阿尔茨海默病(Alzheimer's disease, AD)是最常见的神经退行性疾病，具有高患病率，高致残率，高致死率的特点。目前AD发病机制不明，既往研究表明，β样淀粉蛋白、过度磷酸化的Tau蛋白、遗传易感性等危险因素在AD的发展中起着重要作用。近年来研究还发现，AD患者早期就已出现大脑Fe2+沉积，这表明脑内Fe2+代谢紊乱及异常沉积可能加剧AD的病理进展[1]。铁死亡是一种铁依赖性的程序性细胞死亡方式，在神经退行性疾病中参与神经炎症的病理过程[2]。一方面，过量Fe2+会通过芬顿反应触发小胶质细胞极化至促炎表型，增加炎性因子分泌[3]。另一方面，Fe2+代谢紊乱可以直接激活神经元内核转录因子-κB信号通路，诱导促炎细胞因子释放[4]。而铁死亡的关键调节剂谷胱甘肽过氧化物酶4(glutathione peroxidase4,GPX4)能通过抑制芬顿反应产生的活性氧等脂质过氧化物，有效抑制炎性因子释放。常春藤皂苷元(hederagenin, HG)是一种天然的植物产物，多项研究证实，其具有抗炎、抗氧化和抗抑郁等多种生物活性[5-7]。特别是其具有穿透血脑屏障的能力，赋予HG在神经系统保护方面的独特潜力[8]。最近研究表明，HG可以通过调控铁死亡缓解心肌缺血再灌注损伤[9]。但其对AD脑中神经元铁死亡影响的研究仍相对缺乏。因此，本研究利用谷氨酸诱导的HT22细胞构建AD体外铁死亡模型，探讨HG对AD脑中海马神经元铁死亡的调控作用及铁死亡引起炎性反应的潜在机制。

1、材料与方法

1.1细胞和试剂

小鼠海马神经元细胞系HT22细胞(武汉普诺赛生物科技有限公司);胎牛血清(以色列Biological Industries公司);谷氨酸(美国MCE公司);HG(上海毕得医药);达尔伯克改良伊格尔高糖培养液(美国gibco公司);0.25%胰酶消化液(美国gibco公司);100 U/ml的青霉素和100μg/ml链霉素(广州Biosharp公司);细胞增殖毒性检测试剂盒(日本Dojindo公司);FerroOrange荧光探针(日本Dojindo公司);二氯荧光黄二乙酸酯荧光探针(日本Dojindo公司),戊二醛固定液(武汉Servicebio公司),线粒体膜电位检测试剂盒(日本Dojindo公司),还原型谷胱甘肽(oxidized glutathione, GSH)和氧化型谷胱甘肽二硫化物(glutathione, GSSG)检测试剂盒(日本Dojindo公司),肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白细胞介素(interleukin, IL)-1β、IL-6的酶联免疫吸附试剂盒(武汉亚科因生物科技有限公司);GPX4(武汉三鹰生物科技有限公司);β肌动蛋白(β-actin,武汉Servicebio公司);羊抗鼠免疫球蛋白G-辣根过氧化物酶(美国Abcam公司);荧光显微镜(日本Olympus公司);细胞培养箱(美国Thermo公司);M5型多功能酶标仪(美国Molecular Devices公司);离心机(美国Thermo公司)。

1.2方法

1.2.1细胞培养与分组

HT22细胞用含10%胎牛血清的达尔伯克改良伊格尔培养液于37℃、5%CO2细胞培养箱中，根据细胞生长情况和密度进行换液和传代。将HT22细胞分为对照组、谷氨酸组和HG组(n=3),对照组的细胞未接受任何处理，谷氨酸组采用35 mmol/L谷氨酸对HT22细胞进行24 h干预，构建阿尔茨海默病铁死亡的体外模型，HG组使用0.5μmol/L的HG与35 mmol/L谷氨酸共同处理细胞24 h。

1.2.2细胞计数试剂盒8评估HT22细胞活性

HT22细胞根据每孔5×103的密度种植于96孔板中。本研究前期添加了不同浓度的谷氨酸(5、6、8、10、15、20、25、30、35 mmol/L,n=10)作用于HT22细胞24 h后发现，35 mmol/L的谷氨酸浓度对细胞具有最佳的刺激效果。将不同浓度的HG(0.5、1、5、10、25μmol/L)与终浓度为35 mmol/L谷氨酸共同作用于HT22细胞(n=7)24 h发现，HG的最佳保护剂量为0.5μmol/L。基于以上发现，本研究将35 mmol/L的谷氨酸作为谷氨酸组的固定处理浓度，并将35 mmol/L的谷氨酸与0.5μmol/L的HG作为HG处理组的固定处理浓度。孵育完成，向每个试验孔中加入10μl细胞计数试剂盒8溶液。再孵育2 h,利用酶标仪在450 nm波长下测定每个试验孔吸光度值，评估细胞相对存活率。

1.2.3 FerroOrange荧光探针检测细胞内Fe2+

采用FerroOrange荧光探针测定细胞内Fe2+水平。把HT22细胞以5×103个/孔的密度种到黑色透明底的96孔板上，分组处理细胞，置入含有1μmol/L的FerroOrange工作溶液，37℃环境下30 min孵育。多功能酶标仪确定各组荧光强度。激发波长为543 nm,发射波长为580 nm。

1.2.4细胞内活性氧检测

HT22细胞以5×104个/孔的密度在24孔板中培养，将二氯荧光黄二乙酸酯荧光探针稀释至1μmol/L,37℃黑暗中孵育30 min,利用荧光显微镜观察细胞形态，用Image J衡量绿色荧光亮度。

1.2.5透射电子显微镜观察细胞的超微结构

HT22细胞以1×106个/孔的密度在6孔板中培养，各组细胞经处理后用戊二醛固定液沉淀固定细胞。电镜下观察各组细胞内线粒体嵴及线粒体膜密度的变化。

1.2.6线粒体膜电位检测

HT22细胞以5×104个/孔的密度在24孔板中培养，各组细胞经处理后用HBSS洗涤2遍，按照试剂盒说明将线粒体膜电位检测试剂(MitoMP Detection Kit)染料稀释后，37℃黑暗中孵育30 min,利用荧光显微技术观察细胞形态。采用Image J软件对红色荧光亮度进行量化分析。

1.2.7细胞内GSH/GSSG比值测定

HT22细胞以1×107个/孔的密度在10 cm培养液培养，各种细胞样本处理后，严格依照试剂盒推荐操作程序进行实验步骤，酶标仪针对每个样本孔在405 nm波长下测量。

1.2.8细胞内炎性因子水平测定

HT22细胞以5×104个/孔的密度在24孔板上培养，经过处理的细胞样本置于1.5 ml离心管中收集，4℃条件下3000 r/min离心10 min。采用酶联免疫吸附法检测细胞上清液TNF-α、IL-1β和IL-6水平。酶标仪在450 nm波长下检测各孔A值，并绘制标准曲线计算各组细胞上清液TNF-α、IL-1β和IL-6水平。

1.2.9 Western blot检测GPX4表达

HT22细胞样品处理流程同上，使用裂解液提取总蛋白，BCA法定量蛋白浓度，将膜用5%脱脂牛奶封固1 h,并与一抗GPX4(1〯1000)在4℃下孵育过夜。将膜与羊抗鼠二抗(1〯5000)一起孵育1 h。Image J软件分析条带密度，β-actin作为内参。

1.3统计学方法

采用GraphPad Prism 9.5.0统计软件，计量资料以表示，采用单因素方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2、结 果

2.1各组细胞内Fe2+水平比较

与对照组比较，谷氨酸组细胞内Fe2+水平明显升高，差异有统计学意义(P<0.01);与谷氨酸组比较，0.5、1.0、2.5μmol/L HG处理的细胞内Fe2+水平明显降低，差异有统计学意义(P<0.01,图1)。

图1各组细胞内Fe2+水平比较

2.2各组细胞内活性氧水平比较

与对照组比较，谷氨酸组细胞内活性氧水平明显升高，差异有统计学意义[(191.50±12.51)vs(27.20±2.26),P<0.01];与谷氨酸组比较，HG组细胞内活性氧水平明显降低，差异有统计学意义[(72.53±8.16)vs(191.50±12.51),P<0.01,图2～4]。

图2对照组

图2～4各组细胞内活性氧×200

图3谷氨酸组

图2～4各组细胞内活性氧×200

图4 HG组

图2～4各组细胞内活性氧×200

2.3各组线粒体形态和功能

与对照组比较，谷氨酸组海马神经元线粒体变小皱缩，线粒体嵴减少，线粒体膜密度有所增加，线粒体膜电位明显降低，差异有统计学意义(P<0.01,图5～10)。

图5对照组

图5～7荧光显微镜观察细胞线粒体膜电位×200

图6谷氨酸组

图5～7荧光显微镜观察细胞线粒体膜电位×200

图7 HG组

图5～7荧光显微镜观察细胞线粒体膜电位×200

图8对照组

图8～10透射电镜所示各组细胞线粒体形态×40000

图9谷氨酸组

图8～10透射电镜所示各组细胞线粒体形态×40000

图1 0 HG组

图8～10透射电镜所示各组细胞线粒体形态×40000

与谷氨酸组比较，HG组海马神经元线粒体变小皱缩情况得到恢复，线粒体嵴较为完整，碎片化现象消失，线粒体膜电位明显升高，差异有统计学意义(P<0.01,图5～10)。

2.4各组细胞抗氧化性和炎性因子水平比较

与对照组比较，谷氨酸组TNF-α、IL-1β、IL-6水平明显升高，GSH/GSSG比值明显降低，差异有统计学意义(P<0.05,P<0.01);与谷氨酸组比较，HG组TNF-α、IL-1β、IL-6水平明显降低，GSH/GSSG比值明显升高(P<0.05,P<0.01,表1)。

表1各组细胞抗氧化性和炎性 因子水平比较

2.5各组细胞内GPX4表达比较

与对照组比较，谷氨酸组细胞内GPX4表达明显降低，差异有统计学意义(1.00±0.02vs0.46±0.04,P<0.01);与谷氨酸组比较，0.5、1.0μmol/L的HG组细胞内GPX4表达明显升高，差异有统计学意义(0.64±0.03、0.59±0.05vs0.46±0.04,P<0.01,图11)。

图11各组细胞内GPX4表达电泳图

3、讨 论

铁死亡与AD的发病机制有着密切的联系。研究表明，高浓度谷氨酸刺激会导致HT22细胞内GSH水平明显降低以及GPX4活性的抑制，细胞内游离Fe2+大量聚集，进而使氧化应激增加和铁死亡出现[10]。在本研究中，与对照组比较，谷氨酸组细胞活性明显降低，细胞内Fe2+水平明显升高，差异有统计学意义，表明谷氨酸促进神经元铁死亡；与谷氨酸组比较，HG组细胞活力明显升高，细胞内Fe2+水平明显降低，差异有统计学意义，提示HG可能对谷氨酸诱导的海马神经元铁死亡起到一定的改善作用。

铁死亡与细胞凋亡及各种形式的坏死和自噬截然不同，其特点是铁依赖的脂质活性氧过量积累，诱发脂质过氧化反应，最终触发细胞死亡[11]。因此，脂质活性氧积累是铁死亡的一个重要指标。正常情况下，线粒体膜电位，即线粒体内外膜间电荷差异，对于维持线粒体执行氧化磷酸化作用、合成三磷酸腺苷等生命活动至关重要。在铁死亡的过程中，线粒体变小皱缩，线粒体膜密度增加，且线粒体嵴断裂，这些变化严重破坏线粒体的正常功能，导致线粒体膜电位下降，进而影响脑部的能量代谢过程[12]。因此，本研究结果发现，与对照组比较，谷氨酸组细胞内活性氧水平明显升高，线粒体膜电位明显降低，差异有统计学意义；与谷氨酸组比较，HG组细胞内活性氧水平明显降低，线粒体膜电位明显升高，差异有统计学意义。证实HG具有减轻Fe2+依赖的脂质活性氧过量堆积，并改善线粒体功能的作用，从而缓解铁死亡的进程。

GSH是一种由谷氨酸，半胱氨酸和甘氨酸组成的三肽，广泛存在于几乎所有生物体细胞中，扮演着多种关键的生理角色[13]。它可以直接清除细胞内大量Fe2+所催化的过氧化物和超氧化物，从而减少Fe2+诱导的氧化应激对细胞造成的损伤[14]。另一方面，GSH作为GPX4的必需辅因子，当细胞内GSH受到影响，会导致GPX4生物合成不足，从而触发铁死亡[15]。因此，GSH在阻止铁死亡的关键环节中发挥着至关重要的作用。通常情况下，GSH以还原态存在，然而在氧化应激的影响下，其会转变为氧化状态。因此GSH/GSSG比值在铁死亡相关研究领域被广泛认为是一项关键指标。本研究中，与对照组比较，谷氨酸组GSH/GSSG比值明显降低，差异有统计学意义；与谷氨酸组比较，HG组GSH/GSSG比值明显升高，差异有统计学意义。通过对GSH/GSSG比值的测定，验证HG对铁死亡过程的抑制作用。

GPX4作为铁死亡过程的核心调控因子，其主要功能是利用GSH作为底物，将多不饱和脂肪酸过氧化物还原为无毒性的多不饱和脂肪，有效防止铁死亡发生[16]。当细胞内GPX4表达下降，将导致过量多不饱和脂肪酸过氧化物无法得到有效清除，进而累积至致命浓度触发铁死亡。研究揭示，GPX4敲除能够诱发铁死亡，并导致前脑神经元发生神经变性[17]。因此，GPX4功能障碍可以视为神经铁死亡的上游因素，恢复GPX4功能已被证明是阻止铁死亡进程的有效策略。铁死亡发生具有明显的炎症促进作用。上调GPX4表达不仅能够通过抑制铁死亡过程，从而防止炎性因子生成，同时GPX4也能直接通过阻断与炎性反应紧密联系的核转录因子-κB信号通路的激活，抑制炎性因子表达。为验证HG对铁死亡诱导炎性因子的影响及作用机制，本研究发现，与对照组比较，谷氨酸组TNF-α、IL-1β、IL-6水平明显升高，GPX4表达明显降低；与谷氨酸组比较，HG组TNF-α、IL-1β、IL-6水平明显降低，GPX4表达明显升高，差异有统计学意义。

本研究虽然在一定程度上揭示了HG对铁死亡及其引发神经炎症抑制作用的机制，但存在一些局限性。首先，本研究使用谷氨酸诱导的HT22细胞模型，其所能模拟的病理状态并不能完全涵盖AD大脑中铁死亡的复杂机制。其次，铁死亡作为一种调控机制复杂的细胞死亡形式，其分子机制的复杂性远超过GPX4信号通路的调控范畴。尽管本研究探讨HG对GPX4的影响，但未能深入研究HG对其他铁死亡相关信号通路及相关蛋白的作用，这会限制对HG调控铁死亡机制全貌的理解。因此，未来的研究需要进一步探索HG对铁死亡相关多个信号通路的调控作用，以更全面地揭示其对AD等疾病的潜在治疗价值。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突

参考文献:

[2]欧阳淑桦,吴燕萍,孙万阳,等.铁死亡主要检测方法及其应用的研究进展[J].药学学报,2022,57(6):1544-1556.DOI:10.16438/j.0513-4870.2022-0276.

基金资助:国家老年疾病临床研究中心开放课题(NCRCG-PLAGH-2022002);科技部重点研发计划子课题(2018YFC1312301);军队后勤保健课题(21BJZ20);解放军总医院新技术新业务扶持项目(XYZ-202108);

文章来源:冯雨欣,王贺冉,胡亚卓,等.常春藤皂苷元通过抑制谷氨酸诱导的铁死亡缓解HT22细胞的炎性反应[J].中华老年心脑血管病杂志,2024,26(10):1221-1225.