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中性粒细胞胞外诱捕网在肝衰竭患者中促炎作用研究

2024-04-07 411 上传者：管理员

摘要：目的探讨中性粒细胞胞外诱捕网(NETs)在肝衰竭患者中的促炎作用和NETosis在肝衰竭肝脏炎症反应过程中的致病作用。方法选取2020年10月至2022年2月于武汉大学人民医院就诊的30例肝衰竭患者作为观察组，选取同期体检健康人群30例作为对照组。比较2组受试者的血清生化指标，采用酶联免疫吸附试验法检测血清中NETs标志物髓过氧化物酶(MPO)-DNA水平，采用免疫荧光法检测中性粒细胞中NETs标志物分子MPO和中性粒细胞弹性蛋白酶(NE)水平，采用免疫组织化学染色法检测供肝和肝衰竭患者肝组织中MPO水平。结果观察组凝血酶原活动度、白蛋白水平均低于对照组，观察组中性粒细胞百分比、总胆红素、丙氨酸转氨酶、天冬氨酸转氨酶水平均高于对照组(均P<0.05)。酶联免疫吸附试验结果显示观察组MPO-DNA水平高于对照组[(10.0±2.7)μg/L比(3.4±1.0)μg/L](P<0.001)。免疫荧光结果显示观察组外周血中性粒细胞中NE、MPO表达水平均高于对照组。免疫组织化学染色结果显示肝衰竭患者肝组织中MPO的表达水平高于供肝组织。结论肝衰竭时，中性粒细胞活化产生NETs,并通过NETosis促进肝脏炎症反应，加重肝脏损伤。

关键词：
中性粒细胞胞外诱捕网
炎症
肝细胞功能障碍
肝衰竭
髓过氧化物酶
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肝衰竭是由多种因素引起的严重肝脏损害，可导致肝细胞功能障碍，死亡率高[1],目前针对肝衰竭的内科治疗尚未取得突破性进展。肝衰竭肝脏病理特征常呈现大块或亚大块肝细胞坏死，或桥接肝细胞坏死，肝窦网状支架部分或明显塌陷，并可见大量炎性细胞浸润[2]。研究表明中性粒细胞胞外诱捕网(NETs)介导的中性粒细胞的死亡方式NETosis是炎症反应中关键的细胞死亡方式[3],NETs参与了多种肝病的发生发展过程，包括自身免疫性肝病、急性或慢性肝功能衰竭、酒精相关肝病和门脉高压等[4]。中性粒细胞受刺激活化后，胞质颗粒及核膜溶解，胞核失去分叶状结构后，NETosis关键蛋白中性粒细胞弹性蛋白酶(NE)、髓过氧化物酶(MPO)、肽基精氨酸脱亚氨酶Ⅳ(PAD4)等进核内，可以促进NE、MPO和PAD4的转录和翻译，PAD4入核，核组蛋白被PAD4瓜氨酸化，在中性粒细胞核内协调组蛋白高聚亚氨酸化及染色质去皱，促成细胞质与细胞核含量内容物的融合[5],中性粒细胞细胞膜破裂后，核酸和蛋白混合物释放到胞外形成以网状核酸为骨架、附着大量组蛋白和抗菌蛋白的NETs[6]。NETosis是一种与细胞凋亡和坏死不同的程序性细胞死亡途径，是在没有细胞裂解的情况下发生的[7]。然而，目前针对NETs和肝衰竭联系的研究较少。本研究检测了肝衰竭患者与健康体检者血清、中性粒细胞及肝组织中NETs相关标志物分子NE、MPO的水平，分别检测循环NETs标志物分子和局部NETs形成，研究NETosis在肝衰竭肝脏炎症反应过程中的致病作用，为肝衰竭治疗寻找潜在的靶点和提供科学基础。

1、对象与方法

1.1对象

选取2020年10月至2022年2月于武汉大学人民医院就诊的30例肝衰竭患者作为观察组，其中包括急性肝衰竭9例和慢加急性肝衰竭21例，其中男20例、女10例，年龄(53±10)岁；选取同期体检健康人群30例作为对照组，其中男19例、女11例，年龄(55±8)岁。2组间性别和年龄差异均无统计学意义(均P>0.05),具有可比性。纳入标准：①肝衰竭患者诊断符合《肝衰竭诊治指南(2018年版)》[8];②体检健康人群无肝脏相关疾病史。排除标准：①合并酒精性肝病者；②年龄<18岁或>80岁者；③合并其他类型肝炎病毒或EB病毒感染者；④妊娠妇女；⑤合并其他全身严重疾病或营养不良者；⑥合并肝癌者，确诊或疑诊其他恶性肿瘤者；⑦缺乏相关生化指标检查者；⑧合并感染者。本研究方案经武汉大学人民医院临床研究伦理委员会批准(WDRY2021-K016),所有受试者均已签署知情同意书。

1.2观察指标

①血清生化指标：凝血酶原活动度(PTA)、白细胞计数(WBC)、中性粒细胞百分比(Neu%)、白蛋白、高敏C反应蛋白(hs-CRP)、血清淀粉样蛋白A(SAA)、总胆红素、丙氨酸转氨酶(ALT)和天冬氨酸转氨酶(AST)。②血清NETs标志物MPO-DNA:采用酶联免疫吸附试验法检测血清MPO-DNA的水平，操作步骤按照NETs试剂盒(购自上海江莱生物科技有限公司)说明书进行。③外周血中性粒细胞中NE和MPO:利用人外周血中性粒细胞分离试剂盒(购自天津灏洋华科生物科技有限公司)将受试者血标本中的中性粒细胞分离出来，爬片，待细胞贴壁后，用4.0%多聚甲醛固定30 min, Triton x-100破膜，5.0%牛血清白蛋白封闭30 min,一抗(NE和MPO抗体购自武汉三鹰生物技术有限公司，稀释比例均为1∶100)4℃孵育过夜，第2天在室温下避光孵育二抗1 h,并用荧光染料4,6-联脒-2-苯基吲哚对细胞核进行染色，用荧光显微镜成像。④肝组织MPO:收集供肝和肝衰竭患者肝组织(供肝和肝衰竭患者肝组织均来源于武汉大学中南医院肝移植中心，所有受试者均签署知情同意书),4.0%多聚甲醛固定后常规石蜡包埋，肝组织石蜡切片脱蜡和水合后，在3.0%过氧化氢中孵育以消除内源性过氧化物酶活性，用0.5%牛血清白蛋白室温封闭切片1 h,孵育一抗和二抗，蒸馏水冲洗脱水，光学显微镜下观察切片。

1.3统计学方法

采用SPSS 25.0及Graph Prism 8.0统计软件分析数据。符合正态分布的计量资料以

示，组间比较采用独立样本t检验；非正态分布计量资料以M(Q1,Q3)表示，组间比较采用非参数检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1血清生化指标

观察组PTA、白蛋白水平均低于对照组，Neu%、总胆红素、ALT、AST水平均高于对照组(均P<0.05)。见表1。

2.2 MPO-DNA水平

观察组MPO-DNA水平高于对照组[(10.0±2.7)μg/L比(3.4±1.0)μg/L],差异有统计学意义(t=-12.554,P<0.001)。

2.3外周血中性粒细胞中NE和MPO水平

免疫荧光染色结果显示观察组外周血中性粒细胞中NE、MPO表达水平均高于对照组。见图1。

2.4供肝和肝衰竭患者肝组织中MPO水平

免疫组织化学染色结果显示肝衰竭患者肝组织中MPO的表达水平高于供肝组织。见图2。

3、讨论

肝衰竭是一种可迅速进展为多器官衰竭并危及生命的疾病，临床表现为黄疸、凝血功能障碍和肝性脑病[9]。随着重症监护医学和新兴肝移植的进步，肝衰竭死亡率在近些年中有所下降[10]。然而，对于内科治疗后进展不良的患者，肝移植是唯一有潜在治愈可能的治疗方式[11]。尽管肝移植可以缓解患者病情、改善预后，但受限于肝源紧张和费用昂贵等条件。目前研究表明，NETs在肝脏疾病中起着重要作用，且NETs水平与肝衰竭严重程度呈正相关。因此，深入研究NETs在肝衰竭发病机制中的作用，可为肝衰竭治疗提供潜在的靶点。

表1体检健康人群与肝衰竭患者血清生化指标比较

图1体检健康人群与肝衰竭患者外周血中性粒细胞中弹性蛋白酶和髓过氧化物酶表达情况(4,6-联脒-2-苯基吲哚染色 ×400)

图2供肝和肝衰竭患者肝组织中髓过氧化物酶的表达情况(髓过氧化物酶抗体染色 ×200)

研究表明NETosis的诱因有多种，包括病原体(如细菌、真菌、病毒)、激活的血小板(在Toll样受体4依赖机制中)、抗中性粒细胞胞质抗体以及用于NETs体外研究的人工成分，如肉豆蔻酸酯、细菌脂多糖或钙离子等[12,13]。在肝脏中，位于肝窦中的库普弗细胞和感染后募集到肝脏的中性粒细胞是帮助捕获细菌的两个关键细胞。中性粒细胞是血液中最丰富的白细胞，是炎症的第一反应者，在身体防御以及炎症的消退和愈合中起着重要作用[14]。成熟的中性粒细胞在骨髓中是由粒细胞-单核细胞祖细胞分化而来，释放到循环中后，被招募到无菌或病原体诱导的损伤部位[15]。随后，中性粒细胞表面受体与促炎信号结合，诱导信号级联反应，从而增强中性粒细胞效能[16,17]。正常情况下，激活的中性粒细胞通过吞噬作用内化和降解病原体，来阻止他们吸引更多免疫细胞、释放促进生长和血管生成的介质，以及产生溶解素和保护素来促进炎症消退和组织修复[18],实现宿主对细菌和真菌感染的防御。然而，中性粒细胞也可以通过NETs的形成以及其他免疫细胞的激活来推动炎症过程[19],导致组织损伤并增强免疫反应[20]。

本研究表明，肝衰竭患者血清和肝组织中NETs标志物分子的水平升高，这可能是因为肝衰竭时，肝组织的炎症反应导致白细胞介素4、白细胞介素6、肿瘤坏死因子α、中性粒细胞受体结合的中性粒细胞引诱剂和其他细胞因子的释放。此外，肝窦内皮细胞的通透性较高[21],且中性粒细胞募集到肝窦中无需滚动[22],直接黏附在肝内皮上，都有利于中性粒细胞的扩散。

Muňoz等[23]研究表明胆结石的形成和生长也需要NETs参与，他们还发现通过抑制PAD4或消除活性氧的产生，靶向抑制NETs形成，可有效抑制体内胆结石形成，这为预防胆石症提供了一种可行的治疗方案。近年来，越来越多的研究表明PAD4通过参与基因调控、蛋白质瓜氨酸形成和NETs形成，在癌症进展和患者预后中起关键作用[24]。因此，需要深入研究NETs在肝衰竭发病机制中的作用，并以此作为肝衰竭治疗的潜在靶点，改善肝脏炎症反应，促进肝功能恢复，改善预后。

综上所述，在肝衰竭疾病进展中，激活的中性粒细胞通过释放NETs来促进炎症及免疫反应；积极控制NETs的形成有利于早期预防肝衰竭，并改善肝衰竭时的炎症反应。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突

参考文献:

[8]中华医学会感染病学分会肝衰竭与人工肝学组,中华医学会肝病学分会重型肝病与人工肝学组.肝衰竭诊治指南(2018年版)[J].临床肝胆病杂志,2019,35(1):38-44.

基金资助:国家自然科学基金(82270627)~~;

文章来源:杨世欣,石春霞,郭金,等.中性粒细胞胞外诱捕网在肝衰竭患者中的促炎作用研究[J].中国医药,2024,19(04):554-557.