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5种中药水提物对大肠杆菌体外生物被膜形成的影响
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摘要：探索黄柏、连翘、五倍子、白头翁和蒲公英5种中药水提物对大肠杆菌生物被膜形成的影响。采用试管二倍稀释法测定5种中药水提物对大肠杆菌的最低抑菌浓度（MIC），通过银染法观察5种中药水提物对大肠杆菌生物被膜黏附作用的影响，采用结晶紫染色法检测5种中药水提物对大肠杆菌生物被膜的抑制作用。结果显示，黄柏、连翘、五倍子、白头翁和蒲公英等水提物对大肠杆菌的MIC分别为500 mg/mL、500 mg/mL、250 mg/mL、250 mg/mL和125 mg/mL。通过镜像图可观察到对照组中有大面积的黑斑，而5种用药组的黑斑面积明显减小。对照组的大肠杆菌生物被膜洗脱液OD值为0.555，黄柏、连翘、五倍子、白头翁和蒲公英等用药组的生物被膜洗脱液OD值分别为0.245、0.236、0.237、0.213和0.229，与对照组比较差异极显著（P<0.01）,5种中药水提物对大肠杆菌生物被膜的抑制率分别为55.9%、57.3%、57.5%、61.6%和58.7%。结果表明，5种中药水提物均能有效抑制大肠杆菌生物被膜的形成。
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细菌生物被膜是指细菌黏附在接触表面后，分泌多糖、脂蛋白和纤维蛋白等物质将其包裹，形成由细菌汇聚而成的膜样物[1]。大肠杆菌常以浮游态和生物被膜态形式生存，以生物被膜形式存在的大肠杆菌在临床上常引起慢性、持续性和反复性感染，加大大肠杆菌性疾病的治疗难度[2]。目前，因资源丰富、安全性高和毒性低等优点，中药逐渐被用于抑制和消除细菌生物被膜的研究中，如山茱萸、五味子和秦皮对大肠杆菌生物被膜的形成有良好的抑制作用[3,4]。因此，本研究选取5种临床常用的中药进行抑制生物被膜形成试验，以期筛选出对大肠杆菌生物被膜的形成具有良好抑制效果的中药，为更有效地防控细菌生物被膜引起的疾病奠定基础。
1、材料与方法
1.1 菌株
大肠杆菌K88由黑龙江八一农垦大学牛病防治工程技术中心实验室保存。
1.2 中药
黄柏、连翘、五倍子、白头翁和蒲公英5味中药饮片均购自大庆市北京同仁堂药店。
1.3 主要仪器
UV8000型紫外-可见光分光光度计（上海元析仪器有限公司）；XSP-18S型光学显微镜（西安明克斯检测设备有限公司）；LDZX-40BI型立式压力蒸汽灭菌器（上海博迅实业有限公司）；DRP-9082型电热恒温培养箱（上海森信实验仪器有限公司）。
1.4 试验方法
1.4.1 中药水提物的制备
参照霍佳楠等[5]报道的方法制备中药水提物，使药物最终浓度为1 g/mL，于4℃保存备用。
1.4.2 大肠杆菌细菌悬液的制备
将大肠杆菌纯化后接种于营养肉汤中，37℃恒温培养18～24 h，用营养肉汤稀释至2×106cfu/mL，于4℃保存备用。
1.4.3 中药水提物对大肠杆菌最低抑菌浓度的测定
参照朗利敏等[6]报道的试管二倍稀释法测定5种中药水提物对大肠杆菌的最低抑菌浓度（MIC），与阳性对照组对比，通过肉眼观察无细菌生长的最低药物稀释度，判定为MIC。
1.4.4 大肠杆菌生物被膜体外模型的建立
参照陈一强[7]的建模方法并进行改良。将PVC材料裁制成规格为1 cm×1 cm小片，75%酒精浸泡15 min后备用。取6只试管，分为模型组和空白对照组。模型组试管中加入1 mL菌悬液和1 mL营养肉汤，空白对照组试管中加入2 mL营养肉汤，每天用1 mL营养肉汤换液。培养7 d，用银染法进行染色[8]。先采用0.9%氯化钠漂洗除去浮游细菌，2.5%戊二醛溶液固定生物被膜1 h，蒸馏水漂洗PVC小片1 min。后将饱和氯化钙溶液与PVC小片结合15 min，用蒸馏水漂洗，与5%硝酸银结合15 min，加入1%对苯二酚溶液显色2 min，蒸馏水漂洗后，用5%硫代硫酸钠溶液固定PVC小片2 min。在400倍光学显微镜下观察银染后的载体表面，若有棉絮样、黑色团块状的物质，即为大肠杆菌生物被膜。
1.4.5 中药水提物对大肠杆菌生物被膜黏附的影响
采用“1.4.4”项下方法进行建模。取10只试管，编号为1～10，分为对照组和用药组，其中1～5号为对照组，6～10号为用药组。开始建模时，对照组中加入1 mL菌悬液和1 mL营养肉汤，用药组中加入1 mL菌悬液和1 mL的1/2 MIC中药水提物。培养7 d，采用“1.4.4”项下银染法观察细菌生物被膜。
1.4.6 中药水提物对大肠杆菌生物被膜的抑制作用
采用“1.4.4”项下方法进行建模。取10只试管，编号为1～10，分为对照组和用药组，1～5号为对照组，6～10号为用药组。开始建模时，对照组中加入1 mL菌悬液和1 mL营养肉汤，用药组中加入1 mL菌悬液和1 mL的1/2 MIC中药水提物。培养7 d，用结晶紫染色法测定细菌生物被膜的形成量[9]。用0.9%氯化钠漂洗除去浮游细菌，晾干，加1 mL结晶紫染色20 min，用0.9%氯化钠冲洗未结合的结晶紫，晾干，在细菌生物被膜载体上滴加95%乙醇2 mL脱色3 min，在600 nm处测量大肠杆菌洗脱液的OD值。中药水提物对大肠杆菌生物被膜的抑制率计算[10]。
抑制率=（对照组OD600-用药组OD600）/对照组OD600×100%
1.4.7 数据分析
采用GraphPad Prism 8.0.2软件进行单因素方差分析，试验数据均采用平均值±标准差表示，显著性水平为P<0.05表示有统计学意义。
2、结果与分析
2.1 中药水提物对大肠杆菌的MIC
采用试管二倍稀释法测得黄柏、连翘、五倍子、白头翁和蒲公英5种中药水提物对大肠杆菌的MIC分别为500 mg/mL、500 mg/mL、250 mg/mL、250 mg/mL和125 mg/mL。
2.2 大肠杆菌生物被膜体外模型的建立
从图1可知，模型组有大量的黑色絮样物质，空白对照组无黑色絮样物质，说明此方法可成功构建大肠杆菌生物被膜体外模型。
2.3 中药水提物对大肠杆菌生物被膜黏附作用的影响
从图2可知，对照组大肠杆菌生物被膜载体经染色后，可观察到大量的黑斑，呈现棉絮样和团块状物，表明大肠杆菌形成了成熟的生物被膜。在中药水提物的干预作用下，给药组的黑斑数量减少并且分散开来。表明5种中药水提物均能有效抑制大肠杆菌生物被膜的黏附。
图1 大肠杆菌生物被膜体外模型形态观察（400×）
图2 中药水提物干预后大肠杆菌生物被膜形态观察（400×）
2.4 中药水提物对大肠杆菌生物被膜形成量的影响
通过结晶紫染色法测定1/2 MIC的5种中药水提物对大肠杆菌生物被膜的干预作用。如表1所示，与对照组比较，在1/2 MIC的中药水提物作用下，大肠杆菌生物被膜洗脱液的OD600值均极显著降低（P<0.01），其中白头翁水提物的抑制效果最优，抑制率为61.6%。
表1 中药水提物对大肠杆菌生物被膜的抑制作用
3、讨论
临床上部分细菌性疾病与细菌生物被膜有关，与浮游状态的细菌相比，处于生物被膜状态的细菌能够抵抗宿主的免疫防御，使生物被膜内的细菌毒力和耐药性增强[11]。因此，抑制细菌生物被膜的形成，对防控细菌生物被膜引起的疾病具有重要意义。
细菌的黏附是细菌生物被膜形成的关键过程[12]。FU等[13]采用银染法证明败酱草提取物可抑制铜绿假单胞菌在生物被膜载体上的黏附。银染法中AgNO3与定植在载体上的细菌生物被膜所分泌的多糖蛋白结合形成黑色团块状物质，该物质能反映细菌生物被膜的宏观表量[14,15]。本试验结果显示，5种中药水提物可降低大肠杆菌在生物被膜载体上的黏附和多糖蛋白分泌，使银染的黑斑区域及密度明显减少，与上述研究报道一致。
结晶紫染色法是实验室检测生物被膜的常用方法，根据检测细菌生物被膜洗脱液的吸光度值，能准确表征生物被膜的形成量。近年来的研究表明，亚抑菌浓度的抗菌药物能调控生物被膜的形成[16,17]。本试验中，1/2 MIC的5种中药水提物可极显著降低大肠杆菌生物被膜洗脱液的吸光度值，减少大肠杆菌生物被膜的形成量，与上述报道一致。
综上所述，黄柏、连翘、五倍子、白头翁和蒲公英5种中药水提物均具有抑制大肠杆菌生物被膜的作用。对5种中药水提物的抗生物被膜形成的作用机制还需进一步探究。
参考文献:
[4]陈美玲.中西药对大肠杆菌生物膜形成和毒力基因表达影响的初步研究[D].济南:山东大学,2013.
[5]霍佳楠,姜晓文,许晶,等.蒲公英水提物对体外金黄色葡萄球菌生物膜形成的影响[J].中兽医医药杂志,2015,34(1):12-15.
[6]郎利敏,李海利,方剑玉,等.22味中药对犊牛腹泻大肠杆菌的体外抑菌试验[J].中兽医医药杂志,2023,42(1):53-56.
[7]陈一强.绿原酸对铜绿假单胞菌生物膜抑制作用及其机制的体内外研究[D].南宁:广西医科大学,2010.
[8]张春艳,包永睿,孟宪生,等.大肠埃希菌生物被膜体外模型的建立及黄连水提物对其抑制作用的初步研究[J].微生物学杂志,2013,33(5):53-57.
[10]寇静,连莉阳,张宏方,等.中药银黄消痤对痤疮丙酸杆菌临床株生物被膜形成和黏附的影响[J].广西医学,2021,43(9):1101-1104.
[12]李弘昊,温红侠.细菌生物膜治疗研究新进展[J].中国临床研究,2022,35(12):1758-1761+1766.
[14]孔静雅,郭强强,邬琴,等.细菌生物被膜形成的影响因素及检测方法的研究进展[J].黑龙江畜牧兽医,2018(3):44-48.
[15]李璐.苦参碱对体外大肠杆菌生物膜形成的破坏作用研究[D].南宁:广西医科大学,2015.
[16]李婧,温海楠,王晓辉,等.亚抑菌浓度抗菌药物对细菌生物膜影响的研究进展[J].临床检验杂志,2021,39(5):386-389.
[17]许晶.蒲公英水提物对猪链球菌生物被膜体外干预作用[D].哈尔滨:东北农业大学,2015.
基金资助:黑龙江省农垦总局“十三五”重点科技计划项目(HNK135-04-03);
文章来源:王巧玉,甄明哲,张年洁等.5种中药水提物对大肠杆菌体外生物被膜形成的影响[J].中兽医医药杂志,2023,42(06):12-15.
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2023-12-13我要评论
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2023-11-30
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