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葡萄籽原花青素对砷诱导的小鼠睾丸损伤的保护作用

2024-03-15 12 上传者：管理员

摘要：目的探讨葡萄籽原花青素(GSPs)对砷暴露小鼠睾丸核因子-E2相关因子(Nrf2)抗氧化系统和线粒体生物合成的影响。方法 ICR小鼠随机分为对照组、模型组、GSPs组和实验组。模型组和实验组小鼠饮用亚砷酸钠水溶液(10 mg·L-1砷)诱导睾丸损伤，GSPs组和实验组给予100 mg·kg -1 GSPs灌胃，对照组和模型组给予等体积蒸馏水灌胃，每天1次，连续8周。用苏木精-伊红(HE)染色制片对睾丸组织学参数测量，用试剂盒法测定睾丸组织丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)和腺苷三磷酸(ATP)含量，用实时定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法检测血红素加氧酶1(HO-1)、醌氧化还原酶1 (NQO1)的表达水平，用免疫组化法检测睾丸组织Nrf2蛋白表达，用蛋白质印迹法检测睾丸线粒体合成相关蛋白的表达。结果对照组、模型组、GSPs组、实验组的生精小管直径分别为(184.32±14.14)、(170.41±10.70)、(186.87±8.03)和(181.70±9.15)μm, MDA分别为(2.30±0.26)、(3.28±0.64)、(2.32±0.40)和(2.74±0.31) nmol·mg-1,Nrf2阳性表达细胞比例分别为(46.50±11.98)%、(22.33±8.82)%、(51.67±12.44)%和(39.83±8.35)%,HO-1 mRNA表达水平分别为1.00±0.21、0.51±0.10、1.00±0.28和0.80±0.06,NQO1 mRNA表达水平分别为1.00±0.18、0.59±0.11、1.09±0.28和0.81±0.08,ATP分别为(491.83±67.16)、(368.81±69.93)、(512.44±70.96)和(472.20±68.24)μmol·g -1,PGC-1α蛋白相对表达水平分别为1.00±0.06、0.22±0.03、0.94±0.05和0.48±0.05,TFAM蛋白相对表达水平分别为1.00±0.07、0.32±0.05、0.80±0.05和0.67±0.06。实验组的上述指标与模型组相比，在统计学上差异均有统计学意义(P<0.05,P<0.01)。结论 GSPs可通过激活Nfr2抗氧化系统和促进线粒体生物合成，对砷诱导的小鼠睾丸损伤具有保护作用。

关键词：
核因子NF-E2相关因子
氧化应激
砷
线粒体生物合成
葡萄籽原花青素
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人群流行病学研究资料显示，砷暴露危害男性生殖系统，砷介导的氧化应激被认为是砷致雄性生殖毒性的主要发病机制之一[1]。砷诱导的氧化应激可引起线粒体功能障碍[2]。目前，砷的雄性生殖损伤尚缺乏有效的防治措施。葡萄籽原花青素（grape seed proanthocyanidins,GSPs）是一种天然抗氧化剂，在抗氧化、抗炎、调节线粒体功能等方面具有广泛的药理作用[3]。本研究旨在探讨GSPs对砷致小鼠睾丸损伤的保护作用及其可能机制。

一、材料与方法

1材料

动物SPF级雄性ICR小鼠，4～5周龄，体质量（30±2) g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，动物许可证号：SCXK（京）2021-0006。本实验经山西中医药大学动物伦理委员会批准（伦理批号：2021DW142）。

药品与试剂葡萄籽原花青素，纯度：>95.0%，批号：002-2008055-24，购自天津尖峰天然产物开发有限公司。丙二醛（malondialdehyde,MDA）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）、腺苷三磷酸（adenosine triphosphate,ATP）含量测试盒，均购自南京建成生物工程研究所；沉默信息调节因子1(silence information regulator 1,SIRT1）抗体，购自英国Abcam公司；过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子1α (peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator 1a,PGC-1α）抗体，购自上海碧云天公司；核呼吸因子1(nuclear respiratory factor 1,NRF1）抗体，购自美国CST公司；线粒体转录因子A (mitochondrial transcription factor A,TFAM）抗体，购自南京bioworlde公司；引物，均由广州艾基生物技术有限公司合成。

仪器GelDoc XR+凝胶成像分析系统，美国Bio-Rad公司产品；BX51光学显微镜，日本Olympus产品；AiraMx实时荧光定量PCR系统，上海安捷伦科技有限公司产品；宝特EPOCH酶标仪，济南骏驰生物科技有限公司产品。

2实验方法

2.1模型构建[4]、动物分组与给药方法

32只雄性ICR小鼠适应性饲养1周后按体质量随机分为4组：对照组、模型组、GSPs组和实验组，每组8只。模型组和实验组饮用亚砷酸钠水溶液（10mg·L-1砷）；对照组和GSPs组饮用蒸馏水。自实验开始之日起，GSPs组和实验组灌胃给予GSPs(100mg·kg-1），对照组和模型组灌胃给予等体积蒸馏水，每天1次，连续处理8周。实验结束后，禁食12 h取材。

2.2睾丸指数[5]

称取小鼠体质量，取出睾丸称质量，计算睾丸系数。

2.3苏木精-伊红（hematoxylin-eosin,HE）染色制片对睾丸组织学参数测量[6]

将睾丸组织块固定于10%中性甲醛，梯度乙醇脱水，石蜡包埋，切片，HE染色，脱水，透明，中性树胶封片，染色切片在光学显微镜下观察，选择断面为圆形或接近圆形的睾丸生精小管，使用显微测微尺测定生精小管直径及生精上皮厚度并进行统计学分析。

2.4试剂盒法测定睾丸组织SOD活性、MDA和ATP含量[7]

冷冻保存的睾丸组织制备10%的匀浆液，用蛋白定量测试盒测定各组织样品的蛋白含量，根据测定试剂盒说明书检测SOD活性、MDA和ATP含量。

2.5实时定量逆转录聚合酶链反应（real-time fluorescent quantitative reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR）法检测血红素加氧酶1(heme oxygenase 1,HO-1）、醌氧化还原酶1(quinone oxidoreductase 1,NQO1) mRNA表达水平[8]

用Trizol法提取睾丸总RNA，利用反转录试剂盒合成cDNA，用qPCR Mix试剂盒进行目的基因扩增，扩增程序：95℃3 min,95℃5 s,60℃40 s,40个循环。以β-actin作为内参，用2-ΔΔCt法计算各目的基因的相对表达量。

2.6免疫组化法检测睾丸组织核因子NF-E2相关因子（nuclear factor erythroid 2-related factor 2,Nrf2）蛋白的表达

将肝组织石蜡切片经脱蜡水化并按参考文献[8]进行免疫组化染色，显微镜观察并拍照。棕色和黄色染色代表阳性细胞，计数视野中总细胞数以及阳性细胞数。Nrf2蛋白表达率（%）=阳性细胞数/总细胞数×100%。

2.7蛋白质印迹法检测睾丸线粒体合成相关蛋白的表达[9]

提取睾丸总蛋白并进行定量，等量的蛋白样品上样后，十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳后进行转膜，用5%脱脂奶粉配制的封闭液封闭。加入一抗4℃孵育过夜，加入二抗室温孵育1.5 h。用ECL发光显影，分析蛋白条带灰度值并计算蛋白相对表达量。

3统计学处理

用SPSS 16.0软件进行分析。计量资料以表示，组间比较用单因素方差分析。

二、结果

1各组小鼠体质量、睾丸质量及睾丸指数的比较

模型组和实验组饮用含10 mg·L-1的砷水，对照组和GSPs组饮用蒸馏水；GSPs组和实验组给予100mg·kg-1GSPs灌胃，对照组和模型组给予等体积蒸馏水。

各组小鼠体质量相比较，在统计学上差异均无统计学意义（均P>0.05）；与对照组比较，模型组睾丸质量和睾丸指数均显著降低（均P<0.05）；与模型组比较，实验组睾丸指数显著升高（P<0.05），结果见表1。

表1 各组小鼠体质量、睾丸质量及睾丸指数（,n=8)

2各组小鼠睾丸组织学参数及线粒体ATP含量的比较

与对照组相比，模型组生精小管直径和生精上皮厚度均明显减小（P<0.05,P<0.01）；与模型组相比，实验组生精小管直径和生精上皮厚度均明显增加（P<0.05,P<0.01）。模型组小鼠睾丸ATP含量较对照组明显下降（P<0.01），实验组ATP含量较模型组明显上升，在统计学上差异有统计学意义（P<0.05），结果见表2。

3各组小鼠睾丸组织氧化应激参数比较

对照组、模型组、GSPs组、实验组小鼠睾丸组织中MDA表达水平分别为（2.30±0.26）、（3.28±0.64）、（2.32±0.40）和（2.74±0.31) nmol·mg-1,SOD分别为（159.98±24.36）、（113.19±29.21）、（153.28±31.52）和（149.13±22.99) U·mg-1；与对照组比较，模型组小鼠睾丸MDA含量显著增加（P<0.01），而SOD明显降低（P<0.05）；与模型组比较，实验组小鼠MDA含量显著降低（P<0.05),SOD活性明显升高（P<0.05）。

表2 各组小鼠睾丸组织学参数及腺苷三磷酸（ATP）含量（,n=8)

4各组小鼠睾丸组织Nrf2、HO-1和NQO1表达的比较

对照组、模型组、GSPs组、实验组小鼠睾丸组织中Nrf2阳性表达细胞比例分别为（46.50±11.98）%、（22.33±8.82）%、（51.67±12.44）%和（39.83±8.35）%。与对照组相比，模型组小鼠睾丸Nrf2表达显著降低（P<0.01）；与模型组相比，实验组小鼠睾丸Nrf2表达明显升高，在统计学上差异有统计学意义（P<0.01），免疫组化结果见图1。对照组、模型组、GSPs组、实验组小鼠睾丸组织中HO-1 mRNA表达水平分别为1.00±0.21、0.51±0.10、1.00±0.28和0.80±0.06,NQO1 mRNA表达水平分别为1.00±0.18、0.59±0.11、1.09±0.28和0.81±0.08；模型组与对照组比较，小鼠睾丸组织HO-1和NQO1mRNA表达水平均明显下调（P<0.01）；实验组与模型组比较，睾丸组织HO-1和NQO1 mRNA表达水平均明显增加（均P<0.05）。

图1 各组小鼠睾丸组织核因子-E2相关因子（Nrf2）免疫组化染色结果（×200)

5各组小鼠睾丸组织中线粒体生物合成相关蛋白表达比较

对照组、模型组、GSPs组、实验组小鼠睾丸中SIRT1蛋白相对表达水平分别为1.00±0.07、0.74±0.05、0.91±0.07和0.76±0.06,PGC-1α蛋白相对表达水平分别为1.00±0.06、0.22±0.03、0.94±0.05和0.48±0.05,NRF1蛋白相对表达水平分别为1.00±0.05、0.88±0.09、1.08±0.07和0.89±0.07,TFAM蛋白相对表达水平分别为1.00±0.07、0.32±0.05、0.80±0.05和0.67±0.06。与对照组相比，模型组睾丸组织SIRT1、PGC-1α、NRF1和TFAM蛋白相对表达水平均显著下降，在统计学上差异均有统计学意义（P<0.05,P<0.01）；与模型组比较，实验组PGC-1α和TFAM蛋白相对表达水平均明显升高（均P<0.01），而SIRT1和NRF1蛋白相对表达水平在统计学上差异均无统计学意义（均P>0.05）。

三、讨论

Nrf2是氧化应激中促进细胞存活的重要转录因子，通过启动下游内源性抗氧化酶基因如HO-1、NQO1等表达，增强抗氧化防御系统对机体的保护作用[10]。MAHALANOBISH等[11]发现砷暴露小鼠通过抑制Nrf2信号通路，加重氧化应激对细胞的毒性，引起肺组织氧化损伤。另有研究发现，激活Nrf2及其靶基因HO-1和NQO1的表达可缓解雷公藤甲素致小鼠睾丸的氧化损伤[12]。本研究中，模型组睾丸Nrf2蛋白表达显著降低，而实验组明显增加Nrf2蛋白表达，另外模型组被下调的HO-1和NQO1 mRNA表达在GSPs治疗后显著升高，以上结果提示GSPs可能通过激活Nrf2及其促进下游抗氧化酶基因表达提高睾丸的抗氧化能力，对砷诱导的睾丸氧化损伤具有保护作用。

线粒体的主要功能是产生ATP，为细胞各种生理活动提供能量。ZHANG等[12]指出由氧化应激诱导的睾丸线粒体损伤是引起睾丸损伤、精子发生障碍的关键因素。文献报道[13]，砷诱导的氧化应激可损伤睾丸线粒体，导致线粒体功能障碍。本研究发现模型组睾丸ATP含量明显降低，实验组ATP含量明显增加，表明GSPs可促进ATP合成，改善砷致睾丸线粒体功能障碍。以往研究表明，线粒体生物合成与ATP生成关系紧密，促进线粒体生物合成可增加细胞内ATP含量[14]。线粒体生物合成受多因子调控，PGC-1α是重要的调节因子，通过整合并协调NRF1、TFAM等因子完成对线粒体生物合成及能量代谢的调控[14]。此外，SIRT1作为一种去乙酰化酶，可通过增强PGC-1α去乙酰化参与线粒体生物合成[15]。YE等[13]发现砷暴露显著下调SIRT1、PGC-1α和TFAM蛋白从而抑制小鼠睾丸线粒体生物合成。与YE等[13]研究相一致，本研究结果显示模型组抑制SIRT1、PGC-1α、NRF1和TFAM蛋白表达，而实验组PGC-1α和TFAM蛋白显著上升，以上结果提示GSPs可能通过上调线粒体生物合成部分相关蛋白促进线粒体生物合成，加快线粒体自我更新，从而改善线粒体功能，增加ATP合成。

本研究结果表明，GSPs可通过激活Nfr2抗氧化系统和促进线粒体生物合成减轻砷致小鼠睾丸氧化损伤和线粒体功能损伤。可见，GSPs是防治砷致雄性生殖损害的有效手段，但其具体作用机制仍需进一步研究。

参考文献:

[3]吴朝霞.葡萄籽原花青素分离提纯､组分鉴定及抗氧化性研究[D].辽宁沈阳:沈阳农业大学,2005.

[5]杨乐乐,林丽君,吴小芬,等.人参总皂苷调控过氧化物酶体增殖物激活受体通路治疗心力衰竭大鼠的研究[J].中国临床药理学杂志,2023,39(7):976-979.

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[8]胡义阳,杨忠明.积雪草酸通过调控Nrf2/NF-κB治疗MRL/lpr小鼠狼疮性肾炎的实验研究[J].中国免疫学杂志,2021,37(13):1587-1590.

[9]陈效,何志红,罗子云,等.甘草甜素对脂多糖诱导急性肾损伤小鼠的作用及机制研究[J].中国临床药理学杂志,2023,39(4):533-537.

基金资助:山西省基础研究计划基金资助项目(20210302123232);山西省卫生健康委科研基金资助项目(2020097);山西中医药大学科技创新能力培育计划基金资助项目(2020PY-JC-08);山西中医药大学山西教育厅基金资助项目(2020L0459);山西中医药大学博士科研启动基金项目(2023BK55);

文章来源:曾群,赵果毅,吴娜等.葡萄籽原花青素对砷诱导的小鼠睾丸损伤的保护作用[J].中国临床药理学杂志,2024,40(05):713-717.