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非洲鸵鸟源芽囊原虫基因型鉴定及分析
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摘要：芽囊原虫是一种呈世界性分布的常见机会致病性原虫，为鉴定云南某非洲鸵鸟养殖专业合作社芽囊原虫感染情况及其基因型，对采集的90份鸵鸟粪便样品，通过套式PCR扩增芽囊原虫SSU rRNA基因。结果发现，62份样本为阳性，芽囊原虫感染率为68.89%(62/90);其中，90日龄感染率最高，为86.36%(19/22),60日龄感染率最低，为6.25%(20/32),但不同日龄鸵鸟芽囊原虫的感染率差异不显著(P>0.05,χ2=6.67,df=3);基于SSU rRNA基因的序列分析，鉴定出ST5、ST7及ST20共3种芽囊原虫亚型，ST5为优势亚型。其中，ST5、ST7属人兽共患亚型。研究结果丰富了云南地区养殖非洲鸵鸟感染芽囊原虫的情况背景及基因分型的数据，为芽囊原虫的防控工作提供了参考。
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芽囊原虫是一种呈世界性分布的常见机会致病性原虫，为鉴定云南某非洲鸵鸟养殖专业合作社芽囊原虫感染情况及其基因型，对采集的90份鸵鸟粪便样品，通过套式PCR扩增芽囊原虫SSU rRNA基因。结果发现，62份样本为阳性，芽囊原虫感染率为68.89%(62/90);其中，90日龄感染率最高，为86.36%(19/22),60日龄感染率最低，为6.25%(20/32),但不同日龄鸵鸟芽囊原虫的感染率差异不显著(P>0.05,χ2=6.67,df=3);基于SSU rRNA基因的序列分析，鉴定出ST5、ST7及ST20共3种芽囊原虫亚型，ST5为优势亚型。其中，ST5、ST7属人兽共患亚型。研究结果丰富了云南地区养殖非洲鸵鸟感染芽囊原虫的情况背景及基因分型的数据，为芽囊原虫的防控工作提供了参考。
外表的皮肤及羽毛也具备很大的商业价值，根据农业部2010年发布数据显示，浙江宁波以鸵鸟加工的副产品实现年综合利用原料，为当地农户带来巨大经济收入。但有关于非洲鸵鸟进境检疫仅涉及病毒性或细菌性疾病如新城疫(Newcastle disease)、沙门氏菌病(Salmonellosis)等疾病，关于寄生虫方面检疫还存有空缺，很大程度上制约非洲鸵鸟养殖业的健康发展。
芽囊原虫(Blastocystis)隶属芽囊原虫纲(Blastocystidea)、芽囊原虫目(Blastocystida)、芽囊原虫科(Blastocystidae),是一种机会致病性原虫，具传播性，可致肠易激综合征、炎症性肠病、慢性腹泻等[4]。而在Siti A J的研究中发现一些感染了芽囊原虫但无肠道症状的鸟类作为带虫宿主在群体间传播该寄生虫[5,6,7]。一些亚型如ST1-ST9亚型具人兽共患的特性[8,9]。1992年我国广州市曾报道过由人芽囊原虫导致的儿童及成人腹泻，随后浙江省、云南省、广西壮族自治区等多地都有芽囊原虫的检出[10,11]。在非洲鸵鸟大肠组织中，Ponce G F等[12]也检出芽囊原虫，感染率达58.00%。该病原增加非洲鸵鸟养殖业的公共卫生安全防控风险，及时检出阳性个体对于行业健康发展十分必要。
本研究利用具物种特异性及在生物之间稳定遗传的基因——核糖体小亚基RNA(ribosomal small subunit, SSU rRNA)基因对从云南某鸵鸟养殖合作社获取不同年龄段的鸵鸟粪便样品进行芽囊原虫检测和分子鉴定[4],利用生物信息学方法构建其系统发育进化树，并利用统计软件进行差异显著性分析。本研究成果将为云南省鸵鸟源芽囊原虫的遗传变异研究及风险因素评估提供参考依据。
1、材料与方法
1.1 材料
1.1.1 样品来源
从玉溪市易门县某非洲鸵鸟养殖专业合作社随机选取90份鸵鸟粪便样品，其中7日龄11份、20日龄25份、60日龄32份，90日龄22份。用自封袋分别分装，逐一对应编号，记录样品信息后，置于4 ℃条件下储存。
1.1.2 主要试剂
粪便DNA提取试剂盒、无水乙醇以及50×TAE缓冲液，天根生物科技有限公司产品；琼脂糖粉，昆明诺华生物科技公司产品；2×Accurate Taq预混液(含染料),湖南艾科瑞生物工程有限公司产品；GelStain核酸染料(全式金) ,丰科生物科技有限公司产品；DNA标准DL 2 000,TaKaRa试剂公司产品。
1.1.3 主要仪器
PCR仪(PTC-1148),Bibby Scientific公司产品；旋涡混合器(QL-901),麒麟医用仪器厂产品；瞬时离心机(Mini-6K),湘仪离心机仪器有限公司产品；水平电泳仪(BG-subMINI),Baygene公司产品；凝胶成像系统(WGD-30),大韩科学仪器有限公司产品。
1.2 方法
1.2.1 分子生物学鉴定
1.2.1.1 套式PCR扩增
将90份样品预处理后，按DNA提取试剂盒说明书提取DNA,置于-20 ℃条件下保存。参考陶威[13]基于SSU rRNA基因的套式PCR合成上、下游引物，引物序列见表1,引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
表1 引物序列
扩增反应总体系为25.0 μL,Mix酶12.5 μL,包括上、下游引物(10 μmol/L)各1.0 μL,超纯水8.5 μL,模板DNA为2.0 μL。第一轮模板为所提取的DNA样品，第二轮模板是第一轮PCR的产物。反应程序：第一轮为94 ℃预变性5 min; 94 ℃ 1 min, 65 ℃ 1.5 min, 72 ℃ 2 min, 共30个循环； 72 ℃ 10 min, 16 ℃结束反应；第二轮为94 ℃预变性5 min; 94 ℃ 1 min, 50 ℃ 1 min, 72 ℃ 1.5 min, 共30个循环； 72 ℃ 10 min。同时设阴性对照。
1.2.1.2 琼脂糖凝胶电泳
取5 μL的PCR产物于加入含核酸染料的10 g/L琼脂糖凝胶中，置于电泳仪上电泳，检测结果可通过紫外透射仪拍照记录，将阳性条带所对应的PCR产物置于4 ℃条件下送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行双向测序。
1.2.1.3 SSU rRNA基因测序与序列分析
返回序列利用SeqMan拼接序列，拼接成功后进行Blast在线比对分析。从GenBank中下载与试验测定序列相似的部分芽囊原虫的SSU rRNA基因序列。利用MEGA6.0软件构建进化树，以另一种肠道共患原虫贝氏隐孢子虫(Cryptosporidium baileyi)作为外群，Bootstrap置信值重复抽样1 000次。
1.2.2 统计学分析
利用SPSS 20.0对采集不同日龄鸵鸟粪便样品的芽囊原虫检出数及检出率进行分析，以检出率最低日龄组为对照，进行比值比(Odds Ratio, OR值)的风险因素分析。本次试验所用样品数达卡方检验要求(n=90),因此以不同日龄组为差异因素对4组不同日龄组按照卡方检验的方法进行分析。
2、结果
2.1 分子生物学鉴定结果
2.1.1 电泳结果
对所采集的90份鸵鸟粪便DNA样品进行套式PCR检测，结果显示，共有62份DNA样品成功扩增出了芽囊原虫的SSU rRNA基因的目的片段，该地区养殖场的非洲鸵鸟总体感染率为68.89%(62/90)。阳性样品均可见约1 100 bp的条带，与预期目的片段大小相符，部分阳性条带如图1所示。
图1 芽囊原虫SSU rRNA基因的套式PCR扩增
2.1.2 SSU rRNA基因测序与进化树分析结果
测序结果分析表明，本研究成功获得62份芽囊原虫阳性样品的序列信息。其中检出57份ST5亚型，3份ST7亚型，2份ST20亚型。本研究中，部分7日龄鸵鸟组的芽囊原虫比对结果为ST5亚型，该序列与云南猪源芽囊原虫序列(MK375238.1)及德国分离株(MK801392.1)处于同一分支。60日龄鸵鸟组的芽囊原虫比对结果为ST20亚型，序列与从中国获得的分离株(KY823411.1)处于同一分支。20日龄鸵鸟组的芽囊原虫为ST7亚型，该序列则与法国分离株处于同一分支(图2)。
图2 进化树分析
2.2 统计分析结果
不同养殖日龄分组中，90日龄的非洲鸵鸟芽囊原虫阳性率最高，为86.36%(19/22);60日龄的非洲鸵鸟阳性最低，为6.25%(20/32),且在本研究中，利用统计学分析发现，不同养殖日龄的非洲鸵鸟芽囊原虫阳性率差异不显著(P>0.05,χ2=6.67,df=3)。以阳性率最低的60日龄组为参照计算与各组之间的OR值，7日龄感染芽囊原虫的风险小于60日龄组(OR=0.50),20日龄组感染芽囊原虫的风险是60日龄组的1.54倍，90日龄组感染芽囊原虫的风险是60日龄组3.8倍，结果如表2所示。
表2 不同日龄的非洲鸵鸟芽囊原虫检出结果
3、讨论
芽囊原虫在世界上广泛分布，云南地区芽囊原虫的研究报道多是关于牛、羊等常见家畜，在养殖的特种经济动物上研究较少，云南省关于非洲鸵鸟芽囊原虫感染情况尚未见相关的报道。本研究初次对云南地区养殖非洲鸵鸟感染芽囊原虫的情况及其基因型进行调查，发现芽囊原虫总感染率为68.89%(62/90),通过测序比对检出ST5、ST7及ST20共3种亚型，表明云南地区养殖的非洲鸵鸟存在芽囊原虫的感染，ST5、ST7亚型具人兽共患风险[13]。
胡雄峰等[14,15]在对秦岭地区的鸵鸟感染芽囊原虫情况研究中发现芽囊原虫感染率为33.30%,存在ST5、ST10、ST20这3种亚型；Deng L等[16]对四川省动物园养殖的鸵鸟进行检测发现芽囊原虫感染率为31.58%,全为ST5亚型。在刘林科等[17]对芽囊原虫的研究中提到鸟类可携带ST7亚型，本试验中鸵鸟源芽囊原虫ST5亚型阳性率达63.33%(57/90),ST7阳性率达3.33%(3/90),ST20阳性率达2.22%(2/90),研究结果均符合前人研究报道。芽囊原虫的传播途径为粪-口传播，发育至包囊阶段具传染性[18,19]。本试验研究对象非洲鸵鸟为圈养，不同养殖日龄间的群体有分隔，但是同一圈内粪便未及时清洁，导致鸵鸟相互踩踏粪便从而导致传播。统计分析发现不同养殖日龄的非洲鸵鸟感染芽囊原虫的阳性率差异不显著(P>0.05),考虑到7日龄与20日龄两个圈舍临近，所以存在较高的芽囊原虫感染率。再有，各养殖日龄组芽囊原虫感染率差异无规律，推测可能由于每个养殖日龄段的圈养场面积有差异，使得鸵鸟的活动范围不同，从而导致异圈饲养鸵鸟间感染的差异。
本次研究获得ST5分离株与中国分离的猪源分离株处于同一分支，由此推测，猪源的芽囊原虫能够传播给鸵鸟。该地的养殖合作社应加强对芽囊原虫的防控力度。首先，考虑到芽囊原虫是一种机会性致病原虫，免疫力低下的人或动物个体较易感，养殖人员应该加强防护意识，培养良好的卫生习惯，做好个人防护[20,21,22];其次，定期采集养殖鸵鸟的新鲜粪便进行芽囊原虫的检测[23]。对于检测出芽囊原虫的阳性个体要及时从群体中分离出来，选用甲硝唑、磺胺甲基异恶唑或硝唑尼特都可对该病起到良好的治疗效果[24,25]。
参考文献:
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[25]钟悦,叶金花,谢富华,等.芽囊原虫病的治疗药物研究进展[J].赣南医学院学报,2021,41(4):409-414.
基金资助:云南省朱兴全专家工作站项目(202005AF150041);云南农业大学兽医公共卫生省创新团队项目(202105AE160014);
文章来源:陈俊蓉,谢昕言,徐翠蓉等.非洲鸵鸟源芽囊原虫基因型鉴定及分析[J].动物医学进展,2023,44(12):42-46.
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2023-12-13
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2023-11-23
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