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关于3株PEDV 的S基因核苷酸序列及蛋白氨基酸序列的研究

2020-07-08 308 上传者：管理员

摘要：对临床分离鉴定的3株猪流行性腹泻病毒(PEDV)的S基因进行克隆及序列分析,对丰富我国PEDV的遗传衍化特征具有重要意义。S基因序列分析发现,JX18毒株与CV777亲缘关系较近,核苷酸同源性为99.71%,氨基酸同源性95.7%,属于G1-b进化分支。JX18毒株与CV777经典毒株S蛋白氨基酸序列相比较,不存在氨基酸的插入或缺失,在中和表位区及已鉴定抗原表位区仅有一处氨基酸突变。SD18、JingTai18与PEDVCV777亲缘关系较远,核苷酸同源性分别为93.64%和92.64%,S蛋白氨基酸序列同源性分别为93%和93.5%。SD18和JingTai18位于G2-b进化分支。SD18与JingTai18株与CV777经典毒株相比,S蛋白氨基酸序列中存在插入缺失及多位点的氨基酸突变。研究结果为进一步了解我国PEDV流行及变异情况提供了数据支持。

关键词：
S基因
猪流行性腹泻病毒
生物信息学分析
病毒学
遗传变异
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猪流行性腹泻病毒是冠状病毒科冠状病毒属的成员,主要引起患病猪的肠道绒毛萎缩,脱水和腹泻等症状[1]。通常PEDV被认为是食源性和水源性病原体,主要通过粪-口途径传播,近年来发现,PEDV也可以通过气溶胶传播[2]。1980年中国首次分离到PEDV,但并未引起较大经济损失,自2010年末,中国养猪场出现了对仔猪具有较高毒力的PEDV变异株,1周龄以下仔猪感染后的病死率高达100%[3],并迅速蔓延至国内大部分猪场,给我国养猪业造成了严重的经济损失[4]。

PEDV是有囊膜的单股正链RNA病毒,基因组大小约28kb,包含5'非翻译区(UTR),3'UTR,至少含有7个开放阅读框(ORFs),编码纤突(S)、囊膜(E)、膜(M)和核衣壳(N)4种结构蛋白和3种非结构蛋白,分别为复制酶1a、1ab和ORF3,它们以5'UTR-ORF1a/1b-S-ORF3-EMN-3'UTR的顺序排列。2个长的ORF区ORF1a和ORF1b,占据基因组的2/3,2个非结构蛋白pp1a和pp1b,负责基因组的复制、转录和病毒的蛋白加工[5]。PEDV基因组遗传衍化分析发现,S基因为高变区,其变异在一定程度上代表了整个基因组的变异特征,并且冠状病毒属的S蛋白发生变异会导致其宿主范围、组织细胞培养及毒力发生改变,不同来源分离株的S蛋白之间存在氨基酸插入、突变等现象,进而改变病毒原始抗原特性[6]。因此,对PEDVS基因进行遗传变异分析,对于PEDV的研究及防控具有重要意义。

目前疫苗接种是预防PED的主要手段,然而免疫接种经典毒株疫苗的猪场也常有发病。通过对2010年以来PEDV流行毒株分子流行病学调查发现,流行毒株较经典毒株毒力基因已发生了较大改变。由此推测是造成经典毒株CV777病毒对猪场保护力不足及免疫失败的主要原因。因此,选择当前流行毒株制备疫苗是防控PEDV的关键。

本研究旨在对实验室从临床分离鉴定的3株PEDV进行S基因进行克隆,运用DNAMan和MEGA7.0软件对克隆到的S基因核苷酸序列及蛋白氨基酸序列进行序列分析,以了解这些毒株的S基因遗传变异特点,丰富我国PEDV毒株信息,以期为PEDV的疫苗研发及防控提供参考。

1、材料与方法

1.1材料

1.1.1试剂

Trizol试剂,Invitrogen公司产品;一步法cDNA反转录试剂盒,北京TIANGEN公司产品;DNAMarkerDL2000,EXTaq酶,pMD19-T载体,TaKaRa公司产品;质粒提取试剂盒,南京诺维赞公司产品;琼脂糖,Invitorogen公司产品;其他试剂均为国产分析纯。

1.1.2毒株

PEDVJX18、SD18和JingTai18分离株,均为中国农业科学院兰州兽医研究所猪禽消化道感染与黏膜免疫团队分别从江西省、山东省和甘肃省景泰市某规模化养猪场送检材料中分离并鉴定。

1.1.3仪器设备

移液器、离心机,德国Eppendorf公司产品;核酸电泳仪、凝胶成像系统,美国Bio-Rad公司产品;梯度PCR仪(TP350),日本TaKaRa公司产品。

1.2方法

1.2.1引物设计

采用Oligo7引物设计软件设计扩增S基因的引物,序列信息见表1,由西安擎科生物技术有限公司合成。

表1PCR引物信息

1.2.2S基因扩增

吸取200μL病毒培养液,用Trizol法提取RNA,根据试剂盒说明进行反转录操作。将得到的cDNA进行PCR扩增。反应体系如下:模板5μL,上游引物1μL,下游引物1μL,EXTaq酶25μL,H2O18μL。反应条件:95℃3min;95℃30s,56℃30s,72℃2min30s,共30个循环;72℃5min。反应结束后吸取50μL进行20g/L琼脂糖凝胶电泳。对目的基因进行胶回收,并连接到pMD-19T载体上,1μLpMD-19T载体,4μL回收产物,5μLSolutionⅠ。进行16℃过夜连接,并将连接产物转化至DH5α感受态细胞中,挑取单克隆,进行PCR鉴定。鉴定成功后交由西安擎科公司进行测序。

1.2.3PEDVS基因蛋白质序列分析

将测序得到的序列用SeqMan软件进行拼接,运用EditSeq软件将核苷酸序列翻译成蛋白质序列,并与PEDV经典毒株CV777进行比对分析,并对中和表位区及已经鉴定的抗原表位区进行比较,总结它们之间的差异。与国内外流行的PEDV毒株进行比较,运用Mega.7.0软件建立遗传进化树。

2、结果

2.1PEDVS基因RT-PCR结果

对病毒液进行提取RNA并反转录,扩增S1及S2基因片段。结果显示,使用S1和S2引物对JX18、SD18和JingTai18毒株进行RT-PCR,均扩增出2000bp左右的目的条带(图1)。

图1JX18、SD18及JingTai18毒株S1基因及S2基因RT-PCR扩增结果

2.2PEDVS基因序列及蛋白质序列分析

利用Seq-Man软件将测序得到的片段进行拼接,得到JX18、SD18和JingTai18毒株S基因序列,分别命名为JX-18Sgene、SD18Sgene、JingTai18Sgene。运用Editseq软件对得到的3个毒株S基因进行蛋白质序列推导,分别命名为JX-18Sprotein、SD18Sprotein、JingTai18Sprotein。运用MegAlign软件进行同源性分析,得到3个毒株与PEDV经典毒株CV777S基因核苷酸序列及蛋白质序列的同源性比对结果(图2)。

运用MegAlign软件,将JX18、SD18及JingTai18毒株的S蛋白氨基酸序列与经典毒株CV777蛋白质序列进行比对,发现JX18与CV777相比,无氨基酸的插入,而SD18及JingTai18在59位存在4个氨基酸(QGVN)的插入,在160缺失1个氨基酸(G)。

将推导的3个毒株S蛋白氨基酸序列的中和表位区与经典毒株CV777S蛋白氨基酸序列中和表位区(499-638位)[7]进行比较,以及在孙东波等[8]预测的5个S蛋白线性表位区即S1P1(248-280位)、S1P2(第442-499位)、S1P3(697-742位)、SS5(748-755位)和SS6(764-771位)分别进行比较,分析它们之间氨基酸差异情况。

图2JX18、SD18及JingTai18与CV777经典毒株S基因核苷酸序列及蛋白氨基酸序列同源性比较

A.核苷酸;B.蛋白质

推导的JX18株S蛋白氨基酸序列与经典CV777株S蛋白氨基酸序列相比,在中和表位区(499-638位)仅有1个氨基酸突变,为454位I→V。在孙东波等预测的5个S蛋白线性表位区即S1P1(248-280位)、S1P2(第442-499位)、S1P3位(697-742位)、SS5(748-755位)和SS6(764-771位)均没有突变。

推导的SD18株S蛋白氨基酸序列与经典CV777毒株比较显示,在中和表位区(499-638位)共存在8处突变,在已鉴定的抗原表位区中存在6处突变。推导的JingTai18株S蛋白氨基酸序列与经典CV777毒株比较显示,在中和表位区存在5处突变,在已鉴定的抗原表位区中存在5处突变(表2)。

2.3PEDVS蛋白遗传进化分析

主要选择经典毒株CV777以及其他国家(地区)的疫苗毒株及流行毒株,中国境内近年来分离到的部分毒株S蛋白氨基酸序列与本试验克隆得到的JX18Sgene、SD18Sgene及JingTai18Sgene推导的蛋白氨基酸序列进行比对,并用MEGA7.0软件,采用N-J法进行遗传进化树的构建(图3)。利用筛选得到的60株PEDV代表毒株的S蛋白氨基酸序列构建遗传进化树,可见进化树分为G1亚群(G1-a,b)、G2亚群(G2-a,b)及Indel-likestrains亚群,遗传进化分析发现,JX18毒株与韩国的经典毒株致弱株DR13attenuated亲缘关系较近,属于G1-b亚群。而SD18毒株与2011年中国分离株HBXY1亲缘关系较近。JingTai18毒株则与2011年中国分离株AJ1102亲缘关系较近。SD18和JingTai18毒株在亲缘关系上较远,但同属G2-b分支。

表2SD18和JingTai18株与CV777株S蛋白中和表位区以及已鉴定抗原表位区氨基酸突变情况

3、讨论

猪流行性腹泻的暴发给全球养猪业造成了严重的影响。中国于1984年首次分离到PEDV,经典的PEDVCV777毒株被制成灭活疫苗,PED得到了较好的控制,该病并未对养猪业造成较大经济损失[9]。但2010年以来,中国多省份暴发PED,即使接种过PEDVCV777灭活疫苗的猪场也在所难免,这与PEDV的变异有很大关系[3]。因此,分析PEDV的遗传变异情况对PEDV的防控具有重要意义。PEDVS蛋白被认为是关键的毒力蛋白,PEDV变异主要集中在S蛋白上,其遗传变异往往造成毒株毒力的改变[10]。本研究对临床分离得到的3株PEDV毒株进行了S基因的克隆,并推导其氨基酸序列,发现JX18S基因与CV777S基因的同源性最高,为99.7%,氨基酸序列之间的同源性为99.3%。SD18和JingTai18核苷酸序列的同源性分别为93.64%和92.64%,蛋白质氨基酸序列同源性分别为93%和93.5%。基于S蛋白N末端结构域氨基酸的差异,可将PEDV分为G1组及G2组。遗传进化分析,JX18为G1-b分支,提示可能为细胞培养适应疫苗株。而SD18和JingTai18位于G2-b分支,表明SD18与JingTai18为变异毒株,提示为当前PEDV的流行毒株。

图3PEDVS蛋白氨基酸遗传进化分析

中和表位是主要诱发机体产生中和抗体及体液免疫和细胞免疫的部位,该部位的突变常引起病毒对细胞的吸附能力增强以及免疫失败[11]。本实验室分离鉴定的SD18以及JingTai18毒株,在已鉴定的抗原表位SS6(764-766位)均有突变,国内近年来分离的毒株在此表位SS6有2个～3个氨基酸突变(L→S或D→S),该位点的突变改变了S蛋白的空间结构,从而改变了S蛋白的性质。2010年以来,国内分离株中常有中和表位区548位T→S,593位D→S,548和593位为S蛋白的中和表位区,这些位置的突变与免疫失败有关。目前,我国的猪流行性腹泻防控难度加大,接种PEDV弱毒疫苗与灭活苗的猪场也有发病。我国当前PEDV流行株主要为G2基因亚群的PEDV变异株,其与CV777S基因相比发生了很大程度的变异[9]。有研究报道对流行毒株与疫苗株S基因高变区(含中和表位区)分别进行原核表达并进行免疫反应性分析,结果表明,表达的流行毒株与疫苗毒株S蛋白存在较大的免疫反应性差异,运用间接ELISA测得鼠抗PED疫苗毒株血清与疫苗毒株S蛋白反应值明显高于与流行毒株S蛋白反应值。与此相反,鼠抗PEDV流行毒株S蛋白血清与流行毒株S蛋白反应值明显高于与疫苗毒株S蛋白反应值,从而解释了中和表位处S基因的变异导致S蛋白氨基酸序列发生改变,从而导致疫苗毒株产生的中和抗体不能识别流行毒株,是导致免疫失败的主要原因[12]。另有研究结果表明,利用流行毒株YC2014制备的灭活疫苗进行了免疫保护试验,免疫后,血清及乳汁中均产生了高滴度的中和抗体,而免疫了经典毒株制备的灭活疫苗组则不能抵抗该流行毒株的攻击[13]。由此可见,选择当前流行毒株制备PEDV疫苗是防控PED的关键。本次试验,SD18毒株及JingTai18毒株在中和表位区以及已鉴定的抗原表位处与经典毒株CV777存在多处氨基酸突变,并且遗传进化分析表明,这2个毒株同属G2-b亚群。试验结果为下一步研制PEDV流行毒株疫苗奠定了基础,为了解我国PEDV毒株流行变异情况及PED的防控提供了理论支持。