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防风通圣散对多囊卵巢综合征小鼠的治疗作用

2024-10-17 92 上传者：管理员

摘要：目的研究防风通圣散对多囊卵巢综合征（PCOS）小鼠的治疗作用及其机制。方法采用高脂饲料饲养与ig来曲唑1.4 mg•kg-1建立小鼠PCOS模型，收集经防风通圣散治疗后模型小鼠的血液与卵巢组织，用于生化、病理与免疫学检测。采用网络药理学方法分析防风通圣散治疗PCOS的潜在靶点。结果防风通圣散可显著降低PCOS小鼠的空腹血糖水平，增加卵巢组织中黄体的数量与颗粒细胞层的厚度，上调血清中雌二醇、促卵泡激素的水平，降低白介素-6（IL-6）的水平；上调卵巢组织中蛋白激酶B（AKT）的表达，下调血管内皮生长因子（VEGF）A的表达。网络药理学分析显示：AKT、IL-6、VEGFA为防风通圣散治疗PCOS的核心靶点。结论防风通圣散可改善PCOS小鼠的卵巢病理损伤与激素紊乱症状，其机制与调控AKT、IL-6、VEGF的表达有关。

关键词：
作用机制
促卵泡激素
多囊卵巢综合征
网络药理学
蛋白激酶B
血管内皮生长因子A
防风通圣散
雌二醇
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多囊卵巢综合征(PCOS)是一种临床常见的内分泌紊乱性疾病，其主要临床表现为卵巢多囊样改变、肥胖、经期不规律、痤疮、毛发旺盛、胰岛素抵抗及糖脂代谢异常等。PCOS的发病机制尚不明确，目前认为与肥胖、慢性炎症、氧化应激、卵巢间质纤维化、矿物质缺乏及肠道菌群紊乱等关系密切。临床上通过药物治疗、运动消耗、行为干预、手术治疗等方式来缓解PCOS的相关症状，主流用药有抗高雄激素血症药物、促排卵药物及胰岛素增敏剂等[1]。防风通圣散是治疗外寒内热之证的经典方剂，在PCOS的治疗中表现出巨大的潜力。防风通圣散联合二甲双胍治疗肥胖型PCOS患者，可显著降低性激素、糖代谢指标及总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白胆固醇的水平[2]。现采用来曲唑建立小鼠PCOS模型，并饲喂高脂饲料，使模型更贴近临床上肥胖型PCOS患者的状况。观察防风通圣散对PCOS模型小鼠的治疗作用，并探讨其潜在机制，为防风通圣散治疗PCOS的临床应用奠定基础。

1、实验部分

1.1仪器、试药与动物

Imark酶标仪(美国Bio-Rad);安稳+Plus血糖仪(三诺生物传感股份有限公司)。防风、川芎、当归、芍药、大黄、薄荷、麻黄、连翘、芒硝、石膏、黄芩、桔梗、荆芥、白术、栀子、滑石、甘草等饮片(兰州市惠仁堂);来曲唑(浙江海正药业股份有限公司);炔雌醇环丙孕酮片(拜耳医药保健有限公司);小鼠白介素-6(IL-6)、促卵泡激素(FSH)、雌二醇(E2)ELISA试剂盒(江苏菲亚生物科技有限公司);兔抗蛋白激酶B(AKT)多克隆抗体(美国Immunoway);兔抗血管内皮生长因子A(VEGFA)多克隆抗体(美国Genetex);高脂饲料(自制，含基础饲料88.6%、猪油10%、胆固醇1%、甲基硫氧嘧啶0.2%、牛胆盐0.2%)。SPF级♀昆明种小鼠(中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所，许可证号：SCXK甘2015-0001),体重18～22 g。

1.2方法与结果

1.2.1溶液的制备

按防风通圣散组方(防风、川芎、当归、芍药、大黄、薄荷、麻黄、连翘、芒硝各6 g,石膏、黄芩、桔梗各12 g,荆芥、白术、栀子各3 g,滑石20 g,甘草10 g)称取各饮片，混合后用水浸泡、煎煮、过滤，将滤液浓缩至每毫升含原药材2 g,于4℃保存备用，实验时用超纯水稀释至所需浓度供试药液后给药。

1.2.2小鼠的造模、分组与给药

动物实验经甘肃中医药大学实验动物伦理委员会批准，审批号：2022-604。将48只♀小鼠随机均分为空白组、模型组、阳性组和防风通圣散低(FTPL)、中(FTPM)、高(FTPH)剂量组。参考文献方法造模，除空白组外，各组小鼠每日上午ig来曲唑的1%羧甲基纤维素钠(CMC-Na)溶液1.4 mg·kg-1制备多囊卵巢综合征(PCOS)模型，连续21 d,饲喂高脂饲料；空白组小鼠ig给予20 mg·kg-11% CMC-Na溶液，饲喂正常饲料[3]。期间密切检测模型小鼠的动情周期，以模型组小鼠阴道涂片持续为动情间期状态视为造模成功[4]。从第22日起，防风通圣散组小鼠分别ig 16.77、33.54、67.08 g·kg-1防风通圣散(据人与小鼠的体表面积折算等效剂量，按70 kg成人每日用药129 g计算，小鼠给药剂量为成人的9.1倍，得小鼠等效给药剂量为16.77 g·kg-1,低、中、高剂量分别相当于临床等效剂量的1、2、4倍),阳性组ig炔雌醇环丙孕酮片0.26 mg·kg-1,空白组和模型组小鼠ig等量生理盐水，给药10 d,期间每日称量小鼠体重，观察小鼠阴道涂片。末次给药后禁食不禁水24 h,剪尾采血，检测小鼠的空腹血糖水平；于股主动脉采血后，处死小鼠，于冰面上取左、右卵巢组织于4%多聚甲醛中固定，全血置EP管中，于室温下静置2 h后，以3×103r·min-1离心15 min,分离得血清，备用。

1.2.3防风通圣散对PCOS小鼠体重及空腹血糖的影响

称量各组小鼠给药前后的体重，计算体重变化量。剪尾采血，用血糖仪试纸测定小鼠的血糖。由图1可知：与空白组比较，模型组小鼠的体重变化量与空腹血糖显著增加(P<0.01);与模型组比较，阳性组的体重变化量与空腹血糖显著下降(P<0.05、P<0.01),FTPM组的空腹血糖显著下降(P<0.05)。

1.2.4防风通圣散对PCOS小鼠卵巢功能及形态的影响

观察小鼠给药第4～10日的阴道涂片，对卵巢组织行HE染色，用奥林巴斯显微成像系统拍照，观察大鼠卵巢组织的病理学变化。动情周期反映卵巢的排卵功能及内分泌功能。造模第11日起，模型组的卵巢组织中持续见大量白细胞、少量梭形上皮细胞，处于动情间期。由图2可知：阳性和防风通圣散各剂量组在治疗前与模型组一致，处于动情间期；治疗后逐步出现动情前期、动情期、动情后期。空白组小鼠的卵巢组织可见不同发育阶段的卵泡，黄体排列整齐，颗粒细胞层较厚。模型组小鼠的卵巢组织中黄体数量大大减少，囊状扩张卵泡与闭锁卵泡较多，卵泡颗粒细胞层数较少。与模型组比较，各给药组的黄体数量明显增多，卵泡颗粒细胞层厚度增加，部分卵泡可见放射冠。

图1小鼠给药前后的体重变化量(A)与空腹血糖水平(B)

图2空白组(A)、模型组(B)、阳性组(C)和防风通圣散低(D)、中(E)、高(F)剂量组小鼠的动情周期(1)与卵巢病理组织的HE染色图(2)

1.2.5防风通圣散对PCOS小鼠血清E2、FSH水平的影响

参照相关ELISA试剂盒说明，测定大鼠血清生殖激素E2、FSH的水平。由图3可知：与空白组比较，模型组小鼠血清中E2、FSH的水平显著下降(P<0.01);与模型组比较，阳性、FTPM、FTPH组小鼠血清中E2、FSH的水平显著升高(P<0.05、P<0.01)。

1.2.6网络药理学研究

通过TCMSP数据库(https: //tcmsp-e.com/),以口服生物利用度≥30%、类药性≥0.18为筛选标准[5],检索防风通圣散中防风、大黄、芒硝、荆芥、麻黄、栀子、白芍、连翘、甘草、桔梗、川芎、当归、石膏、滑石、薄荷、黄芩、白术等药材的化学成分，获得其作用的蛋白质靶点；以Score cutoff≥20为筛选标准[6],从BATMAN-TCM数据库(http: //bionet.ncpsb.org/batman-tcm/)中检索芒硝、滑石的化学成分与靶点；在HERB数据库(http: //herb.ac.cn/)中检索石膏的化学成分，在PharmMapper数据库(http: //lilab-ecust.cn/pharmmapper/)中获取成分所作用的靶点。将靶点导入Uniprot数据库(https: //www.uniprot.org),查询与靶点相对应的基因名称并进行注释。对结果进行去重，获得防风通圣散的靶点。防风通圣散含有活性成分262个，其中，防风18个、大黄16个、芒硝2个、荆芥11个、麻黄23个、栀子15个、白芍13个、连翘23个、甘草92个、桔梗7个、川芎7个、当归2个、石膏1个、滑石2个、薄荷10个、黄芩36个、白术7个，去重后共获得329个药物作用的靶点。分别通过Gene cards(https: //www.genecards.org)、OMIM(https: //omim.org/)、Dis Genet(https: //www.disgenet.org/)数据库，以“Polycystic Ovarian Syndrome”为关键词检索，在Dis Genet数据库中设定Score≥0.1的目标靶点为疾病的潜在靶点，合并3个疾病数据库的靶点后，删除重复值，得到疾病靶点553个。将329个药物作用靶点与553个PCOS靶点取交集，得到防风通圣散治疗PCOS的作用靶点84个(图4A)。将药物与疾病的84个共同靶点提交至STRING11.5数据库(https: //string-db.org/),生物种类设定为“Homo sapiens”,最小互相作用阈值设定为“medium confidence”(>0.4),构建蛋白相互作用网络图(PPI)。将数据导入Cytoscape3.7.2进行Network analysis分析后，删除无连接节点，根据Degree值大小筛选出核心靶点(Degree值排名前20),包括AKT1、IL-6、VEGFA、TP53、EGFR、ESR1等(图4B)。利用Metascape平台(https: //metascape.org/gp/index.html),物种设置为“Homo sapiens”,对84个交集靶点进行GO功能及KEGG通路富集分析。运用微生信平台(http: //www.bioinformatics.com.cn/)对数据结果进行可视化。GO功能分析共得到与防风通圣散治疗PCOS相关的生物途经(BP)1418条(包括激素反应、细胞对脂质的反应、细胞迁移的正调节、细胞运动的正调节等)、分子功能(MF)119条(包括细胞受体调节器活性、信号受体激活剂活性、转录因子结合、DNA-结合转录因子结合等)、细胞定位(CC)58条(包括膜筏、膜微区、囊泡腔、细胞顶端等)(图5A)。KEGG共富集了170条通路，以P<0.05为条件进行筛选，对前20条结果进行可视化，可见HIF-1、PI3K/AKT信号通路可能是防风通圣散治疗PCOS的重要途经(图5B)。

图3防风通圣散对小鼠血清中E2(A)与FSH(B)水平的影响

1.2.7防风通圣散对PCOS小鼠血清中IL-6与卵巢中VEGFA、AKT水平的影响

按ELISA试剂盒说明书操作，检测各组小鼠血清中IL-6的含量。使用免疫组化法检测卵巢组织中AKT、VEGFA蛋白的相对表达水平，以平均光密度(AOD=积分光密度/面积)作为免疫阳性表达强度的评价标准，免疫组化染色结果见图6。由图7可知：与空白组比较，模型组小鼠血清中IL-6的水平与卵巢中VEGFA的表达均显著上调，卵巢中AKT的表达显著下调(P<0.01);与模型组比较，阳性组与防风通圣散各剂量组小鼠血清中IL-6的水平与卵巢中VEGFA的表达显著下调(P<0.01),阳性组与FTPH组卵巢中AKT的表达显著上调(P<0.01)。

图4交集靶点的韦恩图(A)与蛋白相互作用网络图(B)

图5关键靶点的GO (A)与KEGG (B)富集分析

图6各组小鼠卵巢组织的免疫组化染色图(×40)

图7防风通圣散对小鼠血清中IL-6水平(A)与卵巢组织中AKT(B)、VEGFA(C)表达的影响

1.2.8统计学分析

用SPSS 26.0统计软件进行数据统计分析，计量资料用

表示，多组间比较采用One-way ANOVA分析，组间两两比较采用LSD检验，方差不齐用T2检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2、讨论

中医学认为多囊卵巢综合征(PCOS)病位在肾、脾、肝，肾精亏虚与痰淤互结为该病的核心病机[7]。防风通圣散出自金元四大家刘完素《黄帝素问·宣明论方》,方中防风、荆芥、薄荷、麻黄轻浮升散，解表散寒，使风热从汗出而散之于上；大黄、芒硝破结通幽，栀子、滑石降火利水，使风热从便出而泄之于下；桔梗、石膏清肺泻胃；川芎、当归、芍药和血补肝；黄芩清中上之火；连翘散结血凝；甘草缓峻而和中；白术健脾而燥温；诸药合用，上下分消，表里交治，共奏发汗达表、疏风退热之功。该方虽无补肾之功，但却切合PCOS痰淤互结、邪郁化热的病机。文中证实了防风通圣散能抑制来曲唑与高脂饲料引起的PCOS模型小鼠空腹血糖升高，升高血清中雌二醇、促卵泡激素的水平，减少囊状扩张卵泡与闭锁卵泡的数量，增加卵巢黄体的数量与颗粒细胞层厚度，提示防风通圣散能有效改善PCOS小鼠性激素的分泌及卵巢组织的形态。PCOS患者的白介素-6(IL-6)水平显著增加与慢性炎症密切相关，一方面，长期的激素、糖脂代谢异常导致患者本身存在T、B淋巴细胞调节紊乱；另一方面，炎症刺激单核细胞从而分泌过多的IL-6。PCOS患者临床表现出PI3K/AKT/GLUT4通路的抑制，从而导致葡萄糖吸收障碍，引起胰岛素抵抗[8]。PCOS患者的卵巢血管生成异常表现为卵巢间质血管化增加和血管内皮生长因子(VEGF)等促血管生成因子上调。通过抑制卵巢VEGF的表达，可部分恢复PCOS大鼠小卵泡的积累，减少囊肿形成，改善排卵和卵泡发育[9]。综上，防风通圣散可有效改善激素紊乱与卵巢损伤，其机制与调控AKT、IL-6、VEGF的表达有关。文中研究为防风通圣散治疗PCOS的开发利用提供了依据。

参考文献:

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[7]崔佳,丛培玮,吴兆利.多囊卵巢综合征从痰瘀论治的理论探析及临床应用[J].中国医药导报,2022,19(34):126-129.

基金资助:国家自然科学基金资助项目(批准号:81660653);甘肃省青年博士基金项目(2021QB-074);甘肃省自然科学基金项目(22JR5RA588);

文章来源:李泉洋,靳英英,杜国辉,等.防风通圣散对多囊卵巢综合征小鼠的治疗作用[J].华西药学杂志,2024,39(05):497-502.