犬细小病毒病是由犬细小病毒引起的犬的一种传染病,CPV是一种具有高度传染性的无囊膜的单链DNA病毒,可在家犬、猫和几种野生食肉动物中引起急性胃肠炎[1,2]。未接种疫苗的幼犬患病率较高,患病犬如果治疗及时,病死率在9%左右,如果治疗不及时,病死率可达91%左右,是目前危害犬类健康的最为严重的传染病之一[3,4]。

CPV最早在1977年由美国学者发现,为了与犬微小病毒相区别,在1978年命名为CPV-2[3,5]。我国最早是在1982年由梁士哲等[6]发现并报道该病。随后在我国的很多地方开始流行,并由现在的CPV-2c、CPVNew-2a和CPVNew-2b逐渐替代了原来的CPV-2、CPV-2a、CPV-2b,目前CPV-2c在中国的吉林、北京、山东、河南、广西和江苏已有报道[7,8,9,10,11,12,13]。CPV基因组全长5200nt,包括3个结构蛋白(VP1、VP2和VP3)和2个非结构蛋白(NS1和NS2),其中VP2是该病毒的主要抗原蛋白,占整个衣壳蛋白的90%[14]。该病毒自发现至今只有1个血清型,但随着病毒的演变从发现至今共出现了6个抗原亚型CPV-2、CPV-2a、CPV-2b、CPV-2c、NewCPV2a、NewCPV2b,并且不同毒株之间的抗原性也略有差异[15,16,17,18]。

本研究在对VP2基因进行分析的基础上,对鉴定为NewCPV2a的北京毒株进行分离和病毒相关特性鉴定,有助于了解和掌握目前CPV的流行情况,为更好地防控CPV提供参考。

1、材料与方法

1.1材料

1.1.1临床样本

临床样品来自北京和山东两地的宠物医院,病犬临床症状为呕吐、腹泻等,临床疑似为CPV感染,同时采集病犬的粪便样品备用。

1.1.2细胞与主要试剂

F81细胞,本实验室保存;CPV单克隆抗体,INGENASA公司产品;Goatanti-MouseIgG(H+L)HighlyCross-AdsorbedSecondaryAntibody,FITC(货号A16079),英潍捷基(上海)贸易有限公司产品;2×EsTaqMasterMix,康为世纪生物制品有限公司产品;粪便基因组提取试剂盒、质粒提取试剂盒、DNA片段回收试剂盒、Top10感受态细胞和细菌基因组DNA提取试剂盒,天根生化科技有限公司产品;DNA标准DL2000,TaKaRa有限公司产品;DMEM、胎牛血清、胰蛋白酶、双抗,英潍捷基(上海)贸易有限公司产品;透析袋,Calbiochem公司产品;蛋白电泳缓冲液、TEMED,索莱宝公司产品。

1.1.3仪器设备

3111型细胞培养箱,美国FormaScientific公司产品;Centrifuge5430R型低温离心机、Mastercyclernexusgradient梯度PCR仪,德国Eppendorf公司产品;NikonEclipseTi-U型倒置荧光显微镜,日本Nikon公司产品;Mini-PROTEANⅢ型蛋白电泳系统、GelDoc2000凝胶成像系统,Bio-Rad公司产品;OptimaLE-80K型超速离心机,美国BeckmanCoulter公司产品。

1.2方法

1.2.1VP2基因的克隆及分析

用DMEM将收集的粪便样品进行10倍稀释后,按照天根生化科技有限公司的粪便基因组提取试剂盒说明书提取病毒的DNA,PCR扩增VP2全基因,反应结束后,将PCR产物经10g/L琼脂糖凝胶检测。VP2全基因扩增用引物见表1。

根据天根生化科技有限公胶回收试剂盒回收目的片段,将其克隆入pMD19-T载体中,16℃连接过夜,将连接产物转化大肠埃希菌(E.coli)DH5α感受态,涂布氨苄抗性的固体LB平板,在37℃恒温培养箱中培养12h。挑单个菌落接种至氨苄抗性液体LB培养基,在37℃、180r/min的水平恒温摇床中培养14h,进行菌液PCR,将阳性克隆菌液送至北京擎科新业生物技术有限公司测序,并利用MegAlign软件将VP2基因序列与GenBank中已有的VP2序列进行比对。

表1扩增用引物序列

1.2.2病毒样品处理及分离

将序列测定为CPVNew-2a的粪便样品在4℃、3000r/min离心20min,取上清,经0.22μm微孔滤膜过滤除菌后备用。从液氮罐中取出F81细胞,快速置于37℃水浴锅,将融化后的细胞液加入到含有100mL/LFBS的DMEM培养液中,置37℃、体积分数为5%的CO2温箱中培养。

采用同步接毒的方法,在F81细胞传代的同时将上述处理好的病毒样品按1∶10的比例进行接种,接种后放入37℃、体积分数为5%的CO2温箱中培养,每天观察细胞病变,当细胞病变出现80%左右时收获病毒液,并反复冻融3次。用此方法反复增殖病毒,并用于病毒的提纯。

1.2.3病毒纯化及形态观察

将反复冻融后的病毒液装入处理好的透析袋中,用PEG8000覆盖在透析袋上,待透析至合适体积时终止透析,收集透析袋中的病毒液。10000r/min离心1h,收集上清。30000r/min离心2h,弃掉上清,用PBS重悬沉淀。将0.3、0.4、0.5、0.6g/mL4种浓度的蔗糖按照浓度由低到高依次加入,最后加入2mL左右的病毒液,水平转子30000r/min离心1.5h。收集有白色絮状的环,加入STE溶液,30000r/min离心2h。取出离心管弃掉上清,沉淀用PBS重悬,30000r/min,离心2h冲洗沉淀。最后收集沉淀,将沉淀悬起放入冰箱保存。

对上述纯化好的病毒液进行磷钨酸负染,电镜观察病毒粒子的形态。

1.2.4免疫荧光试验

在96孔板中接种同时感染CPV病毒的F81细胞,37℃、体积分数为5%的CO2培养约24h左右。同时设立不接毒对照细胞孔。取出上述孔板,将接毒和对照细胞的培养液弃去,PBS洗3次。加入50μL40mg/mL多聚甲醛室温固定45min。弃掉上步液体,用50μL3mL/LTritonX-100室温透化1h。弃掉液体,PBS洗3次,加入1∶100稀释的一抗(针对VP2蛋白的单克隆抗体),每孔50μL,37℃避光孵育1.5h,PBS清洗3次。加入1∶200稀释的FITC标记的二抗,每孔50μL,37℃避光孵育45min,PBS清洗3次。加入DAPI,每孔50μL,PBS清洗3次,荧光显微镜观察结果。

1.2.5病毒毒价测定

按《动物病毒学》方法测定细胞培养物中病毒的TCID50[19]:将病毒液在灭菌EP管内连续作10倍稀释,吸取每一稀释度的病毒液100μL,加入96孔板中,每个稀释度接种8孔,同步加入100μLF81细胞,置37℃体积分数为5%的CO2温箱中培养数日,逐日观察细胞病变效应(cytopathiceffect,CPE),同步设正常F8l细胞作为对照。按Reed-Muench氏法计算CPV的TCID50。

1.2.6病毒蛋白的SDS-PAGE

取纯化后的病毒样品10倍稀释后与蛋白样品上样缓冲液混匀,100℃煮沸5min,12000r/min离心2min,分别取10μL和2μL上清直接上样到SDS-PAGE胶加样孔内,电压120V约1.5h,剥胶,染色,脱色,观察结果。

2、结果

2.1VP2基因序列的扩增结果

提取接毒后的细胞培养液的病毒DNA,经PCR扩增,琼脂糖凝胶电泳检测后,发现扩增结果与预期结果一致,回收PCR扩增产物进行测序,测序结果通过Blast比对分析,证实8份样品的序列均为CPV序列,扩增结果图1。

2.2VP2基因序列进化分析

VP2作为病毒粒子中最重要的蛋白,具有免疫原性,能够促使机体产生中和抗体。所收集的8株临床检测阳性粪便样品为:CPV-BJ1、CPV-BJ2、CPV-HB1、CPV-HB2、CPV-TJ1、CPV-SD1、CPV-SD2、CPV-SD3。将8株粪便样品的VP2全基因序列进行扩增和测序分析,结果表明所有样品的VP2基因均包括1755个核苷酸,编码584个氨基酸,氨基酸与参考毒株的同源性为97.1%～100%之间,并且所分离的毒株均与中国分离株在一个分支上(图2)。

图1PCR扩增产物鉴定结果

A.VP21;B.VP22;C.VP23;M.DNA标准DL2000;1～8.粪便样品;N.阴性对照

图2氨基酸比较结果

根据第297位和第426位氨基酸残基的分析发现,在426位氨基酸残基处,8份样品中CPV-SD3株为天冬氨酸、其余7株均为天冬酰胺;在297位氨基酸残基处,8份样品均为丙氨酸。因此,CPV-SD3属于New-2b,其余7株均为New-2a。将北京地区CPV-BJ1株的VP2编码序列在GenBank中注册,获得的序列号为MN101726,该BJ-1毒株用于后续分离。

2.3病毒的细胞分离结果

将BJ-1株粪便样品接种F81细胞盲传5代时,细胞开始出现变圆、拉网、脱落、崩解等细小病毒特有的病变症状。收集第5代病毒液反复冻融3次后再次接种F81细胞,感染48h后可见典型细小病毒特有细胞病变,细胞病变见图3。提取2次的病毒液的DNA进行PCR鉴定(图略),结果显示均为CPV阳性。

图3CPV病毒感染F81细胞病变观察

A.接种CPV的F81细胞;B.正常F81细胞

2.4病毒形态学鉴定结果

取纯化后的CPV进行20mg/mL磷钨酸负染,在电子显微镜下可见病毒粒子的外形结构为圆形或六边形,直径约25nm,有实心和空心2种病毒颗粒,其中白色箭头指向的为空心病毒颗粒、黑色箭头指向的为实心病毒颗粒(图4)。

图4病毒粒子电镜观察图片

2.5病毒的IFA鉴定结果

将分离的病毒接种F81细胞,在接毒后24h进行IFA,分别用FITC和DAPI两种荧光进行染色,结果显示,接毒组可见绿色荧光出现;未接毒组细胞则只有DAPI染细胞核的蓝色荧光(图5)。

2.6病毒毒价测定结果

将病毒10倍梯度稀释接种F81细胞后,逐日观察细胞病变,最后按照Reed-Muench法计算CPV的TCID50为10-4.35/mL。

2.7病毒蛋白的SDS-PAGE结果

纯化后的病毒蛋白经SDS-PAGE检测后,可见明显的目的条带,分别为VP176ku和VP264ku(图6)。

图5CPV间接免疫荧光鉴定结果

图6病毒纯化后的SDS-PAGE分析

M.蛋白分子质量标准;1.BSA;2.上样10μL;3.上样2μL

3、讨论

本研究通过8株临床中确诊的CPVVP2全基因序列分析结果,选取1株从北京地区收集的NewCPV-2a毒株BJ-1株进行病毒的分离,将粪便样品处理后接种F81细胞培养传代,通过细胞病变、病毒学形态、间接免疫荧光试验、SDS-PAGE试验以及分子生物学鉴定,所分离到的BJ-1株接种F81细胞后出现明显的细胞病变,电镜观察病毒粒子可见病毒粒子外形结构为圆形或六边形,直径约25nm,有实心和空心2种病毒颗粒,与《现代动物病毒学》中描述一致[19]。IFA结果发现接毒组可见明显的绿色荧光信号,TCID50结果显示,所分离的病毒的毒价为10-4.35/mL,以上结果均说明本试验成功分离到犬细小病毒。

犬细小病毒位点替代率约为2×10-4/年,与RNA病毒相近[5],变异较快,因此近几年新变异株不断的出现,而临床使用的疫苗仍基于最初发现的分离株来制备,因此时常有免疫失败的现象发生[20,21,22]。X射线晶体学解析发现,病毒衣壳由约60个结构蛋白组成,其中VP2是最主要的衣壳蛋白,VP2蛋白形成的衣壳上的纤突是决定病毒的抗原特性和宿主范围的关键区域[23,24],VP2蛋白上5个或6个关键氨基酸位点的变化,将会使得CPV的抗原性、致病性发生变化,也会使得宿主范围不断扩大,从最初的只感染犬到后来出现的可以感染猫等[14,25,26]。VP2为CPV主要的抗原决定簇,免疫原性强,能够诱导机体产生中和抗体;VP2蛋白不仅与病毒的血凝性相关,还具备与宿主细胞膜上转铁蛋白受体结合的能力,可介导病毒粒子的感染[14]。该序列的变化对CPV的特性影响很大。因此,本文选择对VP2编码序列进行测序分析。

VP2426和297位氨基酸残基的变化直接决定了CPV所属于亚型,其中第426氨基酸的变化决定是该亚型是属于CPV-2a、CPV-2b或者CPV-2c(天冬酰胺CPV-2a、天冬氨酸CPV-2b、谷氨酸CPV-2c);CPVNew-2a、CPVNew-2b的区分是通过第297位氨基酸是否发生了从原来的丝氨酸(Ser)到丙氨酸(Ala)的突变[27],297位点位于病毒衣壳蛋白表面三重纤突上抗原表位B的中间部位,有研究表明该位点的突变可能影响病毒与宿主细胞受体的亲和力[28,29]。本试验所分离到的毒株中CPV-SD3株为NewCPV-2b亚型,其余7株为NewCPV-2a亚型,由此也可以推断出CPVNew-2b和CPVNew-2a亚型可能为所采样区域的流行毒株。VP2全基因序列的分析将为研究犬细小病毒流行状况及变异趋势的监测提供依据。

本研究中对VP2基因组测序结果发现,8株毒株均与中国株在一个大的分支上,并且有较高的同源性;其中核苷酸与参考毒株的同源性在98.7%～99%之间,而氨基酸与参考毒株的同源性为97.1%～100%之间;同源关系分析发现分离株均和我国近几年流行的毒株在一支,并且与疫苗株和其他国家(地区)分离株同缘关系较远;通过进化关系推测虽然有2c型毒株在北京和山东分离并存在的报道,但是本检测结果CPVNew-2a/2b亚型还是占主要的流行毒株。因此,本病毒株的成功分离对研制NewCPV-2a或NewCPV-2b型疫苗奠定了物质基础。

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基金:北京市农林科学院青年科研基金项目(QNJJ201731);北京市农林科学院畜牧兽医研究所项目(XMS201907,XMS201910);北京市农林科学院创新能力建设项目(KJCX201914).