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压力性尿失禁大鼠肛提肌自噬水平变化及意义

2024-09-12 23 上传者：管理员

摘要：目的探讨压力性尿失禁(SUI)与肛提肌自噬的相关性，并观察调节肛提肌自噬对漏尿症状的影响。方法取未建模大鼠10只为对照组，30只大鼠利用扩张阴道(VD)+切除卵巢(OVX)建立SUI模型(实验组)。建模成功大鼠分别以腹腔注射自噬抑制剂甲基腺嘌呤300μg/kg(甲基腺嘌呤组)、增强剂雷帕霉素5 mg/kg(雷帕霉素组)调控自噬、腹腔注射生理盐水为对照(模型组)。再次以喷嚏实验及尿动力检查检测，后获取肛提肌组织行苏木素-伊红(HE)、Masson染色、电镜观察肛提肌形态学变化。结果与对照组比较，模型组、甲基腺嘌呤组、雷帕霉素组LC-3Ⅱ蛋白、LC-3 mRNA、Beclin-1 mRNA及蛋白表达差异有统计学意义(P<0.05);与模型组比较，甲基腺嘌呤组和雷帕霉素组以上指标差异有统计学意义(P<0.05);与甲基腺嘌呤组比较，雷帕霉素组以上指标差异有统计学意义(P<0.05)。与模型组比较，甲基腺嘌呤组漏尿点压明显上升(P<0.05),肛提肌纤维排列整齐，线粒体异常减少，自噬体下降。结论 SUI大鼠肛提肌中自噬水平升高，提示自噬可能与SUI的发病机制相关，降低自噬可提高漏尿点压，有效改善SUI漏尿症状。

关键词：
压力性尿失禁
慢性疾病
漏尿点压
肛提肌
自噬
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压力性尿失禁(SUI)是一种多发于中老年女性的慢性疾病，怀孕、分娩是SUI的常见危险因素，在一胎足月产产妇中发病率高达22.8%[1],合并产伤的阴道分娩者，尿失禁的患病率则高达54%[2]。产伤导致的肛提肌损伤与SUI发生发展相关[3]。形态学上看，SUI患者的骨骼肌含量较低，每个肛提肌束中的肌纤维较少，结缔组织含量较高[4]。功能上，肛提肌的弹性、硬度[5]、收缩力[6]低于正常人。盆底损伤可导致部分肌肉失神经支配，随之发生神经再支配。SUI患者咳嗽时肛提肌反射的强度及其幅度下降[7]。尽管SUI与盆底肌肉损伤之间的关系已有初步证据，但其病理基础仍有待阐明。

自噬广泛参与细胞内稳态、癌症、衰老、发育等多种细胞过程。骨骼肌损伤可导致肌肉自噬改变，从而导致骨骼肌丧失(肌萎缩症)[8]。鉴于产伤可导致的盆底肌损伤，本文假设其过程可能合并自噬功能紊乱，从而影响其控尿功能及自身修复能力。本研究将检测SUI的SD大鼠模型肛提肌的自噬水平，同时使用甲基腺嘌呤、雷帕霉素干预自噬过程，并观察对症状的影响，希望获得自噬与SUI发病相关的证据。

1、材料和方法

1.1实验动物与材料

取自然分娩后1个月雌性SD大鼠50只，2月龄，体质量225～280[平均(250±25)]g,由昆明医科大学动物实验中心提供(动物许可SCXK滇K2015-0002)。微管相关轻链蛋白(LC)-3抗体[辣根过氧化物酶(HRP)标记山羊抗大鼠，GB23302]、Beclin-1(HRP标记山羊抗大鼠，GB23413)、二抗(HRP标记驴抗山羊，GB23404,Servicebio)。

1.2动物模型建立

参考了唐爱琼等[9]的建模方法，利用自然分娩后SD大鼠行卵巢切除+阴道扩张建立SUI模型(实验组):切除卵巢后，大鼠阴道内置入12F(直径4 mm)尿管，以200 g重物悬吊牵拉4 h。2 w后重复扩张，共4次。以正常分娩后大鼠为对照组。建模成功大鼠随机选取30只，分为3组，每组10只，分别腹腔注射自噬抑制剂甲基腺嘌呤300μg/kg(甲基腺嘌呤组)、增强剂雷帕霉素5 mg/kg(雷帕霉素组),注射生理盐水为模型组，1次/d,连续给药1个月。

1.3动物实验

①尿动力学检查：使用尿流动力学检测仪(Laborie TUB500,加拿大)测最大膀胱容量(MBC)和腹压漏尿点压(ALPP)。按照报道方法[10],通过尿管与尿流动力学检测仪及微量输液泵相连进行测量。②喷嚏实验：刺激SD大鼠鼻腔，诱发喷嚏，喷嚏时有尿液溢出为阳性，无小便流出为阴性。③药物干预：取未建模大鼠10只为对照组，随机挑选30只建模成功大鼠分为3个组，每组10只。一组腹腔注射生理盐水(模型组)作为对照，另两组分别腹腔注射甲基腺嘌呤300μg/kg(甲基腺嘌呤组)、雷帕霉素5 mg/kg(雷帕霉素组)调控自噬，每日注射1次，连续给药1个月后再次行尿动力检查。④肛提肌组织制作石蜡切片，脱蜡，苏木素染色后，分别以伊红染液、Masson丽春红染液染色，冲洗后中性树胶封片。显微镜下观察组织形态学改变。

1.4电镜观察

将SD大鼠脱颈椎处死，完整取出大鼠髂尾肌、耻骨直肠肌。标本剪成2 mm大小，加入2.5%戊二醛固定液4℃固定2 h后，再换1%四氧化锇液固定1 h,脱水、渗透、包埋，切片、染色等处理后，于透射电镜下观察，比较线粒体超微结构和自噬体(AP)积累的差异。线粒体完整则为正常，膜破裂、嵴缺失和基质溶解则为异常。数据采集和分析利用了10个随机选择区域的代表性显微照片。分析各组线粒体形态异常频率及自噬体数量差异。

1.5 LC-3、Beclin-1 mRNA水平检测

取100 mg组织加入液氮研磨成粉末，使用总RNA提取试剂盒进行RNA提取，利用TaKaRa反转录试剂盒反转录得到cDNA。引物序列：Beclin-1上游5′-AGGAGTTG-CCGTTGTACTGTTCT-3′,下游5′-GTGTCTTCAATCT-TGCCTTTCTCC-3′。LC-3上游5′-ATCAACATTCTGA-CGGAGCGG-3′,下游5′-ATCTGCCTGCTTGTCCTGG-TT-3′。GAPDH上游5′-CTGGAGAAACCTGCCAAGTATG-3′,下游5′-GGTGGAAGAATGGGAGTTGCT-3′。利用实时荧光定量聚合酶链反应进行检测。

1.6 LC-3、Beclin-1翻译水平检测

取肛提肌组织研磨、裂解，12 500 r/min离心半径10 cm,离心10 min后取上清液，二喹啉甲酸(BCA)法测定总蛋白浓度，利用Western印迹法检测LC-3、Beclin-1蛋白表达，以GAPDH作为内参。

1.7统计学处理

采用SPSS16.0软件进行χ2检验、独立样本t检验及单因素方差分析。

2、结果

2.1动物模型建立及检验

实验组和对照组喷嚏实验阳性有统计学差异(P<0.001)。实验组喷嚏实验阳性大鼠行尿动力学检查，两组MBC无统计学差异(P>0.05)。实验组较对照组ALPP下降，有统计学差异(P<0.05)。见表1。

2.2药物干预后尿动力改变

与模型组比较，甲基腺嘌呤组ALPP明显升高，雷帕霉素组ALPP明显降低(均P<0.05)。见表2。

2.3各组LC-3、Beclin-1mRNA及蛋白表达

与对照组比较，其余3组LC-3Ⅱ、Beclin-1 mRNA及蛋白表达差异均有统计学意义(P<0.05);与模型组比较，甲基腺嘌呤组和雷帕霉素组以上指标差异有统计学意义(P<0.05);与甲基腺嘌呤组比较，雷帕霉素组以上指标差异有统计学意义(P<0.05)。见表2、图1。

表1两组打喷嚏实验阳性率及尿动力学检查比较

表2 4组尿动力检查及LC-3、Beclin-1 mRNA及蛋白表达

图1各组LC-3、Beclin-1蛋白表达

1～4:对照组、模型组、甲基腺嘌呤组、雷帕霉素组

2.4自噬调控对SUI肛提肌组织的影响

对照组盆底肌纤维连续性较好，肌纤维间结缔组织较少，肌纤维排列整齐。模型组盆底肌肌纤维数量明显减少、横径变细，部分纤维组缺失、断裂，纤维结缔组织增多。甲基腺嘌呤组肛提肌组织得到一些改善，雷帕霉素组则肌纤维损伤加剧。见图2。

图2自噬对SD大鼠SUI模型肛提肌组织的影响(×100)

2.5电镜观察自噬对SUI肛提肌组织影响

电镜下发现对照组肌纤维排列整齐，肌节内明带和暗带规律，呈现出明暗相间的横纹。模型组部分肌纤维断裂，排列紊乱，腹腔注射雷帕霉素增加了这种肌纤维的损伤，甲基腺嘌呤组较模型组肌纤维排列整齐。透视电镜下，模型组出现了更多与AP一致的细胞内双膜空泡结构，并可见自噬溶酶体的出现，更多的线粒体表现出膜破裂、嵴缺失和基质溶解，线粒体明显肿胀。甲基腺嘌呤组较模型组出现更少的AP及更少的线粒体异常，而雷帕霉素组则较模型组出现更多的AP及更多的线粒体异常。见图3。

图3电镜观察各组肛提肌组织

3、讨论

阴道分娩被认为是女性经历的对盆底肌较大的损伤之一，产伤是女性SUI发生的公认危险因素之一。分娩时阴道侧壁的压力在收缩高峰期可达到240 cmH2O[11],15%～35%的产伤可合并有肛提肌的撕裂[12],盆底肌的损伤增加了尿失禁及盆腔脏器脱垂等的风险。与正常产妇相比，盆底肌撕裂的女性在尝试进行盆底肌肉收缩时的尿道闭合压力降低了25%[13]。其他因素如胎儿大小、第二产程延长、孕前尿失禁的存在及产前膀胱颈活动度也与产后尿失禁的发生有关[14]。

本研究SUI建模成功率约86%。漏尿点压对于改善控尿有重要意义，能够有效应对腹压的升高[15]。本实验证实，自噬参与了SUI的发生发展过程，SUI中自噬增加，而抑制自噬提高漏尿点压力，减轻漏尿症状。盆底肌以Ⅱb型(慢收缩)纤维为主，属于骨骼肌。骨骼肌受到机械损伤后，出现线粒体肿胀破坏，细胞骨架破坏和微管、微丝、中间纤维比例的快速失衡。Beclin-1,LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ等自噬标记基因的表达升高，同时伴随着凋亡过程的激活[8]。基础水平的自噬对于维持肌肉组织的完整性必不可少[16],抑制自噬过程可导致肌萎缩、肌肉无力和肌病的形态学改变。自噬基因缺失可导致肌肉萎缩，肌纤维变性，出现异常的线粒体蛋白质聚集，膜体积累，内质网扩张、空泡形成、氧化应激和细胞凋亡[17]。自噬是骨骼肌适应外界损伤并介导骨骼肌自我修复的必要条件[16],通过改善自噬，损伤肌肉组织中卫星细胞可从不可逆的G0期进入可逆的G0期，从而逆转衰老状态[18]。

SUI与自噬关系的报道较少。作为间接证据，Strasser等[19]通过人体标本发现随着年龄的增长，可以观察到盆底肌、尿道括约肌肌细胞密度的进行性降低，这种由于细胞凋亡导致的横纹肌细胞的持续损失可能最终导致尿失禁。SUI模型大鼠中观察到尿道黏膜、平滑肌凋亡指数显著增加，最大尿道闭合压力明显较低，尿道平滑肌细胞形状改变，细胞间空间增加，胶原蛋白沉积和线粒体变性[20]。自噬和肌肉收缩之间的联系，已在一些体内或体外试验中得到了证实。自噬是调节肌肉质量控制的重要细胞过程，自噬不足和过度都会导致肌肉萎缩[16]。骨骼肌收缩与舒张依赖于肌纤维，收缩力与肌纤维的体积、排列呈正相关。Daniel等[21]发现，伴随着高自噬活性，逼尿肌束中自噬蛋白(ATG)5的斑片状表达升高，ATG5的斑片状表达与平滑肌素相关，而平滑肌素是调节逼尿肌收缩所必需的。已知LC3Ⅱ是一种自噬标志物，当磷脂酰乙醇胺与LC3Ⅰ结合时形成，产生的LC3Ⅱ附着在隔离膜上。因此，LC3Ⅱ/Ⅰ比率代表了隔离膜的形成程度，自噬指数LC3Ⅱ/Ⅰ比率与肌肉收缩力相关联[22]。本研究结果表明，SUI模型肛提肌收缩活性下降。

线粒体既是细胞呼吸氧化的关键场所，也是细胞凋亡信号的启动子。抑制自噬将抑制受损线粒体的吞噬，从而影响线粒体的更新，导致异常细胞器的积累，肌肉的缓慢收缩将通过提供新生的功能性细胞器来平衡线粒体功能障碍[23]。与文献报道相似，本研究发现，抑制自噬减轻了漏尿症状及减轻盆底肌的损伤。本研究有一些局限性。首先，使用的SD-大鼠的盆底结构不同于直立行走的人类，二者盆底肌损伤对于控尿的影响具有一定差别；其次，肛提肌的形态学变化不能完全反映肌力的变化。

基金资助:国家自然科学基金(82160584);云南省科技厅项目(2019FE001-277,202101AY07001-227);云南省教育厅科学研究基金(2019J1315);

文章来源:李江,邓体斌,彭家玺,等.压力性尿失禁大鼠肛提肌自噬水平变化及意义[J].中国老年学杂志,2024,44(17):4176-4180.