脊髓损伤（spinal cord injury,SCI）是脊柱损伤中最严重的并发症，如不及时治疗，易引起损伤节段以下的肢体功能障碍，给患者带来巨大身心压力、降低其生活质量，SCI还可导致社会经济损失，有效防治SCI成为学术界亟需解决的问题。研究发现，高压氧可以明显抑制与NgR介导信号通路相关m RNA的表达，从而改善受损脊髓周围环境，促进脊髓的生长与修复[1,2]。电针作为传统的中医康复疗法，技术已经趋于成熟和完善。孙忠人等[3]概述了电针在SCI中促神经修复的机制可能为通过负调控轴突生长抑制因子Nogo-A、NgR及OMgp的表达，从而减少胶质瘢痕形成、促进轴突髓鞘化及神经干细胞的分化与再生。虽然电针治疗SCI的研究颇有进展，但其治疗机制仍待讨论，目前未能充分指导实践。就大鼠SCI模型而言，改良的Allen's打击法虽然可保持硬脊膜完整性，防止外源性物质进入SCI区域、脊髓暴露及脑脊液外漏，但其所致的脊髓挫伤模型与半横断损伤模型有着共同缺点，即无法较好地确定SCI区域的新生轴突是由损伤的神经再生而来，还是由部分剩余的正常神经组织代偿而成。与之相对，脊髓全横断模型可准确证明轴突再生及确定最有效的治疗策略[4]。本研究通过督脉电针对大鼠脊髓全横断损伤模型进行干预，通过检测大鼠运动功能及Nogo-A、NgRmRNA和蛋白的表达，探讨督脉电针对SCI后脊髓神经元的保护作用及其可能机制。

1、材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物

选择Wistar大鼠，雌雄各半，体重200～250 g，共60只，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，合格证号[SCXK（京）2021-0011]，批号230504605757。大鼠饲养环境温度控制在20～25℃，予标准配方杆状饲料喂养，自由进食水，动物实验伦理批准编号[YSY-DWLL-2021240]。

1.1.2 试剂与仪器

TUNEL试剂盒（MK1025，美国Bosterbio公司）；DAB试剂盒（ZLI-9563，北京中杉金桥生物技术有限公司）；无水乙醇（B0301002，北京化工厂）；二甲苯（100212，北京化工厂）；石蜡（100211，上海天贺生物）；苏木素（G1004，武汉servicebio公司）；伊红染液（G1005，武汉servicebio公司）；中性树胶（ZLI-9555，北京中杉金桥生物技术有限公司）；RhoA、ROCK、NogoA、NgR抗体（15596-018，美国Thermo公司）；逆转录试剂盒（A5001，美国Promega公司）。显微镜成像系统（日本尼康）；超薄石蜡切片机（德国Leica）；包埋机（武汉俊杰电子有限公司）；PCR仪（美国Biorad公司）；生物信号采集处理器（南京美易科技有限公司）；华佗牌电针治疗仪、华佗牌针灸针（针灸针直径0.25mm、长3 mm，苏州医疗用品有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 SCI模型的建立

戊巴比妥腹腔麻醉（40 mg/kg）大鼠，固定其于实验台，以第9胸椎为中心，常规备皮、消毒、铺巾，在后正中部位切开皮肤、皮下，切口长3 cm左右，确定第9胸椎棘突并切除其椎弓根，暴露第9胸髓背侧后将脊髓横断切除2 mm，生理盐水冲洗后逐层缝合，局部碘伏消毒。大鼠出现双后肢迟缓性瘫痪，表明脊髓全横断损伤模型成功。SCI术后按摩大鼠膀胱以助其排尿，3次/d；青霉素（0.2 m L/kg）腹腔注射预防感染。

1.2.2 分组与干预方法

按随机数字表法将大鼠分为正常对照组、模型组、督脉电针组、高压氧组、高压氧联合督脉电针组，每组12只。正常对照组：只行椎板切除，不造成脊髓损伤，不予任何治疗；模型组：建立SCI模型，未接受督脉电针与高压氧治疗；高压氧组：大鼠造模清醒4 h后置于高压氧舱内，纯氧洗舱15 min，再以0.01 Mpa/min匀速加压直至达到0.2 Mpa为止，稳压30 min，然后间断加纯氧将氧浓度控制在96.5%左右，减压至常压，出舱后放回笼中继续喂养。干预频率为4次/d；督脉电针组：大鼠造模清醒4 h后给予督脉电针干预，选取督脉上的“大椎”、“命门”，频率2 Hz，强度1 m A，干预时间20 min,1次/d，治疗至术后第7天；高压氧联合督脉电针组：予以高压氧联合督脉电针治疗，方法如上所述。

1.2.3 检测指标和方法

1.2.3. 1 标本采集

SCI模型建立后第7天，治疗结束后行Basso Beattie Bresnahan(BBB）评分，再处死各组大鼠。充分显露大鼠心脏，予升主动脉插管处理后剪开右心耳，先以生理盐水冲洗，再灌洗固定，固定液为4%的多聚甲醛，在确保脊髓完整无损的前提下，提取损伤区脊髓组织。（1)HE染色所需切片组织的获得：取脊髓组织长度约1 cm。（2）透射电镜所需组织的获得：以SCI区为中心，分别于近心端及向心端连续取两段脊髓，长宽分别约为1cm、1 mm。（3）免疫荧光所需组织的获得：剥离损伤区域约1 cm的脊髓组织，并将其以甲醇-20℃于玻片上固定。（4)RT-PCR及Western印迹所需组织的获得：快速取得损伤段脊髓组织1 cm左右，在0～4℃高渗透蔗糖溶液中冰冻3 min并通以100%O2，将脊髓组织切成400μm切片，用低钙羟乙基磺酸钠溶液（HSSB）漂洗3次，将切片置于33℃通有95%O2和5%CO2混合气体的Earle's平衡盐溶液中孵育1.5 h，而后移至低钙HSSB并放入盛有Hanks平衡盐溶液的容器中，继续以100%O2处理。在温度为33℃的酶溶液中酶解30 min，样本继续于低钙HSSB溶液中反复漂洗。吹打，以充分分散样本，即可得分散的神经元。

1.2.3. 2 行为学检测

分别于SCI造模术前、术后即刻、术后第1、3和7天应用BBB评分综合评定各组大鼠的运动功能，观察内容如下：早期后肢关节运动情况、中期失调步态、晚期拖着脚趾和躯干失稳等。将实验动物后肢运动分为22个等级，后肢完全瘫痪为0分，活动正常为21分，分数越高对应状况越好。观察人员为熟悉评分标准的非实验人员。

1.2.3.3 TUNEL法检测神经细胞凋亡

采用经典的TUNEL法对大鼠凋亡细胞进行检测，DAB显色，样本置于显微镜下，细胞核呈现为棕褐色说明已凋亡。选5个视野，在镜下数凋亡细胞，在此基础上，进一步确定出阳性率即凋亡指数（AI），为下一环节的分析提供数据支持。

1.2.3. 4 HE染色

将所取脊髓组织用梯度酒精脱水，石蜡切片厚度为3μm。将切片予苏木素染色处理，8 min后用自来水冲洗，继而予盐酸酒精分化处理10 s，并再次予自来水冲洗及伊红染色，时间分别为3 min及30 s。最后冲洗、脱水、透明、封片。冲洗液为自来水，脱水方式为梯度酒精脱水，透明剂为二甲苯，黏合剂为中性树胶。显微镜观察所获损伤区脊髓组织病理变化，放大倍率为物镜下20倍。

1.2.3.5透射电镜观察

将所获脊髓组织予2.5%戊二醛固定过夜，次日在4℃条件下予锇酸固定2 h处理并漂洗后，丙酮梯度脱水，之后以醋酸铀染色4 h，环氧树脂包埋。透射电镜观察并分析神经组织恢复情况。

1.2.3. 6 免疫荧光检测RhoA/ROCK通路变化

将固定的脊髓组织以兔抗大鼠RhoA、ROCK抗体（1800）在低温环境下培养16 h，之后采用准备好的磷酸盐缓冲溶液（PBS）洗涤30 min，再以山羊抗兔IgG抗体（1 700）于室温环境下培养1 h，再次清洗，荧光显微镜检测神经细胞的RhoA/ROCK表达情况。

1.2.3.7凋亡及分化基因检测

分别收集各组107个细胞，缓冲液反复清洗，接着以准备好的TRIzol试剂提取各组细胞总RNA，并进一步逆转录为cD-NA，最后予以PCR扩增。加入目标基因相关引物，用以下引物对Nogo-A、NgR及GAPDH的c DNA进行扩增：上游：Nogo-A(145 bp)5'-TGACACAGAGA AAGAGGACAGAT-3';NgR(168 bp)5'-TGCCGACA TGGGTGTTATGG-3';GAPDH(149bp)5'-ACGGCAA GTTCAACGGCACAG-3'。下游：Nogo-A(145bp)5'-CAGAGACAGCAGCAGGAATAAG-3';NgR(168 bp)5'-TGCCGTGCAGGAAGATTCTC-3';GAPDH(149bp)5'-GAAGACGCCAGTAGACTCCACGAC-3'。RT-PCR反应条件：95℃条件下进行5 min预变性，95℃条件下30 s变性，60℃温度条件下退火处理30 s,72℃温度条件下延伸60 s,35个循环。扩增产物经一定的琼脂糖凝胶电泳后，继续使用高精度凝胶成像仪观察。

收集各组107个细胞，PBS冲洗3次，提取总蛋白并测定蛋白浓度。60μg总蛋白质在10%SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后，电转移至PVDF膜上，5%脱脂奶粉37℃封闭2 h后加入1 1 000稀释的目标蛋白多克隆一抗与膜孵育1 h,TBST洗膜4次，每次15 min；加入1 5 000 HRP标记的二抗和GAPDH,37℃孵育2 h，清洗后，采用ECL试剂盒进行化学发光检测。上述步骤完成后，接着进行X光片压片、显影、定影。采用高分辨率的UVI凝胶成像系统摄像。用Image-Pro Plus 7.0软件分析条带灰度值所得结果。

1.3 统计学处理

应用SPSS16.0系统软件处理，符合正态分布的数据以±s表示。正态分布数据多组间比较采用单因素方差分析，各个实验组的两两比较采用最小显著性差异法LSD-t法，非正态分布数据采用秩和检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1 实验动物模型评估

术中暴露脊髓T9节段，见图1A。脊髓全横断后，大鼠出现双后肢弛缓性瘫痪，0级肌力，行走完全依靠前肢负荷，如图1B所示，提示SCI造模成功，数天后，可以明显的观察到病鼠双后肢弥漫性肌萎缩，精神状态萎靡，从而导致厌食，活动量减少，甚至有部分大鼠在术后1周出现压疮、破溃。

图1 SCI模型的建立

2.2 BBB评分

术前所有大鼠BBB评分为21分，正常对照组大鼠术后评分为21分，其余各组SCI术后大鼠评分为0分，损伤后第1、3、7天评分数据经软件处理后实施组间横向对比，具体情况见表1。模型组评分较对照组降低，差异有统计学意义（P<0.05）；督脉电针组、高压氧组和高压氧联合督脉电针组BBB评分均较模型组升高，且以高压氧联合督脉电针组的升高更明显，存在统计学意义（P<0.05）

表1 各组大鼠BBB评分比较（±s)  

2.3 神经细胞凋亡检测

对提取的损伤区脊髓组织行TUNEL染色，在200×显微镜物镜下观察拍照结果如下（图2）。对照组可观察到较少的TUNEL染色阳性细胞数，而模型组的脊髓灰质区神经细胞染色明显呈阳性，且伴有严重的神经细胞凋亡；相较于模型组，高压氧联合督脉电针组神经细胞染色阳性数偏低，脊髓神经元凋亡指数明显下降[（42.81±5.69）%、（18.37±1.43)%,F=8.329,P<0.05]。

图2 脊髓灰质神经细胞凋亡（200×）

2.4 HE染色结果

在显微镜20倍物镜下观察组织形态变化。与正常对照组比较，模型组灰白质病理性出血、水肿、坏死、空泡样化、退变胶质化，神经元和神经胶质细胞显著减少，白质散乱排列，神经束间隙增加，细胞核固缩，神经细胞肿胀、破裂、溶解，大量神经元死亡，已无明显细胞结构神经轴索通过（图3）。与模型组比较，高压氧联合督脉电针组已经有大量神经元和神经胶质细胞再生，脊髓灰质和白质界限分明，白质中可见大量轴突生长，细胞形态结构完整，细胞核清晰可见（图3C）。

2.5 透射电镜结果

将SCI部位组织通过TEM方法观察，正常对照组神经纤维束整齐排列，并且可看到完整的神经细胞及细胞核，且线粒体形态及数目正常，溶酶体数量较少，无自噬小体。模型组神经纤维束散乱排列，电镜下可观察到形态异常的线粒体，且肿胀明显、细胞质呈空泡化、异常形态的细胞核、溶酶体及自噬小体，且数量较其他两组明显升高。高压氧联合督脉电针组电镜下可观察到肿胀的神经细胞，线粒体形态稍微不规则，核形正常，核内染色质欠均匀。与模型组比较，游离核糖体及溶酶体的数量水平有所下降，见图4。

2.6 RhoA/ROCK表达水平结果

各组与模型组相比较的RhoA、ROCK蛋白表达见图5，模型组脊髓组织RhoA、ROCKⅡ蛋白表达水平明显高于正常对照组（均P<0.05）；经干预后，督脉电针组、高压氧组和高压氧联合督脉电针组大鼠脊髓组织RhoA、ROCKⅡ蛋白表达水平都明显低于模型组（F=34.597、39.230，均P<0.05）。

图3 脊髓组织HE染色（20×）

图4 脊髓组织透射电镜

图5 RhoA、ROCK蛋白的表达   

2.7 Nogo-A、NgR m RNA及蛋白表达结果

经单因素方差分析和LSD-t检验后得出各组间比较的基因及蛋白表达浓度均值（表3、图6），模型组大鼠脊髓组织Nogo-A、NgR的m RNA和蛋白表达水平均明显高于正常对照组（均P<0.05）；治疗后，督脉电针组、高压氧组和高压氧联合督脉电针组大鼠脊髓组织Nogo-A、NgR的m RNA和蛋白表达水平均较模型组明显降低，以高压氧联合督脉电针组的降低更加显著，差异具有统计学意义（F=14.783、21.435、12.370、50.435，均P<0.05）  

表3 各组大鼠Nogo-A、NgR m RNA及蛋白表达水平比较（±s)  

图6 Nogo-A及NgR的蛋白表达   

3、讨论

电针治疗可促进SCI的修复，在临床运用中取得不错的治疗效果，但其分子生物学机制比较复杂，并不十分明确。其可能的机制为促进神经修复、抑制炎症以及改善微环境等[5,6,7]。细胞凋亡是生物体的自然规律，在维持神经内环境稳定中起着重要作用，是SCI的主要诱发因素[8,9]。当中枢神经系统损伤时，神经细胞凋亡在神经功能丧失这一过程中可能起到了主导作用[10,11]。本研究显示，SCI组术后凋亡细胞数明显升高，由此推测SCI过程中存在细胞凋亡。病鼠给予督脉电针干预后，其神经元细胞凋亡得到明显抑制，动物身体恢复更快，这与以往研究结论一致[12]。但对督脉电针激活人类自噬的机制尚未完全阐明，还需进行更深入的探讨。

SCI后，在中枢神经系统髓鞘中有3种主要影响神经轴突再生和修复的髓鞘相关抑制因子，分别是Nogo蛋白、髓鞘相关糖蛋白（MAG）和少突胶质细胞髓鞘糖蛋白（OMgp)[13,14]。拮抗或阻断这些抑制因子的信号通路，可促进中枢神经损伤后的轴突再生。相关抑制因子中以Nogo蛋白作用最为突出，Nogo-A是神经生长抑制因子中最为常见的一种异构体。现代医学研究表明，其受体NgR位于神经元表面，能够与配体Nogo-66结合，从而将信息传输至神经元胞体内，并在下游信号通路的参与下，起到阻止轴突生长的效用[15,16]。一系列研究结果表明，给予电针治疗可以较大程度抑制病鼠脊髓组织中Nogo-A m RNA的水平[10]。近年来的一些研究发现，该方法是通过阻止Nogo-A和NgR的表达来发挥SCI治疗作用[7]。当前比较公认的是对于SCI治疗应争取“三早”原则，即早期用药和手术，及早控制病情[17]。但如何界定“早期”的概念，如何达到早期的治疗，并无确切的判定标准[18]。实验研究方面，动态观察SCI大鼠BBB评分和电针对Nogo-A、NgR时相表达的影响，即时间窗效应，可能是解决如何判定“早期”的途径之一。李启超等[19]构建了脊髓全横断模型，同时设置对照组；之后对病鼠组织进行检测，显示Nogo-A蛋白表达呈递增趋势，两周后达到峰值；对病鼠进行电针治疗后Nogo-A水平显著降低。研究发现，模型组Nogo-A、NgR m RNA等指标水平均有不同程度的升高；经电针治疗后各指标水平均较不予干预的对照组更低。由此推测，电针于SCI恢复期介入疗效可能更佳。这一研究结果与高连军等[20]研究有相同之处。根据以往的临床经验来看，SCI患者早期往往存在多脏器的功能障碍，及早干预有助于缓解病情，但有学者指出术后病情稳定时的疗效可能更理想。尽管高连军等[20]的研究结论是SCI后电针刺激介入的时间越早，治疗效果越好，但从研究报道的具体内容来推断，这一结论有待商榷。根据实际情况，临床上SCI患者通常在手术拆线后接受针灸干预。本文通过构建动物模型，对其进行一系列BBB评分并予以电针治疗，之后检测病鼠Nogo-A、NgR表达水平，发现该疗法在SCI早期介入能够控制病情，但是恢复期介入可能疗效更显著。

参考文献:

[1]梅运运,张建军,王东.高压氧联合Ng R基因沉默骨髓间充质干细胞移植治疗大鼠脊髓损伤[J].中国组织工程研究,2022,26(1):12-19.

[2]谢晓娟,彭慧平,焦泽琦,等.高压氧联合电针治疗对脊髓损伤大鼠Nogo-A及NgR受体的影响[J].中华航海医学与高气压医学杂志,2020,27(3):265-269.

[3]孙忠人,田洪昭,徐思禹,等.电针治疗脊髓损伤机制研究概述[J].针灸临床杂志,2019,35(4):84-88.

[4]谢亮,沈忆新,范志海.大鼠脊髓全横断损伤模型的建立及相关问题[J].脊柱外科杂志,2010,8(6):377-380.

[5]田秀燕,覃业校,朱世婷,等.近五年电针治疗脊髓损伤机制研究进展[J].吉林中医药,2021,41(10):1380-1382.

[6]孙忠人,栾逸先,尹洪娜,等.夹脊电针通过调控细胞死亡治疗脊髓损伤的相关机制研究进展[J].中华中医药杂志,2021,36(4):2213-2215.

[7]付瑞莲,江娇.基于电针治疗脊髓损伤康复疗效的研究进展[J].实用中医内科杂志,2022,36(3):103-106.

[8]王延雷,齐英娜,董春科,等.脊髓减压联合督脉电针对急性脊髓压迫损伤大鼠疗效影响的实验研究[J].中国中医骨伤科杂志,2018,26(2):3-7.

[9]王迪,王德军,魏庆双,等.电针治疗脊髓损伤抗凋亡机制的研究进展[J].针灸临床杂志,2019,35(3):74-76.

[11]齐英娜,谭明生,王延雷,等.补阳还五汤对急性脊髓损伤大鼠内质网应激相关因子影响的研究[J].中国中医骨伤科杂志,2018,26(2):8-12.

[14]李晓宁,梁雪松,吴磊,等.夹脊电针对急性脊髓损伤大鼠脊髓组织微环境Rho-ROCKⅡ通路相关因子的影响[J].针刺研究,2018,43(7):445-449,455.

[17]闵友江,孙洁,贾永忠,等.脊髓损伤大鼠Nogo A､Ng R m RNA和蛋白的时相表达及电针治疗时间窗[J].中国康复理论与实践,2018,24(6):621-628.

[18]张鸥.创伤性脊髓损伤康复治疗最佳介入时间窗观察[J].按摩与康复医学,2021,12(18):24-26,29.

[19]李启超,刘义富,窦静敏,等.督脉电针结合超短波疗法对大鼠脊髓全横断损伤后脑源性神经生长因子和神经轴突生长抑制剂-A表达的影响[J].中国康复医学杂志,2017,32(9):977-983.

[20]高连军,孙迎春,李建军,等.不同时间电针刺激对大鼠脊髓损伤后磁共振弥散张量纤维束成像部分各向异性值均值的影响[J].中国康复理论与实践,2014,20(8):728-735.

基金资助:天津市卫生局中医中西医结合科研课题(2021141);

文章来源:封怡辉,聂统琨,王东.督脉电针和高压氧对脊髓损伤大鼠脊髓神经元的作用机制探讨[J].天津医科大学学报,2024,30(04):343-349.