范围内常见的慢性疾病，且发病率逐年增高。白内障是糖尿病的一种常见眼部并发症，而且糖尿病患者发生白内障的年龄更早、进展更快、预后更差。糖尿病患者是白内障手术的高危人群[1],因此对糖尿病性白内障的机制研究至关重要。糖尿病性白内障的发病机制复杂，目前有渗透压反应[2]、氧化应激[3]、蛋白质非酶糖基化[4]等多种学说。其中蛋白质非酶糖基化学说被大家广泛研究。近年来研究开始关注酶促糖基化，O-连接N-乙酰氨基葡萄糖(O-linked N-acetylglucosamine, O-GlcNAc)修饰是酶促糖基化的其中一种形式，其动态修饰过程由两种酶介导，O-GlcNAc糖基转移酶(OGT)负责催化添加GlcNAc基团，使目标蛋白发生O-GlcNAc修饰，O-GlcNAc糖苷酶(OGA)负责将O-糖苷键水解，去除GlcNAc基团，使O-GlcNAc糖蛋白发生去糖基化反应[5]。细胞内多种蛋白均可发生O-GlcNAc修饰[6],O-GlcNAc糖基化修饰参与细胞信号传导等多种重要生命过程，且O-GlcNAc蛋白分布广泛[7],因此异常的O-GlcNAc糖基化修饰会影响多种疾病的发生发展，O-GlcNAc糖基化异常已证明与糖尿病[8]、神经退行性疾病[9-11]和癌症[12]等重大疾病密切相关。有研究[13]发现小鼠晶状体蛋白O-GlcNAc糖基化修饰增加与白内障有关，但O-GlcNAc糖基化修饰是否参与人糖尿病性白内障的发生及其可能的作用机制目前尚不完全清楚。本研究比较年龄相关性白内障和糖尿病性白内障患者晶状体前囊膜中O-GlcNAc蛋白表达水平，初步探讨了O-GlcNAc蛋白表达变化与糖尿病性白内障的相关性，为揭示糖尿病性白内障患者发病的分子机制提供理论依据。

1、材料和方法

1.1材料

选取2022-01/2023-12期间哈尔滨医科大学附属第一医院眼科医院收治的白内障患者169例176眼，收集其临床资料及晶状体前囊膜。其中糖尿病性白内障患者54例56眼，年龄相关性白内障患者115例120眼。所有患者均进行白内障超声乳化吸除术联合人工晶状体植入术，术中连续环形撕囊得到晶状体前囊膜组织，大小约5-6 mm, 立即置入EP管中，-20 ℃保存待用。本研究经哈尔滨医科大学附属第一医院伦理委员会批准，遵循伦理学原则，所有患者均签署知情同意书。

1.1.1纳入标准

糖尿病性白内障组：(1)裂隙灯下观察到晶状体明显混浊；(2)最佳矫正视力低于0.5;(3)内科确诊为2型糖尿病并且糖化血红蛋白≥6.0%;(4)年龄为50-90岁。

年龄相关性白内障组：(1)无糖尿病史，并且糖化血红蛋白<6.0%;(2)裂隙灯下观察到晶状体明显混浊；(3)最佳矫正视力低于0.5;(4)年龄为50-90岁。

1.1.2排除标准

(1)青光眼、视网膜脱离、葡萄膜炎、眼外伤等眼部病变及其他内眼手术史。(2)甲状腺功能亢进、心脏病、传染病等全身疾病。(3)其他类型白内障如外伤性、葡萄膜炎性、青光眼性、糖皮质激素性、中毒性、辐射性等。

1.2方法

1.2.1临床资料采集

记录白内障患者的年龄、性别、糖尿病病史、全身及眼部病史等。检测血糖及糖化血红蛋白水平、视力、眼压、眼部B超、眼底检查、人工晶状体设计等临床指标。

1.2.2标本分组

糖尿病性白内障为DC(diabetic cataract, DC)组，同时根据糖化血红蛋白水平分为DC1组17例18眼(6.0%≤糖化血红蛋白<7.0%)、DC2组16例17眼(7.0%≤糖化血红蛋白<8.0%)、DC3组21例21眼(8.0%≤糖化血红蛋白<10.0%)。年龄相关性白内障为ARC(age-related cataract, ARC)组，糖化血红蛋白均<6.0%。

1.2.3免疫印迹分析

晶状体前囊膜经组织裂解液裂解后提取蛋白，测定蛋白浓度后制样。分别取100 μg蛋白样本进行免疫印迹检测。电泳1.5 h, 再经电转将样品转移至硝酸-纤维素膜上室温晾干。5%脱脂牛奶封闭2 h后一抗(Anti-O-GlcNAc(RL2) antibody)4 ℃孵育过夜。TBST漂洗3次加入二抗(goat anti-mouse IgG(H+L)-HRP)室温孵育2 h。最后以ECL化学发光剂(THEMO公司)孵育1 min。Strip后室温孵育内参蛋白(GAPDH)2 h后再次曝光、显影、定影。免疫印迹结果采用Image J软件进行密度灰度值定量分析。

1.2.4 O-GlcNAc蛋白的富集及质谱分析

各组分别取100 μg蛋白样本，加入PBS至总体积400 μL,进行蛋白富集。O-GlcNAc蛋白的富集采用O-GlcNAc蛋白富集试剂盒(天津莱森生物科技有限公司)并根据说明书完成，富集后的蛋白经凝胶电泳纯化后切胶送北京大学分析测试中心进行蛋白及O-GlcNAc修饰位点质谱鉴定，以Coverage相差1.5倍以上为有差异。

统计学分析：采用统计软件SPSS28.0.1.1处理数据，采用单因素方差分析比较组间差异，组间的进一步两两比较采用LSD-t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1 O-GlcNAc蛋白在糖尿病性白内障组晶状体前囊膜中表达增加

采用免疫印迹的方法检测年龄相关性白内障及不同糖化血红蛋白水平的糖尿病性白内障晶状体前囊膜中O-GlcNAc蛋白表达相对强度，即O-GlcNAc蛋白条带灰度值与GAPDH条带灰度值之比，结果显示：糖尿病性白内障晶状体前囊膜中O-GlcNAc蛋白的表达明显高于年龄相关性白内障组，差异有统计学意义(均P<0.01,表1,图1),揭示O-GlcNAc蛋白水平可能与糖尿病性白内障发生发展有关。

糖尿病性白内障DC3组O-GlcNAc蛋白水平高于DC2组和DC1组，差异有统计学意义(均P<0.01),此结果提示O-GlcNAc蛋白水平可能与血糖增高有关。DC2组O-GlcNAc蛋白水平高于DC1组，但是差异无统计学意义(P=0.182)(图1)。

2.2各组白内障患者晶状体前囊膜中差异蛋白分析

比较糖尿病性白内障组与年龄相关性白内障组晶状体前囊膜蛋白的质谱结果，发现差异表达的O-GlcNAc蛋白23种，其中5种蛋白在糖尿病性白内障组中表达上调：脂肪酸结合蛋白5(fatty acid-binding protein 5,FABP5)、角蛋白16(keratin, type I cytoskeletal 16,KRT16)、磷酸甘油激酶1(phosphoglycerate kinase 1,PGK1)、组织蛋白酶D(cathepsin D,CTSD)、钙结合蛋白S100A7(protein S100-A7,S100A7)(表2),18种蛋白表达下调：CRYβB1等(表3)。

2.3糖尿病性白内障晶状体前囊膜中新发现的O-GlcNAc蛋白及糖基化修饰位点

通过质谱分析及比对O-GlcNAc蛋白质库，在糖尿病性白内障晶状体前囊膜中发现了3个新的O-GlcNAc糖基化修饰位点，一个是蛋白酪氨酸磷酸酶受体Q型(protein tyrosine phosphatase receptor type Q,PTPRQ)T1730和S1738位的O-GlcNAc糖基化；一个是蛋白质ATP合酶C亚基位点2(ATP synthase membrane subunit c locus 2,ATP5MC2)T61位的O-GlcNAc糖基化(表4)。

表1 各组O-GlcNAc蛋白表达相对强度

图1 年龄相关性白内障和糖尿病性白内障晶状体前囊膜中O-GlcNAc蛋白的表达

表2 糖尿病性白内障组中表达上调的O-GlcNAc蛋白质列表

表3 糖尿病性白内障组中表达下调的O-GlcNAc蛋白质列表

表4 糖尿病性白内障组中发现的3个新O-GlcNAc糖基化位点

3、讨论

目前糖尿病性白内障发病的分子生物学机制至今仍不明确，以往研究发现糖基化与白内障发生发展有关。糖基化是糖基供体与糖基受体的羟基或其他官能团相连，以形成糖共轭物的反应，根据反应的类型可分为酶促糖基化和非酶糖基化。目前研究大多集中于糖基化终末产物在糖尿病性白内障发病中的作用，研究发现糖尿病白内障患者晶状体中糖基化终末产物水平远高于非糖尿病患者[14];糖基化的αB晶状体蛋白交联程度增高，分子伴侣功能减弱，蛋白质异常聚集从而导致晶状体混浊[15];晶状体上皮细胞中糖基化蛋白的过度表达使囊膜破裂后通透性增加，促进白内障的进展[16]。然而对于酶促糖基化在糖尿病性白内障中的研究目前国内外报道较少。本研究聚焦于酶促糖基化中的O-GlcNAc糖基化修饰在糖尿病性和年龄相关性白内障晶状体前囊膜中的表达变化，探讨O-GlcNAc修饰在糖尿病性白内障的作用。在International Journal of Ophthalmology杂志既往发表的研究[17]发现下调小鼠体内NF-κB的O-GlcNAc糖基化修饰可以防止糖尿病诱导的视神经节细胞凋亡，该实验在小鼠体内研究NF-κB的O-GlcNAc糖基化修饰对糖尿病视网膜病变小鼠视神经节细胞的作用。本研究通过比较糖尿病性和年龄相关性白内障患者晶状体前囊膜中O-GlcNAc糖蛋白的表达水平，探讨O-GlcNAc蛋白表达变化与糖尿病性白内障的相关性。

本研究结果表明糖尿病性白内障组晶状体前囊膜中O-GlcNAc蛋白表达水平明显高于年龄相关性白内障组，差异有统计学意义(均P<0.01),揭示了O-GlcNAc修饰可能参与了糖尿病性白内障的形成。

糖化血红蛋白是衡量血糖控制水平的重要指标，通常可以反映患者近8-12 wk的血糖控制情况。糖化血红蛋白4.0%-6.0%代表血糖控制正常；6.0%-7.0%代表血糖控制比较理想；7.0%-8.0%血糖控制一般；糖化血红蛋白>8.0%,表示血糖控制不理想。我们的实验结果发现糖尿病性白内障DC3组(8.0%≤糖化血红蛋白<10.0%)的O-GlcNAc蛋白水平明显高于DC2组(7.0%≤糖化血红蛋白<8.0%)和DC1组(6.0%≤糖化血红蛋白<7.0%),即血糖控制不理想的糖尿病性白内障晶状体前囊膜中O-GlcNAc蛋白水平最高，揭示O-GlcNAc修饰可能与血糖控制水平和糖尿病严重程度有关。

O-GlcNAc修饰是一种蛋白质翻译后修饰，在真核细胞中广泛存在，参与细胞多个重要生命过程。晶状体蛋白的翻译后修饰、异常聚集以及蛋白质降解失调，引起晶状体蛋白结构的改变，可能是白内障形成的直接原因。晶状体内蛋白质的降解主要由蛋白酶体完成，自噬蛋白酶体途径在晶状体上皮细胞分化为晶状体纤维细胞的过程中负责细胞核和细胞器的降解，最终形成无细胞器区。该途径在去除受损细胞器和错误折叠的蛋白质的过程中也至关重要，这些细胞器和错误折叠的蛋白质被自噬体吞噬，然后被蛋白酶体降解[18]。如果这些大分子不能被溶酶体消化，则会导致白内障的发生。有研究发现O-GlcNAc修饰可抑制蛋白酶体的功能[19],这表明O-GlcNAc修饰可能通过抑制蛋白酶体的功能从而促进糖尿病性白内障的发生发展。这与本研究结果相一致，从一定程度上解释了糖尿病患者白内障发生发展的原因。

目前关于晶状体前囊膜中O-GlcNAc蛋白质谱鉴定的研究较少，我们采用CpOGA法富集晶状体囊膜中的O-GlcNAc蛋白后通过质谱鉴定，在年龄相关性白内障组中共鉴定出105个蛋白质(其中O-GlcNAc蛋白89种),在糖尿病性白内障组中共鉴定出118个蛋白质(其中O-GlcNAc蛋白96种),coverage相差1.5倍以上的为差异蛋白，共鉴定出23种差异表达的O-GlcNAc蛋白，其中5种O-GlcNAc蛋白表达上调：FABP5、KRT16、PGK1、CTSD、S100A7。

FABP5是一种在大多数哺乳动物中表达的低分子量细胞质蛋白，分子量约为15 kDa, 主要参与细胞质内脂肪酸的摄取、转运和代谢。FABP5在晶状体、肝、视网膜、心脏等多种组织和器官均有表达[20],在多种疾病中起着关键作用，如糖尿病[21]、动脉粥样硬化[22]、癌症[23-24]等。有研究表明FABP5可能通过调节视网膜循环参与了视网膜血管疾病的发病机制[25]。目前对于FABP5在白内障中的作用尚罕见报道，本实验发现FABP5在糖尿病性白内障晶状体前囊膜中表达上调，为糖尿病性白内障发病机制研究提供了一个新的思路。

角蛋白是脊椎动物上皮细胞中的主要结构蛋白，对维持上皮细胞的结构完整性至关重要。角蛋白是识别肿瘤细胞和癌细胞的常用标志物，一些研究表明角蛋白与肿瘤发生和转移有关[26-27]。与其他角蛋白相比，对KRT16的研究目前尚且不足。角蛋白16由KRT16基因编码，可在多种上皮组织中正常表达，对维持表皮屏障功能十分重要。在表皮损伤的早期阶段，伤口附近的角质形成细胞被激活，迁移到伤口重建屏障功能。而KRT16可以参与角质形成细胞迁移和上皮细胞增殖[28]。有研究发现通过下调KRT16可以促进真菌性角膜炎的角膜上皮修复[29]。本实验研究发现糖尿病性白内障血糖控制良好组和血糖控制不良组晶状体前囊膜细胞中KRT16表达均上调，这提示KRT16可能与晶状体前囊膜细胞损伤增殖相关，从而导致白内障的形成。

PGK1是糖酵解中第一个产生ATP的酶，在许多人类癌症中过表达，并受多种机制调节。其活性由不同的翻译后修饰介导，当T255发生O-GlcNAc糖基化激活其酶活性，同时诱导PGK1易位到线粒体中，随后磷酸化依赖性抑制丙酮酸代谢和氧化磷酸化，促进细胞增殖和肿瘤发生，研究发现阻断PGK1T255的O-GlcNAc糖基化可以减少结肠癌细胞增殖，抑制糖酵解[30]。PGK1被乙酰化后其酶活性增强，促进肝癌的发展[31]。PGK1被磷酸化后可以促进其线粒体易位并调节线粒体丙酮酸的利用[32]。我们的研究鉴定出PGK1在糖尿病性白内障血糖控制不良组中表达增多，提示PGK1可能参与糖尿病性白内障的发生发展。

本研究通过质谱法在年龄相关性白内障和糖尿病性白内障晶状体前囊膜中鉴定出差异表达O-GlcNAc蛋白23种，除了以上5种表达上调的蛋白，还有18种表达下调的蛋白，其中的βB1晶状体蛋白与白内障有关，其余17种表达下调的蛋白与白内障的相关性尚未发现相关研究报道。

βB1晶状体蛋白由CRYβB1基因编码，是晶状体主要的结构蛋白，在维持晶状体结构和透明性中有重要作用，他们通过特定的范德华反应、氢键和离子键在晶状体中形成更稳定的蛋白质复合物[33],因此βB1晶状体蛋白下调可能会导致蛋白复合物不稳定从而引起白内障的发生，我们的研究结果显示糖尿病组中βB1晶状体蛋白下调，这与以往的研究结果相符。

本研究还在糖尿病性白内障晶状体前囊膜中鉴定出3个新的O-GlcNAc糖基化修饰位点：蛋白质PTPRQ的T1730位和S1738位的O-GlcNAc糖基化以及蛋白质ATP5MC2的T61位的O-GlcNAc糖基化，是对O-GlcNAc蛋白质库的补充，但还需进一步用蛋白泛素化检测方法进行验证。

PTPRQ是Ⅲ型酪氨酸磷酸酶受体家族的成员，可调节细胞增殖、凋亡、分化和存活。最近在许多类型的癌症中观察到PTPRQ基因的突变、缺失和扩增，这表明PTPRQ可能在许多癌症的发展中起着至关重要的作用[34]。我们通过质谱在PTPRQ蛋白上鉴定出新的O-GlcNAc糖基化修饰位点，有助于进一步了解PTPRQ,为治疗相关疾病提供新的理论。

ATP5MC2是线粒体ATP合酶的一个亚基，属于跨膜组分，在心脏和卵巢等组织中普遍表达，参与ATP合成，在氧化磷酸化过程中利用质子穿过内膜的电化学梯度。目前对ATP5MC2在疾病中作用的研究尚缺乏，本研究在ATP5MC2蛋白上鉴定出新的O-GlcNAc糖基化修饰位点，为ATP5MC2在眼科疾病中的研究提供新的作用靶点。

综上所述，本研究结果表明O-GlcNAc蛋白在糖尿病性白内障组晶状体中表达显著增加，提示O-GlcNAc修饰参与白内障的形成和发展。质谱鉴定出的3个潜在的O-GlcNAc糖基化修饰位点和O-GlcNAc差异蛋白为进一步研究糖尿病白内障的发病机制提供理论依据，为防治糖尿病性白内障提供一种新方向。本实验尚存在一定局限性：(1)本研究对晶状体前囊膜中O-GlcNAc表达水平进行了检测，发现糖尿病性白内障晶状体前囊膜中O-GlcNAc表达增加，还需进一步研究其机制及通路；(2)本研究是体外实验，还需进一步建立动物模型，在体内进行验证。

参考文献:

[14]刘玉梅兰,杜珊珊,邵敬芝,等.晚期糖基化终末产物受体(RAGE)在糖尿病性白内障和年龄相关性白内障患者前囊膜及人晶状体上皮细胞中的表达.眼科新进展,2020,40(11):1015-1019.

基金资助:黑龙江省自然科学基金(No.LH2020H041);黑龙江省残疾人福利基金会资助项目(No.2023IIT088);哈尔滨医科大学附属第一医院科研创新基金(No.2020M23)~~;

文章来源:罗茜,杨聪聪,景刘洁,等.O-GlcNAc糖基化修饰在糖尿病性白内障中的作用[J].国际眼科杂志,2024,24(12):1882-1887.