细胞周期紊乱与多种疾病的发生和发展密切相关，特别是癌症等恶性肿瘤。在20世纪80年代，人们首次在海胆细胞中发现了细胞周期蛋白依赖性激酶（CDKs)[1]，到目前为止，在人类细胞中已发现20个CDKs和30多个细胞周期蛋白，它们对细胞周期的调控至关重要。

由此引发人们对细胞周期相关机制的药物进行研究，并在1991年成功研发出第一代CDK抑制剂flavopiridol，其可以特异地干扰异常CDK活性。然而由于CDK结构的相似性，第一代CDK抑制剂的特异性较差。例如，flavopiridol可抑制CDK1、CDK2、CDK4、CDK6、CDK7和CDK9，尽管可以诱导G1和G2期的细胞周期停滞，但同时也会引发细胞毒性反应[2,3]。这可能是因为缺乏CDK1,CDK1作为唯一能够启动有丝分裂（即M期）开始的CDK，其缺失会严重损害细胞的生长和发育[4]。在第二代泛CDK抑制剂中，dinaciclib被特异性开发为CDK1、CDK2、CDK5和CDK9的高效抑制剂，提高了对部分CDK的选择性，并降低了药物毒性。然而，由于对CDK4和CDK6的活性仍较低，其抗肿瘤疗效仍然有限[5]。前两代的CDK抑制剂属于非选择性CDK抑制剂，由于其广谱抑制作用缺乏特异性，导致其治疗窗口较窄，难以在剂量选择上找到合适的平衡点[6]。这是因为非选择性CDK抑制剂同时靶向多种CDKs，包括正常细胞中的CDKs。这会导致对正常细胞的影响和毒副作用增加，限制了其作为治疗药物的有效性和耐受性。为了成功开发CDK抑制剂作为癌症治疗剂，提高关键CDK的选择性变得至关重要。第三代CDK4/6抑制剂如哌柏西利、瑞博西利和阿贝西利等已成功研发。这些抑制剂在C2位具有2-氨基吡啶侧链的吡啶并[2,3-d]嘧啶-7-酮化合物结构，在对CDK4和CDK6具有高度选择性的同时，疗效显著且毒性较低。它们对CDK4和CDK6的亲和力超过其他CDK 100倍[7]。因此，第三代CDK4/6抑制剂的成功开发成为乳腺癌治疗的重要里程碑，为HR+乳腺癌患者带来新的治疗方案和希望。

1、CDK4/6抑制剂的作用机制

CDK4/6抑制剂是一类具有细胞周期调控功能的药物，其作用机制主要在于CDK4和CDK6两个亚型的活性，以阻断它们与D型细胞周期蛋白（cyclin D）的结合[8]（图1），使得视网膜母细胞瘤蛋白（RB1）无法被磷酸化，导致RB1与E2F复合物的稳定形成，并防止E2F因子从RB1-E2F复合物中解离，从而抑制细胞周期的转化[9]，这一关键过程在细胞周期调控中发挥着重要作用。

2、CDK4/6抑制剂相关的分子机制及潜在生物标志物

2.1 靶向位点的过度激活

2.1.1 Cyclin D-CDK4/6过表达

Cyclin D-CDK4/6-RB途径的上调是CDK4/6抑制剂最常见的耐药途径[10]，在超过50%的乳腺癌细胞中发现。而cyclin D1也是ER的直接转录靶点[11]，其表达水平与细胞对CDK4/6的敏感性相关。Gong等[12]发现cyclin D1过表达的细胞对阿贝西利的敏感性更高。CDK4作为cyclin D-CDK4/6-RB信号通路的组成部分，其过表达也会影响CDK4/6抑制剂的疗效。一项针对肺泡横纹肌肉瘤细胞的研究表明，在过表达CDK4的细胞中CDK4/6抑制剂的活性明显降低[13]。此外，CDK4过表达的神经胶质瘤细胞也会对CDK4/6抑制剂耐药[14]，然而在其他癌种中是否也存在相似的耐药性仍待研究。Alves等[15]发现在接受氟维司群治疗的患者中，CDK6高表达与较短的无进展生存期（PFS）存在显著相关性，在细胞系中CDK6的表达明显增强，而通过抑制CDK6可以使细胞对氟维司群的敏感性得到恢复。因此，CDK6可能是一个可以预测氟维司群疗效的生物标志物。

2.1.2 FGFR扩增

成纤维细胞生长因子受体（FGFRs）是在细胞膜上表达的受体酪氨酸激酶家族。FGFRs由四个酪氨酸激酶受体（FGFR1-4）组成，在细胞发育过程起着至关重要的作用[16]。Helsten等[17]在对4853个不同肿瘤患者样本观察后发现，有343个病例中有FGFR突变，总发生率为7.1%。FGFR1过表达和扩增结合FGF2后，介导MAPK和PI3K/AKT通路的激活，促进细胞生长和增殖，并降低乳腺癌细胞对内分泌治疗的敏感性。此外，FGFR1信号通路还抑制了孕激素受体的表达和活性，降低了对内分泌治疗的敏感性。通过沉默FGFR1可预防FGF2介导的内分泌耐药性[18]。研究还发现，在luminal B型乳腺癌中，有16%～27%的肿瘤发生FGFR1扩增，且FGFR1扩增型肿瘤患者的Ki67表达水平较高，进一步证明了FGFR1扩增和过表达是luminal B型乳腺癌预后较差的重要因素。在使用CDK4/6抑制剂治疗的PALOMA-3和MONALEESA-2研究中，患者的ct DNA显示FGFR1扩增与PFS缩短显著相关[19,20]，这表明FGFR扩增与CDK4/6抑制剂的耐药性以及内分泌抵抗存在关联。这些发现对于深入了解肿瘤的分子机制，指导个体化治疗及开发新的治疗策略具有重要意义。

图1 CDK4/6抑制剂的作用机制及相关耐药通路（FAT1可以通过YAP/TAZ蛋白抑制单体CDK4或CDK6；单体CDK4或CDK6同样可被INK4蛋白家族所抑制；而cyclin D1-CDK4/6复合物可以被CIP/KIP家族的成员抑制或激活。FGFR1和PTEN通过激活或抑制PI3K/AKT/m TOR通路来实现对细胞周期的调控）  

2.2 靶向位点的缺失

2.2.1 RB缺失

肿瘤抑制因子RB是细胞周期中的关键位点，其完整性是细胞对CDK4/6抑制剂敏感的重要条件，RB也是目前最广泛研究和报道的生物标志物之一，其缺失或突变是CDK4/6抑制剂最常见的耐药机制之一[21,22]。实际上，CDK4/6抑制剂能够有效地抑制多种人类RB阳性肿瘤（包括乳腺癌、结肠癌、肺癌等）的增殖，而RB阴性肿瘤细胞对CDK4/6抑制剂无明显抑制效果。在接受CDK4/6抑制剂治疗HR+/HER2-的348个晚期乳腺癌样本中，2.5%的样本存在RB1缺失的基因组改变，并与较短的PFS相关[23]。在对MONALEESA-2、-3和-7试验中的ct DNA进行汇总分析后发现，与RB1突变的肿瘤患者相比，RB1野生型患者从瑞博西利的PFS获益更长[24]。然而，RB1突变是罕见的，仅在5%～10%的乳腺癌患者中可见[25]。在PALOMA-3研究中，127名患者中仅6名患者在接受哌柏西利治疗后出现RB1功能丧失[26]。除此之外，RB作为生物标志物的使用变得困难的是，当RB蛋白缺失时，细胞周期仍可通过E2F或CCNE-CDK2等通路继续进行，这意味着功能性RB并不是CDK4/6抑制剂发挥作用的必要条件[27]。在膀胱癌模型中，发现哌柏西利在RB突变组与RB野生组中一样有效[28]。相反，在一项针对RB缺失的晚期食管癌和胃癌患者的II期临床研究中发现，功能性RB的存在并不能确保对CDK4/6抑制剂有治疗反应[29]。目前对于RB缺失的理解还需要更多的深入研究，以便更好地指导临床应用和治疗决策。

2.2.2 FAT1缺失

FAT非典型钙黏蛋白1(FAT1）位于4号染色体上，是一种肿瘤抑制基因[30]，其缺失可能通过调节YAP和TAZ的活性来抑制Hippo通路，介导CDK6的过表达，并降低细胞对CDK4/6抑制剂的敏感性，从而引起CDK4/6抑制剂耐药[23]。对来自MSK-IMPACT数据库的348名治疗前患者的活检标本回顾性分析显示，FAT1缺失的患者平均无进展生存期（m PFS）显著降低，且对三种CDK4/6抑制剂均产生耐药[31]。因此，FAT1缺失可能是CDK4/6抑制剂耐药的有效预测标志物。

2.2.3 PTEN缺失

PTEN是一种普遍表达的肿瘤抑制因子，在人类肿瘤细胞中常出现失活现象[32]。PTEN是PI3K/AKT/m TOR信号通路的主要负调控因子，在控制细胞增殖、生长、存活和代谢等一系列重要细胞过程中发挥关键作用。PTEN失活会导致该通路的过度活化，促进肿瘤进展[33]。研究发现，PTEN缺失导致细胞内AKT信号通路的异常激活及影响p27在细胞核内的定位，这会引起CDK2和CDK4活性增加，导致细胞周期失控和增殖增强，从而引起对CDK4/6抑制剂的耐药性[34,35]。并发现通过抑制AKT或调节p27定位可以恢复对CDK4/6抑制剂的敏感性，这一机制的理解为克服PTEN缺失引起的抗药性提供了新的治疗策略，例如通过抑制AKT信号通路或调节p27核定位来改善治疗效果[34]。然而遗憾的是，PTEN缺失在耐药的ER+乳腺癌中较为罕见。

2.3 靶向位点的突变

2.3.1 ESR1突变

在乳腺癌中，ESR1突变与芳香化酶抑制剂耐药有关[36]，大约有40%的转移性乳腺癌患者存在ESR1突变，而在内分泌耐药患者中的比例约为20%[37]。SOFEA研究发现，在循环肿瘤DNA(ct DNA）中检测到ESR1突变的患者中，与使用芳香化酶抑制剂（AI）治疗相比，使用氟维司群治疗的患者的无进展生存期（PFS）明显改善。即ESR1突变可以预测对AI治疗的耐药性，但对氟维司群则没有。这表明在ESR1突变患者中，氟维司群具有疗效优势[38]。一些研究表明，ESR1突变可能与CDK4/6抑制剂耐药性相关。特别是ESR1 Y537S和D538G突变会导致雌激素受体的构象变化，使其对抑制剂产生较低的敏感性，从而降低CDK4/6抑制剂的疗效[39]。ESR1突变的检测可以帮助临床医生预测患者对芳香化酶抑制剂的耐药性，从而指导对治疗策略的优化。

2.3.2 ERBB2突变

ERBB2也被称为人类表皮生长因子受体2(human epidermal growth factor receptor 2,HER2），属于酪氨酸蛋白激酶家族，参与细胞增殖、分化、迁移、凋亡等过程[40]。有2%～4%的乳腺癌患者存在ERBB2突变，特别是在转移性乳腺癌中更常见[41]。研究表明，在接受抗雌激素治疗后，乳腺癌患者的ERBB2突变频率明显增加。对GENIE数据库的分析显示，70%的ER+/HER2-乳腺癌患者在治疗后可检测到ERBB2突变，而转移性乳腺癌活检标本中ERBB2突变的频率几乎是原发性乳腺癌的两倍。ERBB2突变会过度激活HER3和PI3K/AKT/m TOR信号通路，导致抗雌激素治疗耐药。通过添加HER受体抑制剂奈拉替尼，可以恢复对氟维司群的敏感性。这表明ERBB2突变与ET治疗耐药有关[42,43]。因此，使用双重阻断ER和HER通路的方法可能改善ER+/HER+乳腺癌患者的治疗效果，但这仍需要进一步的研究来验证其有效性。

2.4 CCNE-CDK2通路激活

在正常的细胞周期中，细胞周期蛋白E1(CCNE1）和细胞周期蛋白E2(CCNE2）可与CDK2结合形成CCNE-CDK2复合物，促进RB的磷酸化，通常情况下，CCNE1/2和CDK2只起到次要信号传导通路的作用（图1）。因此，cyclin E1/2和CDK2过度表达可以绕过CDK4/6的抑制活性，促进细胞的增殖和生长[44,45]。在PALOMA-3试验中评估了氟维司群+哌柏西利的疗效，并发现CCNE1低表达与哌柏西利更好的疗效相关[46]。这一发现也在术前POP试验中同样得到了验证[47]。

另外有研究发现，在肿瘤细胞中，cyclin E经过中性粒细胞弹性蛋白酶的蛋白水解作用，产生低分子量形式的细胞周期蛋白E(LMW-E）。LMW-E的高表达可以引起肿瘤细胞中RB的过度磷酸化，从而预测到转基因小鼠模型和乳腺癌患者肿瘤复发的风险[48]。在三阴性乳腺癌（TNBC）和其他癌症中，LMW-E独立于RB缺失因素，介导了对哌柏西利的耐药性。据Doostan等[49]报道，接受新辅助内分泌治疗的LMW-E阳性患者无复发，生存率明显低于LMW-E阴性患者。在2494例乳腺癌患者中，LMW-E预测了复发可能性最高的患者人群，其中LMW-E阳性的患者预后不良，与分子亚型无关[50]。这些研究结果支持CCNE1可能是CDK4/6抑制剂耐药性标志物的假设。

2.5 内源性CDK4/6抑制蛋白

周期蛋白依赖性蛋白激酶抑制剂（CKI）主要由两个家族组成：INK4家族（p16INK4A、p15INK4B、p18INK4C、p19INK4D）和CIP/KIP家族（p21CIP1、p27KIP1、p57KIP2），它们在调节细胞周期进程中发挥着关键性作用[51]。p16INK4A(CDKN4A）的缺失被认为是对CDK4/6抑制剂敏感性的标志物，其表达增加与乳腺癌患者的较好预后相关。Cen等[14]的研究发现，胶质母细胞瘤（GBM）对哌柏西利治疗的敏感性与p16INK4A-CDK4-RB通路的分子变化密切相关。此外，他们还发现哌柏西利可以有效抑制CDKN4A缺失、CDK4扩增或CDK6扩增的肿瘤细胞系中磷酸化RB水平的增加。另外，还有两个病例（集合管癌和子宫平滑肌肉瘤）显示了p16INK4A基因缺失的患者同样对哌柏西利治疗有明显反应[52]。这些研究结果表明p16INK4A的调控机制在CDK4/6抑制剂治疗中可能起到重要作用，为深入研究其临床应用奠定了基础。

2.6 PI3K/AKT/m TOR轴

PI3K/AKT/m TOR信号通路参与肿瘤的生长、增殖、代谢和迁移，多项研究表明，在高达70%的人类肿瘤中，该信号通路被上调[53,54]。在ER+乳腺癌患者中，发现了40%的患者出现了PI3K通路的改变，尤其是PIK3CA突变，是内分泌耐药的转移性乳腺癌中最常见的突变基因之一[55]。Cai等[56]研究发现，cyclin D1和CDK4蛋白过表达会促进乳腺癌细胞对CDK4/6抑制剂的获得性耐药，并发现PI3K/m TOR抑制剂可以通过调节4E-BP1蛋白（翻译抑制因子）的表达水平，来降低cyclin D1和CDK4蛋白的表达，从而恢复对CDK4/6抑制剂的敏感性（图1）。这表明4E-BP1蛋白可能作为预测CDK4/6抑制剂耐药的生物标志物，联合应用CDK4/6抑制剂和PI3K/m TOR抑制剂可以克服乳腺癌对CDK4/6抑制剂的获得性耐药性。

2.7 其他相关生物标志物

2.7.1 血清胸苷激酶1水平

胸苷激酶1(TK1）是一种细胞周期依赖性胞浆酶，是DNA合成和细胞增殖的关键调节因子。可以在血浆中通过非侵入性形式检测其蛋白水平或测量其活性形式（TKa）来评估，在健康人中，TK1水平较低，而在恶性肿瘤患者中常观察到升高的TK1水平。新辅助研究Neo Pal Ana中报道了肿瘤细胞增殖与血清TKa之间的关联[57,58]。有意思的是，TK1的合成受CDK4/6抑制剂靶点E2F途径的调节，这使其成为CDK4/6抑制剂的一个有吸引力的潜在标志物[59]。在TREnd研究中，发现HR+乳腺癌患者在接受哌柏西利治疗1周后，TK1是区分获得性耐药和敏感细胞系中表达差异最显著的基因之一[60]。治疗一个周期后，与TK1稳定或降低的患者相比，TK1活性升高的患者的m PFS显著下降[61]。这表明TK1活性的变化可作为哌柏西利治疗耐药性的早期标志物。

2.7.2 AP-1

AP-1家族由Jun、Fos、活化转录因子（ATF）和转录因子MAF亚家族的同源二聚体和异二聚体组成，是调节多种基因的转录因子[62]。研究表明，过表达AP-1蛋白会导致对CDK4/6抑制剂的耐药性[63]。例如，在对哌柏西利和他莫昔芬耐药的MCF7细胞中观察到AP-1的转录活性升高和c-Fos水平的增加[64]。然而从机制上来讲，目前尚不清楚为什么AP-1过表达与CDK4/6抑制剂耐药有关。

2.7.3 外泌体

有研究表明外泌体在乳腺癌中发挥重要作用，并与治疗反应和耐药性相关。部分mi RNA通过外泌体分泌并被敏感细胞吸收，导致这些细胞对palbociclib产生抗药性[65]。Andrikopoulou等[66]研究发现六种mi RNA，包括mi R-126、mi R-326、mi R-3613-3p、mi R-29b-3p、mi R-497和mi R-17-92与CDK4/6抑制剂的敏感性相关。另外，还有六种mi RNA，包括mi R-193B、mi R-432-5p、mi R-200a、mi R-223、let-7a和mi R-21与CDK4/6抑制剂的耐药性相关。这些研究强调了外泌体和mi RNA在CDK4/6抑制剂治疗中的重要性，并为外泌体作为潜在的预测和监测CDK4/6抑制剂耐药性的生物标志物提供了机会。

3、总结与展望

CDK4/6抑制剂已成为治疗乳腺癌的重要药物，目前已被广泛应用于乳腺癌等肿瘤治疗中。然而，乳腺癌患者对CDK4/6抑制剂的耐药性仍然是一个挑战。因此，亟需找到一种可靠的生物标志物来预测CDK4/6抑制剂的敏感性及耐药性。目前已有的研究探索到一些潜在的生物标志物，这些标志物的存在可以帮助监测CDK4/6抑制剂的治疗反应和预测患者的进展风险，从而提高治疗效果和减轻患者的治疗试错成本。然而，目前还需要更多的研究来验证这些潜在生物标志物在临床实践过程中的有效性及实用性。此外，还需要深入了解其他可能与CDK4/6抑制剂疗效和耐药性相关的分子和细胞机制，以寻找更准确和可靠的生物标志物。未来的研究方向应该包括：(1)探索更多的预测CDK4/6抑制剂疗效的生物标志物，例如通过基因组学、转录组学和生物信息学等方法来鉴定相关的分子标志物；(2)深入研究CDK4/6抑制剂耐药性的分子机制，寻找可能存在的生物标志物，以帮助优化治疗策略；(3)开展大规模的临床试验，用以验证这些生物标志物的可靠性和准确性。

总之，CDK4/6抑制剂在乳腺癌治疗中具有显著的疗效，而预测疗效和耐药性的生物标志物是个具有挑战性但非常重要的领域。随着进一步的研究和临床实践，我们对CDK4/6抑制剂的应用和乳腺癌治疗策略将有更深入的理解和发展。

文章来源:陈龙,张英.CDK4/6抑制剂敏感性及耐药性生物标志物的研究进展[J].中国医药生物技术,2024,19(02):155-160.