶(15N-thymidine)标记DNA复制后，MIMS可以小于一微米立方的精度，定量分析15N:14N比值并生成高空间分辨率图像。

与Brd U/Ed U相比，MIMS具有以下明显优势：15N是非放射性稳定同位素示踪剂，不会对细胞内生化反应造成影响，且对有机体无害；MIMS图像的超高分辨率可区分DNA合成与DNA修复，因为MIMS图像显示DNA修复所掺入的15N-thymidine指数级少于DNA合成。MIMS本身的分辨率足以区分心肌细胞与非心肌细胞，结合谱系示踪可进一步研究心肌细胞增殖的来源。联合Y染色体DNA原位杂交，可帮助区分发生DNA复制的细胞核是否发生多倍体化(同时满足单核、2倍体检测)，高15N:14N比值信号的心肌细胞被认为是完成增殖的心肌细胞[9]。

MIMS帮助揭示了成年心肌细胞增殖的来源为原有心肌细胞，成年心脏每年的更新比率约为4.4%,MI后8周，梗死边缘区23%的心肌细胞发生DNA复制，但仅3.2%的心肌细胞最终完成增殖[9]。小鼠MI后进行8周跑步运动可诱导心肌细胞增殖，修复梗死心肌[48]。

2.2.5谱系示踪技术

通过谱系示踪技术，利用心脏特异性的Cre/Dre重组酶对心肌细胞进行标记，是研究在体心肌细胞增殖的强大工具。目前已经成功开发了多种小鼠模型，用于跟踪心脏发育过程中或损伤后的心肌增殖(图1)。值得注意的是，谱系示踪常用的Cre-lox P系统需设立严格的对照，有研究报道Myh6-Mer Cre Mer或Myh6-Cre在诱导后即使在没有lox P位点存在的情况下，亦可导致心肌细胞DNA损伤以及心功能下降。因此，在研究中设置合适的对照具有必要性[49]。

2.2.5.1 FUCCI报告基因鼠

荧光泛素化细胞周期示踪系统(fluorescent ubiquitination-based cell cycle indicator,FUCCI)使用两个荧光探针，即橙色荧光蛋白Kusabira-Orange (m KO)和绿色荧光蛋白Azami-Green (Az G)。在FUCCI系统中，m KO与细胞周期G1期指示蛋白h Cdt1融合，而Az G与S/G2/M期指示蛋白Geminin融合。在细胞周期进程中，由泛素化介导的m KO-Cdt1和Az G-Geminin之间的交替使得从G1期到M期的细胞周期阶段可直接可视化[43]。FUCCI报告鼠可以与αMHC-Cre鼠繁育，从而生成心肌特异性的FUCCI系统，以反映心肌细胞的细胞周期进程[50](图1A)。

2.2.5.2 e GFP-Anillin小鼠

Anillin是胞质分裂期间收缩环(contractile ring)的固有组成蛋白，其亚细胞定位随细胞周期发生变化。在M期，Anillin在中心体的对称分布，以及与分裂中的姊妹细胞具有较长间距，与最终发生胞质分裂高度相关。相反，Anillin在中心体的不对称分布，以及与姊妹细胞之间距离较短，则提示细胞多核化的命运。因此，Anillin的亚细胞分布特征被认为有助于评价心肌细胞的胞质分裂。

在e GFP-Anillin小鼠中，e GFP-Anillin融合蛋白在Myh6启动子的控制下表达，从而实现对M期心肌细胞的可视化。通过Anillin在中心体是否呈对称分布，以及距离姊妹待分离细胞的远近两个标准，有助于区分心肌细胞的胞质分裂和多核化[51](图1B)。

2.2.5.3 Aurkb-td Tomato小鼠

Aurkb-td Tomato小鼠通过Aurkb的表达同步、实时标记增殖心肌细胞。由于Aurkb表达在M期间达到顶峰，该工具能够标记M期活跃的心肌细胞，与Ki67相比更接近于细胞分裂。该系统利用Tnnt2驱动表达的Dre，将Aurkb (promoter)-rox-Stop-roxtd Tomato的Stop序列剪切，形成Aurkb (promoter)-rox-td Tomato，使任何表达Aurkb的细胞均同步表达td Tomato。体外共培养系统结合实时延时成像显示，94.44%的td Tomato+P1心肌细胞经历了完整的胞质分裂。该系统揭示在P1小鼠心脏中，td Tomato+心肌细胞占左心室总心肌细胞数的3.92%，在P7的心脏中减少到1.57%，在成年心脏中降至0.1%～0.2%。此外，P1新生小鼠的心尖切除损伤增加了td Tomato+心肌细胞的数量，但成年小鼠MI却并未增加心脏td Tomato+心肌细胞数[52](图1C)。

图1.研究心肌细胞增殖的谱系追踪小鼠模型。  

2.2.5.4 Pro Tracer小鼠

Pro Tracer系统使用Ki67标记增殖的心肌细胞，其优势在于可长期持续记录心肌细胞增殖[46]。传统的Ki67-Cre ER系统标记心肌细胞增殖，依赖于持续给与他莫昔芬(Tamoxifen)对Cre ER的激活。由于Tamoxifen通常不用于长期给药，因此传统工具很难在长时间内(如数月)持续记录Ki67基因活性。考虑到较短时间窗内成年心肌细胞增殖极其稀少，ProTracer对记录较长时间段内的心肌增殖具有积极意义。

Pro Tracer使用Cre-lox P/Dre-rox双重组系统。Tnnt2-Dre ER在Tamoxifen诱导后，可将Ki67 (promoter)-Cre-rox-ER-rox的ER通过Dre-rox重组切除，从而得到Ki67(promoter)-Cre-rox，一旦细胞在任何时间表达Ki67，可同步诱导Cre重组酶的表达，将GFP序列前的lox P-Stop-lox P序列剪切掉，使细胞标记上GFP。

Pro Tracer系统发现，小鼠出生后心肌细胞增殖虽持续下降，但仍持续至青春期前[53]；验证了成年小鼠每年的心肌增殖比率约为4.4%；此外，它还显示成年小鼠MI后，梗死区和梗死边缘区的心肌细胞进入细胞周期，而这些心肌细胞显示出空间特异性，高度局限于左心室心内膜下心肌。通过连续心脏切片，Pro Tracer系统还揭示了约13%被Ki67标记的成年心肌细胞最终完成分裂[41](图1D)。

2.2.5.5 Rainbow小鼠

Rainbow小鼠使用3对串联的lox P位点围绕不同的荧光蛋白编码框(GFP、m Cherry、m Cerulean和m Orange)。未经诱导的细胞表达GFP绿色荧光，心肌特异性Cre对荧光蛋白编码框进行剪切重组，从而随机产生三种不同颜色荧光的心肌细胞，由于单个心肌细胞增殖后的子代细胞均表达同一种荧光蛋白，通过单色荧光细胞集落的大小，可判断心肌是否增殖。然而，由于标记的随机性，相邻的心肌存在极小概率被标记为相同颜色，而不是来源于心肌细胞增殖。基于该工具鼠的研究结果显示，MI可刺激新生小鼠心肌细胞增殖，在成年小鼠心脏中则无此效果[54](图1E)。Confetti小鼠是Rainbow小鼠的衍生版本，其不同之处在于只有在Cre-lox P同源重组发生后细胞才被标记荧光，并且n GFP和m CFP荧光蛋白的设计使其得以标记细胞核或细胞膜，该小鼠被用于研究mi R-302/水凝胶原位注射对MI后心肌细胞再生的影响[55]。

2.2.5.6 αDKRC/RLTG小鼠

αMHC-Mer Dre Mer-Ki67p-Roxed Cre (αDKRC)::Rox-Lox-td Tomato-e GFP (RLTG)小鼠在Tamoxifen诱导后可将全部心肌细胞标记为td Tomato，而此后发生增殖的心肌细胞由td Tomato变为e GFP。

该系统利用Dre-rox与Cre-lox P双重诱导。诱导后的Dre将所有心肌细胞标记为td Tomato，并同时剪切掉Ki67 promoter-Cre (N-terminus)-rox-Stop-roxCre (C-terminus)中的Stop序列，使得全长Cre可在Ki67启动子驱动下得以表达。Cre剪切掉位于e GFP前的lox P-td Tomato-Stop-lox P序列后，使细胞由表达td Tomato变为表达e GFP[42]。

根据e GFP阳性的心肌细胞单个分布还是形成集落，可协助判断进入细胞周期的心肌细胞是否发生增殖。成年αDKRC/RTLG小鼠在心肌I/R损伤后，e GFP阳性心肌细胞是假手术组的3.5倍，但单个e GFP与成对e GFP心肌细胞的比例为9:1，表明心肌损伤后Ki67阳性的心肌细胞仅有少部分完成增殖[42](图1F)。

2.2.5.7双标记嵌合分析(mosaic analysis with double markers,MADM)小鼠

MADM小鼠模型可明确地识别增殖后心肌细胞。MADM小鼠由MADM-GT与MADM-TG小鼠杂交而得，GT与TG代表红色/绿色荧光蛋白非全长片段的排列顺序。在该模型中，编码非全长荧光蛋白(如RFP和GFP)片段的DNA被整合到基因组，细胞在S期进行DNA复制后，由于染色体间的Cre-lox P同源重组，可导致分裂后的两个子细胞分别具有不同颜色的全长荧光蛋白标记(GFP或RFP)。因此，每当一个细胞分裂，它的两个子细胞将被明确地、永久地标记。

该模型的明显优势是单色的细胞无可争议地表明是已经分裂的心肌细胞。该模型同样存在局限性，由于染色体间重组的随机性，不是所有分裂的子细胞都会被标记为单一颜色，因此可能低估了真实的增殖率。在小鼠出生后第一周，11%的标记细胞表达单色荧光蛋白，而到3个月时这个数字减少到2.5%。在该模型中，MI后第4周并没有观察到明显的成年心肌细胞增殖。转录组测序结果提示，增殖后子代心肌细胞的表达谱特征更接近成年心肌细胞，而不是新生心肌细胞，表明这些子代细胞发生了再分化[13](图1G)。

2.2.5.8 Cyclin A2-Lac Z-floxed-EGFP小鼠

Cyclin A2是表达于G1中期-M期中期的细胞周期蛋白。该工具小鼠将Lac Z-floxed-EGFP序列构建到Cyclin A2基因座，与Cyclin A2形成融合蛋白，使细胞表达Cyclin A2-β-gal。在与Troponin T-Cre小鼠杂交后，可由心肌细胞特异性表达的Cre将Lac Z-floxed剪切，从而表达Cyclin A2-EGFP，标记进入细胞周期的心肌细胞。与FUCCI小鼠相比，该系统使用单色荧光，更有利于多重染色。利用该系统，研究者揭示了在P0～P1小鼠，右心室Cyclin A2-EGFP阳性的心肌细胞比例少于左心室；此外，小鼠在P15并没有再次出现心肌细胞增殖的高峰[56]，这与Husain团队关于小鼠在青春前期(P15)出现心肌细胞增殖高峰的报道相反[57]。

2.2.6空间转录组学

尽管单细胞测序可在细胞水平提供不同细胞亚群的详细信息，但这些细胞在空间解剖上如何分布却并不清楚。利用空间转录组学技术，Olson团队报道了NYFa对心肌细胞增殖的调控作用具有空间异质性。在胚胎期小鼠心脏，根据表达谱特征，较为成熟的心室肌细胞可分为3个细胞群(M-VCM1,M-VCM2和M-VCM3)，这些细胞均匀分布于致密心肌或室间隔；而表达谱呈幼稚状态的心室肌细胞亦分为3群，其中F-VCM1广泛分布于心室，F-VCM2分布于心室近小梁区，而F-VCM3则分布于致密心肌或室间隔。此外，空间转录组学技术还鉴定出分布于肌小梁区的细胞亚群T-VCM1和T-VCM2，以及分布于心外膜、表达ECM的心肌细胞亚群CME+，其中F-VCM1-3、CME+的表达谱与单细胞测序中具有再生能力的CM4亚群具有高度重合。在敲除心肌细胞增殖调控因子NFYa的胚胎期小鼠心脏，F-VCM1的比例下降，而小梁区细胞群T-VCM1和T-VCM2的比例升高，提示增殖信号可能通过影响位于不同空间位置的细胞亚群调控心肌增殖[58]。通过这些空间细节，空间转录组学为心肌细胞增殖研究提供了更为全面的视野。

2.2.7其它技术

IQGAP3 (IQ motif containing GTPase activating protein 3)和Rho A (ras homolog family member A)激酶是调控细胞骨架的关键蛋白。在胞质分裂阶段，这两种蛋白对称性定位到中心体间隙上的肌动蛋白环(actomyosin ring，收缩环的核心成分)，促进分裂沟(cleavage furrow)的形成和由此引起的细胞分裂。细胞延时摄像实验证实，IQGAP3和Rho A没有正确地定位到肌动蛋白环的心肌细胞不能完成胞质分裂，而代之以多核化相关。因此，IQGAP3和Rho A的细胞定位被认为可用于区分细胞分裂与多核化。由于该方法需要观察大量共聚焦显微镜图片，以及其形态判断依赖于观察者的经验，并不适合运用于高通量检测心肌细胞增殖[18]。

2.2.8不同工具对心肌再生能力的评估存在差异

由于心肌细胞再生是涉及多个层面的复杂过程，不同的检测工具采用的评价指标不同，可能导致对心肌再生能力的评估存在一定差异。例如关于MI在成年小鼠是否诱导心肌增殖，基于Ki67、DNA复制的检测系统可观察到MI后进入细胞周期的心肌细胞数目增加；在MADM小鼠[13]、Aurkbtd Tomato小鼠[52]以及Rainbow小鼠[54]等以胞质分裂/心肌细胞数目增加为检测指标的检测体系中，与Sham相比MI并没有诱导明显的心肌增殖[9](表2)。造成这些结果出现不一致的原因，可能是由于各个检测系统的局限性导致的对心肌增殖的高估或低估。例如Ki67、DNA复制提示心肌细胞进入细胞周期，但这些心肌细胞不一定完成胞质分裂，可能会导致对增殖比率的高估。另一方面，MADM小鼠可能存在发生同源重组和胞质分裂但亦不能成功表达单色荧光的情况；Rainbow小鼠的单色细胞集落可能来源于标记的随机性而不是来源于细胞增殖，增殖后心肌细胞可能发生迁移，导致集落数目发生变化；Aurkb-td Tomato为实时、非永久性标记，可能会遗漏掉已完成胞质分裂的心肌细胞，这些特性可能导致对实际心肌增殖比率的低估。因此，开发能够更加准确地评估心肌增殖的工具有助于进一步明确该问题。

表2.不同工具对心肌再生能力的评估存在差异 

该表描述了不同检测工具由于其工作原理的不同，对MI是否促进心肌细胞再生得出的结论存在差异。I/R：缺血再灌注；MI：心肌梗死；Sham：假手术组；td Tomato：红色荧光蛋白衍生体；MIMS：多同位素成像质谱。

2.3心肌细胞增殖靶点的干预策略

细胞转染/感染：在NRVMs等原代心肌细胞，脂质体lipofectamine、RNAimax等工具介导的si RNA转染，或体外获得的m RNA转染可实现对特定基因的敲低或过表达，但通过脂质体在NRVMs转染过表达质粒的效率极低。相反，腺病毒(adenovirus,Ad)对NRVMs具有极高的感染和表达效率。

腺相关病毒与Ad:9型腺相关病毒(adenoassociated virus type 9,AAV9)仍然是在小鼠和猪等模型在体操纵基因表达的优势工具，具有细胞毒性和免疫原性低、表达时间长等优势。AAV9的给药方式包括尾静脉注射(小鼠)、冠脉内注射(猪)与心肌内原位注射(猪、小鼠)，在大多数以猪为模型的实验中，心肌内原位注射较为常用。Ad也可用于在体实验。Ad具有携载量大，可同时表达多个基因，表达快速(感染后24～48 h达到峰值)的优势，适用于过表达多个基因的组合(如细胞周期基因“4F”组合[59]或“OSKM”转录因子组合[60])。与AAV9相比，Ad有免疫原性大、表达持续时间短的局限性。

Cre-lox P及Dre-rox系统：在心肌再生研究中，Cre-lox P和Dre-rox系统是两种强大的基因操作工具，它们允许研究人员在特定的细胞类型或组织中精确控制基因表达。这些系统通过利用细菌来源的重组酶(Cre和Dre)和它们各自识别的DNA位点(lox P和rox位点)，在这些位点间进行精确的DNA切割和重连来实现特定基因的敲除或激活。利用心肌特异性表达基因的启动子来驱动Cre或Dre的表达，可实现在某特定细胞或组织类型对基因进行调控。Myh6[13]和Tnnt2[41]是最为常用的心肌细胞特异性启动子。将Cre酶与突变的雌激素受体(mutated estrogen receptor,Mer)构建融合蛋白(Mer Cre Mer)，利用Mer不与内源性雌激素结合，仅能与雌激素类似物Tamoxifen结合，并在结合Tamoxifen后从胞质进入到胞核的特性，使Mer Cre Mer仅在暴露于Tamoxifen的特定时间内能够结合到基因组DNA，实现对基因的时间特异性调控[61]。Cre-lox P及Drerox两种系统的配合使用，允许研究人员对多重限定条件的细胞进行标记。例如，在Pro Tracer小鼠中，Tnnt2-Dre确保了对心肌细胞进行特异性标记，而Ki67-Cre进一步实现了对Ki67阳性的心肌细胞进行标记[41]。

CRIPSR/Cas9:CRISPR/Cas9 (clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated protein 9)是一种先进的基因编辑工具，在引导RNA (guide RNA,g RNA)的定位下，具有RNA切割功能Cas9可对基因组中的特定序列实现精确的基因敲除、替换或插入。与Cre-lox P/Dre-rox系统相比，CRISPR/Cas9具有编辑效率高的特点，除了用于基因敲除以外，还可以通过不同的Cas变体进行基因激活、抑制、编辑。CRISPR/Cas9系统同样被运用于心肌细胞增殖的研究。利用CRISPR/Cas9技术，研究者在小鼠在体心肌细胞中敲除了非编码RNA Snhg1[62]或LDHA[63]，以探究其对心肌细胞增殖的影响。CRISPR/Cas9系统的另一优势是在培养细胞中实现对基因的敲除或多个基因的过表达，例如在人的i PSCs细胞中敲除NOTCH1，以研究其对心肌细胞增殖和分化的影响[64]。在人的成纤维细胞中，过表达失活的Cas9 (d Cas9)与转录激活因子VP64的融合蛋白(d Cas9-VP64)，在不同的g RNA引导下，可同时实现对Gata4、Hand2、Mef2C和Tbx5的过表达，从而将成纤维细胞转分化为诱导多能心脏前体细胞[65]。

CRISPR-Cas Rx：与CRIPSR/Cas9编辑DNA不同，CRISPR-Cas Rx系统用于RNA层面的干预。它不需要PAM序列，通过其内含的RNase活性对靶RNA进行切割和降解。通过Myh6-Cre驱动的Cas Rx在小鼠心肌特异性敲低Meis1和Hoxb13，可促进MI后的心肌细胞增殖与心肌修复。与RNA干扰技术相比，CRISPR-Cas Rx具有更高的特异性，发生脱靶效应的概率更低[66]。

mod RNA:mod RNA指在体外转录、获得m RNA，并对m RNA进行一系列化学修饰，以提高其稳定性和翻译效率、降低免疫原性，再将其应用到离体细胞或全身各组织的技术。mod RNA具有免疫原性低，瞬时、局部、高效过表达的特性。mod RNA主要的化学修饰包括：用尿苷衍生物N1-甲基伪鸟苷(N1-Methylpseudouridine)替代尿苷；在m RNA的5'加入3'-O-Me-m7G(5')ppp(5')G (anti reverse cap analog,ARCA)帽子结构，其中3'-O-Me代表核糖3'位上的氧原子(O)被甲基(Me)所取代。ARCA结构能够减少m RNA引起的免疫反应，帮助m RNA被翻译起始复合物所识别，提高m RNA的翻译效率，并抵抗核酸酶从而增加m RNA的稳定性[67]。

通过对mod RNA进行进一步改造，可实现心肌细胞特异性过表达特定基因。在Pkm2调控心肌细胞增殖的研究中，研究者设计了两条mod RNA(mod RNA1和mod RNA2),mod RNA1的基本结构为5'UTR-L7Ae-cardiac specific mi Rs recognition element-3'UTR。mod RNA2基本结构为5'UTR-Kinkturn motif (K-motif)-Pkm2-3'UTR。mod RNA1中编码的古细菌核糖体蛋白L7Ae，可与mod RNA2中的K-motif结合，阻碍mod RNA2的翻译。当存在心肌特异性mi RNAs时，这些mi RNAs通过结合到mod RNA1的识别元件，将mod RNA1降解，从而解除mod RNA1对mod RNA2的翻译抑制，实现心肌细胞特异性过表达Pkm2。将改造的mod RNA在MI造模时注射到小鼠心肌，可在注射后2天检测到Pkm2蛋白水平和活性的增加，并持续到注射后8～12天[33]。通过mod RNA在小鼠和猪心肌过表达Pkm2[33]或CCND2[68]，均可促进MI后心肌细胞增殖与心肌修复。

Tet-on系统：在工具载体中加入Tet-on系统，利用四环素(tetracycline,Tet)或多西环素(doxycycline,Dox)的存在与否，可决定反向四环素转录激活因子(reverse tetracycline transactivator,rt TA)是否与四环素反应元件(tetracycline responsive element,TRE)结合并启动下游基因转录的特性，对基因表达的时间窗进行可控调节。例如心肌注射AAV9-TRE-mi R-294-αMHC-rt TA可依赖于Dox的给药时间，在选定时间窗内同步表达mi R-294，从而避免永久表达带来的不良反应[69]。

四、心肌再生能力的影响因素

1内外环境因素

环境氧浓度：啮齿类动物的谱系示踪实验证实，较低的环境氧浓度(7%)可延长新生个体心肌再生的时间窗，并促进成年个体MI后的心肌再生与修复[12]。哺乳动物从母体内到出生后，环境氧气浓度骤然升高，心肌细胞更多利用氧气供能，这一过程导致ROS产生增加。心肌细胞内ROS水平升高导致的DNA损伤是阻碍DNA复制和细胞周期推动的重要因素[5]，清除ROS[5,70]或促进DNA损伤后修复[71]，可延长出生后心肌增殖时间窗和刺激成年心肌再生。

运动应激：运动可促进心肌细胞再生，改善MI后心功能。对小鼠进行跑步、游泳等运动训练，可显著提高Ki67阳性的心肌细胞数目[72,73,74]。MIMS发现，小鼠MI后进行跑步运动8周可将心肌细胞增殖能力提高约8倍[48]。心脏环状RNA (circular RNA,circ RNA) circ Utrn，长链非编码RNA (long non-coding RNA,lnc RNA) CPhar、微小RNA (micro RNA,mi RNA) mi R-222的上调，以及PI3K、EGFR等信号通路的激活与运动促心肌细胞再生作用有关，但运动引起上述改变的作用机制尚不清楚[74,75]。

心室机械张力：心室内机械张力升高被认为是心肌细胞增殖的抑制因素。对于心力衰竭患者，长期使用左心室辅助装置(left ventricular assist device,LVAD)可减轻心室压力，诱导成年心肌细胞重新进入细胞周期。与植入LVAD之前的心脏相比，植入LVAD后的心脏中心肌细胞大小减小了45%，线粒体含量减少了60%，而Ki67、PH3、Aurora B阳性的心肌细胞数显著增加，该作用的机制尚不清楚，推测可能与降低氧耗和DNA损伤有关[76]。

甲状腺素等内分泌激素：心肌细胞增殖能力受到内分泌的调控。小鼠出生后不久，血液中的甲状腺激素水平急剧上升超过50倍，这与小鼠代谢、产热水平的增加、心肌细胞退出细胞周期、形成双核以及失去再生能力的变化趋势相一致。使用丙基硫氧嘧啶(propylthiouracil,PTU)阻断甲状腺激素合成，或抑制甲状腺激素受体α (thyroid hormone receptor α,TRα)功能，均可引起心肌细胞数量增加约3倍[6]。这些数据表明，围产期的甲状腺激素信号在心肌细胞退出细胞周期和多倍体化中发挥重要作用。除甲状腺素外，儿茶酚胺也是调控心脏功能的重要激素，抑制β肾上腺素受体可激活Yap-1/Ect2信号，促进心肌细胞增殖[77]。

在围产期，孕激素水平的急剧减少也与心肌退出细胞周期有关。在胎儿发育期间，孕酮由胎盘和/或卵巢黄体产生供应。新生小鼠离开母体后，血清孕酮水平急剧下降。补充孕酮可通过上调Yap的表达促进小鼠心肌细胞增殖与损伤后修复[78]。

2微环境因素

炎症与免疫：在MI诱导心肌损伤的情况下，炎症反应相关基因的表达水平在P1小鼠心肌显著上调，而在P8小鼠却未观察到这种变化[79]，基于单细胞测序的细胞互作分析揭示了巨噬细胞来源的分泌因子参与心肌损伤后再生[28]，这些结果提示炎症反应是调控心肌细胞增殖能力的关键因素。以下实验证据为这一结论提供了支撑：炎症诱导剂Zymosan具有促进成年小鼠MI后心肌增殖的作用[80]；相反，新生免疫缺陷小鼠(NOD/SCID)在进行心尖切除后其心肌不能再生[81]。此外，给与新生小鼠/猪地塞米松抑制炎症，也明显阻碍了心肌再生[80,82]。

不同的免疫细胞显示出对心肌再生差异化的调控作用。与P14小鼠相比，P1小鼠心脏在MI后具有更多的巨噬细胞浸润，通过Cl2MDP-L清除P1小鼠巨噬细胞，可抑制心尖切除后心肌再生[83]。反之，移植新生小鼠的巨噬细胞可促进成年小鼠MI后的心肌细胞增殖[84]。巨噬细胞对心肌再生的促进作用依赖于IL-6[83]、oncostatin M[85]等因子的分泌，敲除上述因子可抑制小鼠心尖切除后的心肌再生。

从T细胞数量上来看，MI后P7小鼠心脏较P1小鼠具有更多的T细胞浸润。从T细胞种类上进行区分，P1小鼠心脏以γδ+T细胞浸润为主，而P7小鼠心脏以αβ+T细胞浸润为主，将成年小鼠的αβ+T细胞移植到P1小鼠，可抑制MI后心肌再生，该作用与αβ+T细胞分泌的γ干扰素(interferon-γ,IFN-γ)有关[86]。值得注意的是，具有抑炎作用的调节性T细胞(regulatory T cell,Treg)发挥促心肌增殖的作用。小鼠出生后，Treg在T细胞中所占比例逐渐下降，敲除Treg抑制小鼠心尖切除后心肌再生，Treg的作用依赖于Ccl24、Gas6、Areg等旁分泌因子。这些结果表明炎症/免疫细胞对心肌增殖的调控可能依赖于特定的细胞种类和分泌谱[81]。

淋巴管：胚胎期的淋巴管发育对新生小鼠的心肌再生具有调控作用。在胚胎期第14.5天，心脏淋巴管开始发育，阻碍淋巴管的发育导致心肌增殖减弱，淋巴管内皮细胞分泌的Reln是淋巴管调控小鼠心肌再生的关键介质。然而，在成年MI鼠给与Reln则未观察到明显的促心肌细胞再生作用[87]。

ECM:ECM对心肌细胞增殖的调控作用取决于其来源，来自具有再生潜力心脏的ECM能够促进心肌细胞增殖。使用斑马鱼心脏的ECM处理成年MI小鼠，可通过激活Erb B2促进心肌增殖与修复[88]。同样，P1小鼠的ECM可促进体外心肌细胞的增殖，而P7小鼠的ECM则不具有该能力。ECM中的基底膜糖蛋白Agrin是P1心肌ECM促心肌增殖能力的关键介质，胚胎期敲除Agrin以及给与成年MI小鼠重组Agrin分别抑制和促进心肌增殖与再生。Agrin的这一作用与激活Yap和ERK信号通路有关[89]。

Periostin是发育过程中心脏ECM的重要成分，成年心脏在损伤后可重新表达Periostin。给与成年MI小鼠Periostin可激活位于心肌细胞膜上的整合素-PI3K信号，诱导心肌细胞重返细胞周期，促进心肌再生[90]。在猪MI模型通过心外膜缓释系统持续给与Periostin，可在12个月后将射血分数从31%提高到41%，并将梗死面积缩小约22%[91]。

蛋白聚糖Versican是新生小鼠心脏ECM的另一组分，由心脏成纤维细胞产生。心肌损伤可诱导新生小鼠心脏Versican的上调，并通过整合素β1和ERK1/2、Akt等下游信号分子促进心肌细胞再生。敲除成纤维细胞中的Versican降低新生小鼠的心肌再生能力。在成年小鼠中，向梗死心肌注射Versican可促进心肌细胞增殖，减少纤维化并改善心功能[92]。

ECM对心肌增殖的调控还与其僵硬度(stiffness)有关。P1小鼠与P2小鼠相比，其心肌ECM僵硬度较低，通过化学诱导剂增加P1小鼠心肌ECM的僵硬度，抑制心尖切除后心肌再生[93]。有研究将NRVMs培养在不同僵硬度的ECM上，发现低僵硬度的ECM诱导心肌细胞去分化与增殖，而高僵硬度的ECM则诱导心肌细胞成熟、肌小节组装与心肌细胞收缩[94]。这些结果表明ECM的僵硬度是心肌细胞增殖与成熟的调控因素之一。

心脏神经：在小鼠胚胎期第13.5天(E13.5)，心脏的交感和迷走神经开始分布。通过化学方法、基因工程技术或器械手段损毁心脏的迷走(胆碱能)神经分布，可显著抑制新生个体的心肌再生，该抑制效应可被外源性给与Neuregulin 1 (Nrg1)或神经生长因子(nerve growth factor,Ngf)所挽救，提示心脏胆碱能神经的促心肌增殖作用可能与神经分泌因子有关[95]。

另一方面，通过基因工程技术抑制交感神经的分布，则延长小鼠出生后心肌增殖时间窗，进一步提高P7小鼠增殖心肌细胞的比率。交感神经通过影响心肌细胞节律周期蛋白Per1/Per2及下游Wee激酶，从而抑制细胞周期基因和心肌细胞有丝分裂。使用去甲肾上腺素模拟交感活性，可上调Per1/Per2-Wee信号并抑制心肌增殖[96]。

血管新生和侧支循环：损伤后的血管新生/冠脉侧支循环是心脏组织修复过程中的关键因素。斑马鱼心肌损伤后，冠脉向损伤区域发出新生血管是这一过程的早期事件和先决条件：在Vegfa和Vegfc功能缺失的斑马鱼模型，心肌损伤后血管新生和侧支循环受限，心肌细胞不能再生[97,98]。在新生小鼠心脏，受损区域毛细血管的内皮细胞通过Cxcl12-Cxcr4的作用，趋化动脉内皮细胞沿毛细血管迁移并形成侧支动脉循环。Cxcl12或Cxcr4缺陷导致侧支循环受阻，心肌细胞难以再生。在成年心脏，Cxcl12在毛细血管内皮细胞的表达大幅降低，是心肌损伤后侧支循环和心肌再生能力受阻的原因，给与外源性Cxcl12可逆转这一现象[99]。新生血管可能为心肌再生提供了有利的微环境：血管周细胞可通过分泌Angiopoietin-2等因子，调控内皮细胞功能进而调节巨噬细胞浸润[100]，而后者具有促进心肌细胞增殖的作用。进一步阐明血管新生与心肌细胞增殖的关系，以刺激血管新生对提高心肌细胞再生效率的作用，尚需更多研究。

成纤维细胞：成纤维细胞是心脏微环境中调控心肌细胞增殖与成熟的重要因素。成纤维细胞的成熟是成年小鼠心肌细胞增殖能力减退的因素之一。将成年小鼠心脏的成纤维细胞与新生小鼠心肌细胞共培养，可抑制心肌细胞增殖、促进心肌细胞成熟。这一过程受到Cxcl12/Cxcr4以及信号的调控，对其进行干预促进损伤后小鼠心肌再生[101]。另一方面，心肌细胞也可与成纤维细胞对话，调控损伤后心脏纤维化与瘢痕重塑：心肌细胞内的Yap信号可诱导Wnt配体分泌并作用于成纤维细胞，通过非经典Wnt通路抑制成纤维细胞激活，从而抑制胶原沉积与纤维化[102]。

3心肌细胞状态

年龄和老化：谱系示踪技术发现，小鼠的心肌增殖活动在出生后逐渐下降，并在青春期以前(P12)降至成年水平[53]。对不同年龄的人心肌组织进行消化分离，再进行流式细胞分析发现，从出生后1天到出生后第3月、第14月，PH3阳性的心肌细胞数经历两次下降后维持在成年水平[103]。

在啮齿类动物出生后7天内，心肌损伤会诱发心肌再生与修复，导致新的心肌细胞替换损失的心肌细胞[8]，在大动物模型，新生第1～2天的猪心脏在心肌损伤可完成自我修复，但出生7天后的猪心脏则不具备