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肺泡灌洗液中肺部真菌的鉴定及诊断价值评估

2021-04-06 1746 上传者：管理员

摘要：目的：探讨病理学特殊染色对支气管肺泡灌洗液中肺部真菌的检测与鉴定的能力，并进行真菌分类。方法：收集广州医科大学附属第一医院2018年住院及门诊支气管肺泡灌洗液患者312例。采用病理学特殊染色的方法对312例肺泡灌洗液进行病原学检测及鉴定，同时对照血清学半乳甘露聚糖抗原和真菌1-3-β-D-葡聚糖定量检测结果及组织病理活检结果。结果：病理学特殊染色检测肺泡灌洗液可以鉴定多种真菌、革兰氏阳性菌、抗酸菌及病毒等病原体，与真菌G实验及GM实验相比，其检测真菌的效率更高（P<0.001），并且可以鉴定病原体种类，尤其是真菌种类；对于不易进行组织病理活检的患者，尤其是接受移植患者或者重症肺炎的患者，肺泡灌洗液检测真菌的阳性率更高，并与已有肺活检结果较一致。结论：肺泡灌洗液真菌检测可以作为检测肺部病原菌的方法，进行真菌检测及鉴定。

关键词：
GM实验
病理学特殊染色
真菌G实验
肺泡灌洗液
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随着过去几十年免疫缺陷患者人数的增加，肺部真菌的重要性也越来越大。新兴真菌生物以前被认为是非致病性或极其罕见的病原体，现在被认为在增加侵袭性真菌疾病的发病率中发挥着重要作用，并且在免疫功能低下的宿主中发病率逐年上升，尤其是在肿瘤患者和接受移植的患者中[1,2,3]。肺部真菌感染的临床表现有时候具有不典型性，不易及早发现。有研究发现，未经及时治疗的肺部真菌感染患者的病死率可高达约80%[4]。而作为诊断金标准的真菌培养和组织活检需要7～14d的检出时间，无法及早做出明确诊断并给予及时的治疗，而痰培养的检出率较低，仅为8%～34%[5]，且缺乏特异性的指标。虽然现有抗真菌药物的覆盖范围不断扩大，但由于抗真菌药敏感性差异等原因，导致了相当大的死亡率[6]。因此，及时发现真菌病原体，尽早干预治疗仍是肺部真菌病患者治疗成功的前提。

近年来血清学检测半乳甘露聚糖抗原（glactomannan,GM）和1-3-β-D-葡聚糖（真菌G实验）作为临床常用检测真菌的方法，有着快速、早期、高灵敏度和高特异性的优点[7,8]。近年发现其不能检测所有真菌病原体及其变异型，阴性结果并不能完全排除的真菌感染[9]，因此，其在检测特异性方面仍有一定的局限性。尤其对于重症肺炎及不能接受肺活检的患者，肺泡灌洗液标本简单易行，更能反映病变部位的感染情况。因此，在本研究中，采用病理学沉渣及特殊染色的方法检测支气管肺泡灌洗液（bronchoalveolarlavagefluid,BALF）样本，以评价其对肺部真菌疾病诊断和鉴别病原体的能力及在肺部真菌感染中的诊断价值，以期作为另一检测肺部真菌病的可靠方法。

1、资料与方法

1.1临床资料

收集广州医科大学附属第一医院2018年住院及门诊患者支气管肺泡灌洗液312例。在纤维支气管镜检查时进行，支气管肺泡灌洗术根据指南操作规程进行[10,11]。术中取30ml灌洗液进行回收，回收的灌洗液置于离心管中，送病理中心检测。同时收集相应患者所做的GM实验和真菌G实验结果。

1.2肺泡灌洗液涂片方法

将回收的灌洗液充分震荡，去除血凝块，组织碎块，将标本装入塑料离心管内，600g离心10min，弃上清液，经离心的细胞沉淀用磷酸缓冲盐溶液冲洗2次，在经上述方法离心，弃去上清，用5～10ml磷酸缓冲盐溶液制成细胞悬液，将贴上标签的12ml离心，放到PrepStainTM全自动液基细胞制片机上准备制片，在玻片架上与离心管对应的位置上放入SurePathTMPreCoat玻片，运行制片程序，制片接收后取下载玻片架，倒去沉降室内多余的乙醇，将载玻片移至无水乙醇，放入二甲苯进行透明，封片。

1.3肺泡灌洗液沉渣特殊染色方法

纤维支气管镜肺泡灌洗液刷片由剩余物直接刷检涂片，烘干，固定并进行特殊染色，包括：抗酸染色、六胺银染色、PAS染色，革兰氏染色4种。纤维支气管镜灌洗液刷片是由纤维支气管镜手术直接刷检涂片，经过特殊染色后显微镜下观察，抗酸及革兰氏染液为珠海贝索生物技术有限责任公司生产的染色液，六胺银及PAS染液参照2012年《临床病理学技术》配制[12]。

1.4统计学处理

应用Prism5.0进行统计学处理，计数数据采用[例（%）]表示，采用χ2检验多因素分析，P<0.05为差异有显著性。

2、结果

2.1肺泡灌洗液检测真菌的种类

本研究从临床评估为真菌感染或可能的真菌感染的患者身上获得的样本，共312例，男194例，女118例。病例类型主要包括感染、病因未明、肿瘤、重症肺炎和移植术后等。所有样本均使用病理学涂片特殊染色方法检测病原菌的情况。在所有检测肺泡灌洗液样本中，阳性结果118例，包括真菌（76例，单纯真菌49例，混合菌27例）、细菌（12例）、病毒（4例）、抗酸菌（7例）及混合菌（27例），还包括肺泡蛋白沉积症（4例）及肺含铁血黄素沉积症（4例）。其中混合菌感染27例中包括真菌合并细菌感染19例及真菌合并抗酸菌感染8例。在所有肺泡灌洗液样本检测中发现的真菌包括念珠菌、曲霉菌、马尔尼菲蓝状菌、隐球菌、耶氏肺孢子菌，分别所占比例见表1，其中念珠菌所占比例最高。另外，在特殊染色涂片中发现一些真菌菌丝及孢子，但是由于菌量太少，无法分类。

表1312例肺泡灌洗液检测真菌种类及占比[例（%）]

2.2肺泡灌洗液特殊染色检测方法与真菌G实验及GM实验结果比对

本研究对照了312病例患者的血清GM实验和真菌G实验检测结果，只有216例患进行了血清GM实验检测，有20例阳性结果，阳性比例约9.3%;199例患者进行了真菌G实验检测，其中阳性结果有30例，阳性比例约15.1%。将肺泡灌洗液标本特殊染色结果与其对照，发现病理学特殊染色方法检测的阳性率明显高于GM实验及真菌G实验，差异有显著性（P<0.001）（表2）。

表2肺泡灌洗液病理学检测血清GM实验及真菌G实验情况对比[例（%）]

2.3肺泡灌洗液与肺活检标本检测真菌的比较

肺组织活检标本更能反映组织损伤的真实情况，是疾病诊断的“金标准”，因此，将312例患者肺泡灌洗液的标本与同一患者肺组织活检标本真菌检测情况进行对比（表3），只有50例患者进行了活检，其中有9例活检标本发现真菌，包括曲霉菌、隐球菌、马尔尼菲蓝状菌等真菌。这9例病例，肺泡灌洗液标本进行病理学特殊染色所检测到真菌与活检结果完全一致，更加证明肺泡灌洗液标本病理学检测的准确性。由于患者疾病分类大部分属于重症肺炎、移植术后等类型，无法进行肺活检，所以肺泡灌洗液病原学检测对于这部分患者来说，更能准确反应病变类型及病原学种类，为临床治疗及预后提供较为明确的方向，同时也可防止抗生素及抗真菌药的过度使用。

表3肺泡灌洗液检测与肺活检病理情况对比[例（%）]

3、讨论

病原真菌的准确检测和鉴定可提高肺部真菌病的诊断和治疗水平。一项多中心研究表明[12]，在接受肿瘤化疗、造血干细胞移植的血液肿瘤患者及重症肺炎患者中，确诊和临床诊断侵袭性肺真菌病的发生率分别为2.1%、7.7%，大多数为经验性抗真菌治疗，存在抗真菌药物过度使用情况[13]。尽管在大多数样本中进行了大量的基础性工作，仍无法明确地证明是哪种真菌导致了这种感染。

对于肺部感染的患者，尤其是重症肺炎、移植术后的患者，往往无法取得肺活检标本，无法进行组织病理病原学检测，然而，肺泡灌洗液直接来源于病灶本身，更能反映病情发展的真实情况，较外周血更有意义。另外，术中清除病灶，同时也能帮助诊断感染性疾病，特别是对肺部细菌及真菌感染做出早期及正确判断。肺泡灌洗液病理学特殊染色方法不仅可以检测肺部真菌，同时也可以检测到分枝杆菌、细菌、病毒等[14]。即使在结果中发现少部分真菌菌丝及孢子，无法进一步分类，但也为临床提示了诊断方向。

综上所述，采用肺泡灌洗液标本进行病理学特殊染色方法进行真菌检测，尤其对于癌症患者及接受移植患者，能够更好地寻找病原菌，作为肺部真菌感染的诊断依据。与常规GM实验及真菌G实验相比，病理学特殊染色检测肺泡灌洗液病原菌的结果更加准确、高效，还可以进行真菌的确切分类；与常规肺活检相比，操作简捷，样本获取不宜受限，检测真菌阳性率更高。这种显著的优势能更好地指导临床用药及开展预后评估，是一种较好的真菌检测及鉴定的方法。

参考文献：

[4]程益康.纤维支气管镜灌洗抗真菌药治疗肺部真菌感染的疗效分析[J/CD].中华实验和临床感染病杂志(电子版),2014,(5):664-666.

[8]胡华,杨燕,滕隔玲,等.支气管肺泡灌洗液半乳甘露聚糖抗原检测在肺曲霉病诊断中的价值[J].中华医学杂志,2012(32):2268-2270.

[10]中华医学会呼吸病学分会.支气管肺泡灌洗液细胞学检测技术规范(草案)[J].中华结核和呼吸杂志,2002,25(7):390-391.

[11]中华医学会呼吸病学分会.诊断性可弯曲支气管镜应用指南(2008年版)[J]中华结核和呼吸杂志,2008,31(1):14-17.

[12]梁英杰,凌启波,张威.临床病理学技术[M].北京:人民卫生出版社,2011.

赵瑾,李梦诗,付琳,陈朱城,李龙光,王新华,顾莹莹.肺泡灌洗液中肺部真菌的鉴定及诊断价值评估[J].中国临床医生杂志,2021,49(04):436-439.