骨关节炎（Osteoarthritis,OA）是一种常见的关节退行性疾病，可导致关节发生不可逆转的结构和功能变化，严重者甚至引起残疾和预期寿命缩短[1-2]。目前临床上针对OA的治疗多以缓解疼痛、肿胀等为主，不能阻止疾病进展；而晚期OA患者通常需进行关节置换术来改善，费用昂贵，且会增加患者和社会经济负担，因此亟需寻找新的治疗手段来延缓OA进展。青藤碱（sinomenine,SIN）作为青风藤的主要生物活性成分，具有抗炎、抗氧化和抗肿瘤活性等多种生物学作用，可有效抑制OA软骨退变[3-5]。炎症在OA的发病发展过程中起关键作用。IL-1β、TNF-α、IL-6等是导致关节软骨基质降解和软骨破坏的关键细胞因子，IL-1β可激活Wnt/β-catenin信号通路，导致软骨基质降解，加重OA进展[6-8]。因此，本研究旨在基于Wnt/β-catenin信号通路探讨青藤碱对OA软骨细胞炎症的影响。

1、材料与方法

1.1主要试剂和仪器

正清风痛宁注射液（国药准字Z43020279，湖南正清制药集团股份有限公司）；IL-6、TNF-α ELISA试剂盒（美国SAB）；抗-IL-6、抗-TNF-α、抗-WNT1、抗β-catenin（美国SAB），抗β-actin（中国Affinity），化学发光成像系统（日本Fujifilm）；引物（life tech‐nology公司合成），Bestar TM q PCR RT Kit（德国DBI),Bestar®Sybr Green q PCR mastermix（德国DBI),96孔板（美国life technology)ABI7500荧光定量PCR仪（life technology公司），引物序列如下：

1.2软骨细胞的分离和培养

将出生1～3天的SD大鼠乳鼠处死，浸泡于75%乙醇中10 min消毒，从膝关节的髌韧带旁逐层切开皮肤、脂肪及筋膜，暴露膝关节，尽可能地去除关节囊和软骨周围的软组织和血管，剔出膝关节表面的透明软骨组织，并使用无菌的PBS清洗3～4次。使用无菌眼科镊将软骨组织块移入1.5 m L无菌离心管内，在离心管内加入3～5倍于软骨组织体积量的胰酶，在37°C的恒温摇床上震荡消化30 min，随后以1000 r/min，离心5 min。去除上清液，加入PBS清洗1次后，再次离心去除上清液，将离心管中的膝关节软骨组织移入新的1.5 m L离心管中，剪碎软骨组织至粥样。加入大约3～5倍于粥样软骨组织体积的0.1%II型胶原酶，放置在37°C的恒温摇床上进行震荡消化4～8 h，离心（1000 r/min，离心5 min），去除上清液，然后加入无菌PBS清洗，并离心（1000 r/min,离心5 min），去除上清液，再用含10%胎牛血清和双抗的DMEM/F-12培养基重悬细胞，接种到培养皿中进行原代培养，48～72 h后全量换液去除非贴壁细胞，以后每隔3天进行一次换液，待细胞生长到80%～90%融合时，用胰蛋白酶消化，加入培养液终止消化，轻轻吹打贴壁细胞，移入到离心管中离心（1000 r/min，离心5 min），弃去上清液，加入新鲜培养基形成细胞悬液，接种到培养皿中进行传代培养，每天于显微镜下观察细胞的生长情况，待细胞达到90%融合时重复传代。

1.3 OA体外模型的制备及分组

将上述提取的软骨细胞传代培养第1代至第3代作为实验细胞，经胰酶消化、离心后，保留沉淀，加入含1%青链霉素和10%澳洲胎牛血清的新鲜DMEM-F12培养液重悬沉淀，细胞计数后，按1.3×105/孔的细胞密度接种在6孔板中，每孔加入含1%青链霉素和10%澳洲胎牛血清的新鲜DMEM-F12培养液2 m L，置于培养箱中培养过夜；将上述细胞随机分为Control组、OA组、低浓度青藤碱组（SinLow）、中浓度青藤碱组（Sin-Medium）、高浓度青藤碱组（Sin-High）；通过在软骨细胞中加入IL-1β(10ng/m L）以构建OA体外模型，即软骨细胞炎性损伤模型，在Control组中加入与IL-1β等体积的生理盐水；分别在OA体外模型中加入浓度为50μg/m L、200μg/m L、800μg/m L的青藤碱制备Sin-Low组、Sin-Medium组、Sin-High组，同时在Control与OA组加入与青藤碱等量的生理盐水。

1.4观察指标

1.4.1细胞增殖活性检测

按照前述步骤将软骨细胞消化离心后制备成软骨细胞悬液，并进行细胞计数，按2000个/m L的细胞量接种至96孔板内，每孔加入100μL的细胞悬液，每组可设置3个重复实验孔，放置在37°C恒温培养箱内培养；培养2～4 h后观察细胞的贴壁情况，每孔加入10μL不同浓度的青藤碱或等量生理盐水，于37°C培养箱中培养0 h、24 h、48 h、72 h；后在各孔内加入10μL CCK-8溶液，避免在各孔中产生气泡，以免影响吸光度的检测，加液结束后轻轻敲击96孔板以便混匀，放置培养箱内培养0.5～4 h；打开酶标仪，将96孔板置于机器中，调定比色波长为450 nm，测定各组别的吸光值，根据计算各组别软骨细胞的存活率。

1.4.2酶联免疫分析检测（ELISA)

首先分别稀释IL-6、TNF-α ELISA试剂盒的标准品为1000 pg/m L、500 pg/m L、250 pg/m L、125 pg/m L、62.5 pg/m L、31.2 pg/m L、15.6 pg/m L；标准品稀释液（0 pg/m L）直接作为空白孔，稀释检测溶液A及检测溶液B。分别设标准孔、空白孔、待测样品孔，标准孔7孔同时设置2个复孔共14孔；依次加入100μL不同浓度的标准品。空白孔设置2个复孔，共2孔，加入100μL标准品稀释液；余孔加入待测样品100μL，若多于100μL的样品设置2个复孔，剩余加入复孔中会则出现不足100μL的样品量；酶标板加上覆膜，37℃温育1 h，弃去液体，甩干，不用洗涤；每孔加入检测溶液A工作液100μL，酶标板覆膜，37℃温育1 h，弃去孔内液体，每孔用350μL的洗涤液洗涤，浸泡1～2 min，重复洗板3次；每孔加检测溶液B工作液100μL，酶标板覆膜，37℃温育30min，弃去孔内液体，甩干，洗板5次；每孔加TMB底物溶液90μL，酶标板覆膜，37℃避光显色，显示梯度蓝色；每孔加终止溶液50μL，终止反应，蓝色转为黄色；立即用酶标仪在450 nm波长测量各孔的光密度值（OD值）。

1.4.3 Western blot检测

收集细胞使用总蛋白提取试剂盒从软骨细胞中提取蛋白，并通过BCA蛋白定量试剂盒进行定量，而后将每孔20～25μg装载到十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳，然后电印迹到PVDF膜上。将膜用脱脂奶封闭1 h，并在4℃下与以下合适浓度稀释过的一级抗体孵育过夜：抗IL-6、抗TNF-α、抗Wnt、抗β-catenin和抗β-actin。随后将细胞用PBS中的Tween-20洗涤3次，并与过氧化物酶缀合的山羊抗兔Ig G二抗在37℃温育1 h，然后如上进行另外三次洗涤。暴露于化学发光试剂（ECL试剂盒）后形成膜，利用Image J 6.0软件分析结果。

1.4.4 Real time q PCR

去除上述已干预24 h的各组的旧培养液，加入TRIzol试剂，充分吸取孔板中液体，放置于冰上5min后加入1/5体积的氯仿，剧烈震荡30 s后放置于冰上15 min，在4℃，12000 r/min条件下离心15min；离心后吸取透明上层液，加入等量异丙醇，上下颠倒混匀后在4°C,12000 r/min条件下离心10min；离心后在管底可见少量的白色絮状沉淀，加入75%乙醇清洗沉淀，然后在4℃，7500 r/min条件下离心5 min；保留沉淀并晾干，加入20μL无酶水溶解干燥后的沉淀，测定各组样本OD260/OD280的比值及RNA的浓度。按照逆转录试剂盒配制逆转录总反应体系，进行RNA的逆转录反应；然后按照实时荧光定量PCR反应试剂盒说明书配制反应体系，进行实时荧光定量PCR反应，检测以下基因的表达：IL-6、TNF-α、Wnt和β-catenin。以GAPDH基因的表达水平标准化，分别设计每个基因的引物。测定方法为：从目标基因的Ct值（△Ct）中减去GAPDH的Ct值，并记录重复三次的平均△Ct值。每个基因的相对表达水平使用2△△Ct方法确定。

1.5统计方法

数据采用Graph Pad Prism 8.0软件进行统计学分析，计量资料以均值加减标准差表示，多组间均值比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA），组间两两比较方差齐时采用LSD检验，方差不齐时采用Dunnett's T3检验；以α=0.05为检验水准。

2、结果

2.1 CCK8检测（Cell counting kit)

采用CCK8检测不同浓度青藤碱在不同时间对OA软骨细胞增殖活性的影响。实验结果表明，与Control组相比，OA组软骨细胞增殖活性降低（P<0.05），且具有时间依赖性；在0 h和48 h时，与OA组比较，不同浓度青藤碱组在0 h和48 h内软骨细胞增殖活性改变不明显，差异无统计学意义（P>0.05）。24 h时，相对于OA组，不同浓度青藤碱组软骨细胞增殖活性升高（P<0.05），且不同浓度组间比较，差异具有统计学意义（P<0.05）。72 h时，相对于OA组，低、中浓度青藤碱组软骨细胞增殖活性升高（P<0.05），高浓度青藤碱组软骨细胞增殖活性升高不明显（P>0.05），见图1。

2.2酶联免疫分析检测

通过酶联免疫分析检测各组中炎症因子IL-6、TNF-α的表达水平，探讨青藤碱对OA软骨细胞炎症的影响。结果表明，相对于Control组，OA组软骨细胞中IL-6、TNF-α水平升高显著（P<0.05），差异具有统计学意义；与OA组相比较，不同浓度青藤碱均能明显下调IL-6、TNF-α的表达，不同浓度青藤碱组间比较，差异无统计学意义（P>0.05），见图2。

2.3 Western blot检测

通过western blot明确青藤碱对OA软骨细胞炎症因子蛋白和Wnt/β-catenin信号通路的影响。结果发现，与Control组相比较，OA组软骨细胞中IL-6和TNF-α蛋白水平升高（P<0.05）。与OA组相比较，低浓度青藤碱可减少IL-6、TNF-α的表达（P<0.05），中浓度和高浓度青藤碱无明显下调炎症分子蛋白的作用（P>0.05）。相对于Control组，OA组软骨细胞中Wnt/β-catenin信号通路关键蛋白Wnt和β-catenin蛋白表达增多（P<0.05），与OA组相比较，低浓度青藤碱可减少Wnt和β-catenin蛋白表达（P<0.05），中、高浓度青藤碱可降低β-catenin蛋白水平（P<0.05）；而中、高浓度青藤碱无明显下调Wnt蛋白的作用（P>0.05）。提示青藤碱可抑制OA软骨细胞炎症，部分可能与抑制Wnt/β-catenin信号通路有关，见图3。

图1 CCK8检测各组大鼠软骨细胞增殖结果

图2 ELISA检测各组大鼠软骨细胞炎症因子的表达

图3 WB检测各组大鼠软骨细胞炎症和Wnt/β-catenin相关蛋白的表达

2.4 Real time q PCR检测

Real time q PCR检测青藤碱对OA软骨细胞炎症的影响，结果表明：与Control组相比较，OA组软骨细胞中IL-6、TNF-α基因水平升高显著（P<0.05），与OA组相比较，低浓度青藤碱能明显下调TNF-α和IL-6的基因表达（P<0.05），高浓度青藤碱能降低IL-6的基因水平（P<0.05），而中浓度青藤碱无明显下调TNF-α和IL-6的基因表达的作用（P>0.05），不同浓度青藤碱组间比较，差异具有统计学意义（P<0.05）。同时检测不同组别中Wnt/β-catenin信号通路的关键基因，结果表明：相对于Control组，OA组软骨细胞中Wnt/β-catenin信号通路关键基因Wnt和β-catenin表达升高（P<0.05），与OA组相比较，低浓度青藤碱可减少Wnt和β-catenin基因的表达（P<0.05），中浓度和高浓度青藤碱无明显减少Wnt和β-catenin基因表达的作用（P>0.05）。提示青藤碱可抑制OA软骨细胞炎症，部分可能与抑制Wnt/β-catenin信号通路有关，见图4。

图4 QPCR检测各组大鼠软骨细胞炎症和Wnt/β-catenin相关基因的表达

3、讨论

骨关节炎是一种慢性疾病，发病因素复杂，具体机制尚不明确。近年越来越多的研究表明OA是一种低度炎症性疾病，持续存在的炎症是关节软骨退变的重要驱动因素，炎症促进关节软骨退变和软骨细胞凋亡[9]。TNFα、IL-1β和IL-6是OA关节中三种高表达的炎症因子，OA患者血清中TNF-α、IL-6水平显著升高[10]。软骨细胞是软骨组织中唯一的细胞类型，在持续炎症的刺激下被激活，并产生大量促炎细胞因子和趋化因子如TNFα、IL-1β、IL-6等，从而进一步促进软骨细胞外基质降解和软骨细胞凋亡，在OA的发病进展中起着核心作用[7,11]。此外，软骨细胞还表达多种促炎细胞因子和趋化因子的受体。由此可见，软骨细胞是OA促炎细胞因子的来源和靶标。IL-1β可促进软骨细胞分泌一氧化氮、前列腺素等炎症因子，从而加重炎症反应[8]。本研究采用10 ng/m L的IL-1β诱导大鼠原代软骨细胞构建体外骨关节炎细胞模型，结果显示细胞增殖能力降低、炎症因子表达升高，提示骨关节炎细胞模型构建成功。

骨关节炎的临床症状主要表现为疼痛、肿胀、僵硬、关节功能障碍等，由于其发病率逐渐升高，目前已广受关注[12-13]。临床上常以镇痛药、非甾体抗炎药及糖皮质激素等药物治疗OA延缓病情进展，虽可缓解部分症状，但存在一定的副作用。《膝骨关节炎中医诊疗专家共识》提出了膝骨关节炎是一种筋骨共病、痿痹共存的疾病，属中医“痹证”“骨痹”范畴的概念[14]。青风藤作为一种传统中药，味苦，主要用于风湿痹痛、关节肿胀等病症的治疗[15]。正清风痛宁是目前临床上使用较广泛的青风藤相关制剂，主要成分为盐酸青藤碱。青藤碱是青风藤的主要生物活性成分，具有多种生物学功能，如抗炎、阵痛、抗氧化和抗肿瘤活性等，且具有毒副作用较低、价格低廉等优点，对类风湿关节炎有一定治疗作用[3,16-17]。钱鑫等[4]发现青藤碱可降低类风湿性关节炎患者体内炎症因子水平；另有研究表明[18]青藤碱能下调急性肺损伤中TNF-α、IL-6、IL-1β的水平，还可缓解OA患者膝关节疼痛、肿胀及晨僵等症状，并显著改善膝关节功能障碍[5]。此外，青藤碱可显著降低兔关节腔滑液中IL-6、PGE2等炎症因子的生成[19]。

软骨细胞是OA促炎细胞因子的来源和靶标，因此抑制软骨细胞炎症可能延缓OA病变。既往研究报道白藜芦醇可显著减少OA炎症因子的表达，缓解关节炎症状[20]。研究表明，汉黄芩素完全抑制IL-1β刺激的OA软骨细胞中的IL-6、COX-2、PGE2等炎症介质的产生[11]。姜黄素可通过抑制软骨细胞释放IL-6，减轻炎症反应，保护软骨细胞，延缓OA软骨退变[21]。但目前鲜有关于青藤碱是否能减轻软骨细胞炎症的研究。因此，本研究通过IL-1β诱导大鼠原代软骨细胞构建体外骨关节炎细胞模型，结果发现青藤碱可抑制减少软骨细胞炎症因子的释放。持续的炎症引起软骨细胞生物学功能的改变，可能与其介导的Wnt/β-catenin、NF-κB、PI3K/Akt等信号通路过度激活或过度抑制有关[22-24]。其中Wnt/β-catenin信号通路可诱发关节炎症、释放分解代谢因子并降解软骨基质，在KOA中起关键作用[25]。通常情况下，Wnt/β-catenin信号通路处于静止状态，当受损伤或刺激时被激活。研究发现可在损伤的滑膜和关节软骨中观察到Wnt/β-catenin信号通路的激活，β-catenin作为Wnt信号通路的重要组成部分，被Wnt家族蛋白激活后进入细胞核内，进一步促进炎性细胞因子的转录表达，参与OA的病理进展[26-27]。总而言之，抑制Wnt/β-catenin信号通路可减轻OA炎症并延缓OA进展。

综上所述，本研究证实了青藤碱可通过抑制Wnt/β-catenin信号通路促进软骨细胞增殖和抑制软骨细胞炎症因子的释放，为临床运用青藤碱治疗OA和探索青藤碱在体内对OA的靶向治疗提供了相关理论基础。但本研究仍存在一些不足，后续将完善动物实验进一步明确青藤碱在体内对OA的影响及具体作用机制在人软骨细胞中进行验证。

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基金资助:广东省中医药局科研项目(20221384);

文章来源:刘结梅,冯杰扬,丁家谊,等.青藤碱对骨关节炎软骨细胞增殖和炎症的影响[J].中医康复,2024,1(11):19-24.