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探讨DuCV的分子特点及检测方法

2020-07-10 425 上传者：管理员

摘要：本试验旨在了解江西部分地区鸭圆环病毒(DuCV)的流行情况及其优势流行基因型。通过采集病死鸭的组织样品并提取组织DNA,利用PCR对鸭圆环病毒进行检测,并对部分阳性PCR产物进行测序,用BLAST、MEGA10和DNAstar分析序列相似性,绘制系统进化树。结果,8个养鸭场中有5个鸭场检出鸭圆环病毒;42份组织样品中有18份为鸭圆环病毒阳性,阳性率为42.9%;PCR产物序列测定及BLAST分析显示均为鸭圆环病毒的基因片段,与GenBank上登录的相应序列相似性均在95%以上;序列进化分析表明,所测5条鸭圆环病毒序列均属于DuCV-1型,其中有3条序列属于DuCV-1a亚型,2条序列属于DuCV-1b亚型;5条所测序列的核苷酸相似性均在97%以上,且与其他DuCV-1型序列相似性均在95%以上,与DuCV-2型相应序列相似性均在80%～90%之间。结果表明,江西部分地区鸭圆环病毒的流行较为严重,且优势基因型为1型。本研究对了解江西地区鸭圆环病毒病的流行及开展该病的防控提供了一定的理论依据。

关键词：
DuCV
分子特点
检测
病毒学
鸭圆环
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鸭作为主要家禽之一,是我国传统和特色养殖业的重要组成部分。随着国内外市场需求旺盛,鸭养殖量和规模不断增加,引种和交易频繁,从业人员素质参差不齐,使疫病带来的经济损失风险也愈加明显。如何科学防控疫病、降低风险是目前养鸭业面临的重要问题。

圆环病毒病是一种危害巨大的免疫抑制疾病,可感染多种动物,主要导致动物机体免疫系统损失,并引起严重的继发感染,给养殖业造成了严重的经济损失[1]。圆环病毒是无囊膜的单股DNA病毒。鸭圆环病毒由德国学者HATTERMANN等[2]在2003年首次报道,是目前已知感染鸭最小的病毒,目前仍无人工培养成功的报道。基因组与分子遗传学研究表明,DuCV可分为2个基因型:DuCV-1、DuCV-2,核苷酸序列相似性低于92%,编码氨基酸相似性低于73%,其致病力差异明显,DuCV-1是国内主要的致病基因型[3,4,5]。鸭圆环病毒病是由DuCV引起鸭的一种慢性消耗性和免疫抑制性传染病,主要表现为鸭体生长不良、鸭体器官萎缩以及继发严重的细菌感染,给鸭场造成严重经济损失[6]。国内外多次报道此病,也进行了大量的研究,但DuCV致病机制仍不清楚,也无商品化的疫苗,因此了解该病的流行情况、病毒的分子特点等,对科学防控该病有着重要的实际意义。

江西省是国内重要的养鸭区域之一,是省内部分地区重要的产业,老病未除、新病不断发生,给养鸭业造成极大的损失。关于黄病毒病、鸭腺病毒感染等报道较多,但对DuCV的流行情况和分子特点报道较少。本试验对江西省养鸭集中的部分地区的8个规模化养鸭场病死鸭的DuCV分子流行情况进行初步调查,并对核苷酸序列进行系统进化树及相似性分析,初步了解DuCV的分子流行情况和毒株基因型,丰富了江西地区DCVD流行病学资料,对江西地区鸭圆环病毒病等鸭病防控具有一定的参考意义。

1、材料与方法

1.1材料

1.1.1病料

江西省3个地区(抚州、九江、宜春)内8个养殖规模较大的鸭场的病死鸭,无菌采集肝脏、肺脏和法氏囊共42份,-80℃保存。

1.1.2试剂

病毒基因组DNA抽提试剂盒(上海生工生物工程有限公司);DNA2000Maker(全式金生物科技有限公司);2×FastTaqPreMix(tolobio)。

1.1.3引物合成

根据GenBank上登录的DuCV全基因组序列和文献[7]进行设计:DuCV-F:5′-TTACRGGCGMTTGTMCTC-3′,DuCV-R:5′-TAMTTGRTTTCMGCGGXA-3′,扩增片段大小605bp,由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2方法

1.2.1组织DNA提取

参照病毒基因组DNA抽提试剂盒说明书进行操作。

1.2.2PCR

以提取的病毒DNA为模板,PCR反应体系为25μL:2×FastTaqPreMix12.5μL,上下游引物各0.5μL,ddH2O10.5μL;PCR反应程序为:95℃预变性5min,94℃变性40s,54℃退火40s,72℃延伸25s,35个循环;最后72℃8min。PCR产物经1%琼脂凝胶电泳检测。

1.2.3序列测定

5个阳性检出鸭场各选择1份阳性PCR产物送上海生工生物工程有限公司进行序列测定。

1.2.4序列分析及进化树绘制

在线BLSAT比对分析所测序列,利用MEGA10和DNAstar软件分析所测序列与已发表DUCV相应序列的相似性,并绘制系统进化树。参考的序列信息见下表(表1)。

表1文章所用序列信息表

2、结果

2.1DuCV的PCR检测

将提取的病毒DNA进行PCR,扩增产物经1%琼脂凝胶电泳。结果,部分样品在约600bp处有明显的条带,与预期大小基本一致(图1)。8家规模化鸭场,5个场有阳性样品检出;采集的42份样品,18份为阳性样品,阳性率为42.9%(表2)。

图1部分样品DuCV的PCR检测结果

2.2序列测定与分析

送检5份样品进行序列测定。结果,序列长度均为605bp(分别命名为:JX-DuCV1,JX-DuCV2,JX-DuCV3,JX-DuCV4,JX-DuCV5),BLAST比对分析,所测序列与GenBank上登录的DuCV-1相应序列的相似性均在95%以上,而与DuCV-2相应序列的相似性均在85%～89%之间。

2.3相似性及系统进化分析

系统进化树结果显示,5株DuCV均属于DuCV-1型,其中JX-DuCV2、JX-DuCV4与DuCV1b亚型位于同一进化分支,JX-DuCV1、JX-DuCV3和JX-DuCV5与DuCV1a亚型位于同一进化分支(图2)。

图2DuCV部分序列系统进化树分析

核苷酸相似性分析,5株DuCV基因片段核苷酸序列之间的相似性均在97%以上,且与参考的DuCV-1型相应核苷酸序列相似性均在95%以上,与参考的DuCV-2型核苷酸序列相似性均低于90%,见图3。

图3DuCV部分核苷酸相似性分析

将所测的序列与GenBank中登录的DuCV-1型和DuCV-2型相应序列进行比对分析。结果,DuCV-1型和2型间有多个核苷酸位点不一致;所测序列中JX-DuCV4的25位核苷酸和38位核苷酸与DuCV-2型一致,43位与DuCV-2型均缺失1个核苷酸A,其他位点均与DuCV-1型的位点一致;其他所测的4条序列均与DuCV-1型的位点变异一致(表3)。

表3所测DuCV序列片段、DuCV-1型、DuCV-2型相应序列的突变位点分析

3、讨论

2003年HATTERMANN等[2]首次报道鸭圆环病毒病及DuCV,2006年CHEN等在中国台湾检测到该病毒[8],随后在山东、广西、浙江、广东等省也陆续报道了该病[9,10,11,12]。DuCV可感染各种日龄及各种品种的鸭,感染后可导致免疫抑制,鸭群单独感染DuCV后死亡率不高[13],但易引起细菌和病毒性疾病的继发感染而导致死亡率升高。粟裕琼等[14]对DuCV阳性样品进行多种疾病的检测,发现DUCV单独感染仅占18.42%,多重感染占81.58%。DuCV对养鸭业危害较大,且常以隐性感染存在,容易被忽视,造成严重损失,因此,在生产过程中需对DuCV加强关注。

DuCV是一种新发现的病毒,其研究还不深入,目前没有合适的体外培养体系;其诊断方法包括血清学检测方法及病原学检测方法,其中PCR具有较强的敏感性、易操作,且成本较低,适合分子流行病学调查。本试验中,通过对江西省8个规模化鸭场的病死鸭样品进行DuCV的PCR检测,结果,42份样品中有18份阳性样品检出,总阳性率为42.9%,且8个养殖场中有5个鸭场有阳性样品检出,表明江西省规模养鸭场的圆环病毒阳性场比率较高,且病死鸭中的检出率达到42.9%,应引起养鸭场的足够重视。孙文超[15]对云南及广西鸭圆环病毒检测阳性率为5%;屈素洁等[16]对广西3个市DuCV检测阳性率为18%。本试验结果表明,江西地区DuCV阳性率要高于其他省份的研究报道,说明DuCV在江西地区流行较为广泛。

根据核苷酸序列差异,可将DuCV分为DuCV-1型和DuCV-2型,DuCV-1型又可分为1a、1b和1c3个亚型[17];DuCV-1型和DuCV-2型在多个核苷酸位点存在差异。本课题组前期对DuCV-1型和DuCV-2型的全基因组进行比对分析发现,在DuCV基因组的5′端非编码区和相邻的部分ORF1片段(605bp),变异性较大,用该片段构建系统进化树与用全基因组构建的进化分析树基本一致,故本试验选择该片段进行DuCV的检测靶标和分析。

本试验对5家阳性场各随机选择1份阳性PCR产物进行测序,并将测序结果构建基因系统进化树及核苷酸相似性分析。5株DuCV均为DuCV-1型,JX-DuCV2与JX-DuCV4属于1b亚型,JX-DuCV1、JX-DuCV3和JX-DuCV5属于1a亚型;核苷酸序列相似性分析显示,5株DuCV相似性均在97%以上,与DuCV-2型相似性均在90%以下。结果表明,江西省内鸭场DuCV以DuCV-1型流行为主,且分为2个亚型,与国内其他研究报道有一定差异。李志国[18]、王鑫[19]均检测出了明显的DuCV-1与DuCV-2共感染,这可能与采样数量及地区差异有关。

本试验在剖检病死鸭过程中,发现部分鸭存在明显的细菌继发感染,导致用药效果不佳,表明DuCV可能是某些细菌感染或病毒性疾病暴发的诱因。因目前尚无预防鸭圆环病毒病的疫苗,且流行程度较高,所以在养鸭过程中必须加强对DuCV的重视度,加强种鸭、种蛋、孵化、养殖等过程中的饲养管理及对各种疾病的科学防控,避免DuCV感染导致其他疾病暴发,减少经济损失。

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基金:江西省科技支撑计划项目(2012BBF60031);江西省现代农业产业技术体系建设专项资金(JXARS-03).