抗结核药物性肝损伤（anti-tuberculosis druginduced liver injury,ATB-DILI）发病率一直居高不下，我国ATB-DILI发病率约为7.3%[1]。因ATB-DILI发生导致肺结核患者停药，延长了患者治疗时间，增加了患者的治疗负担[2]。如何有效观察ATB-DILI患者的疾病进展，提前干预，减少危重症比例，是目前ATB-DILI研究的热点[3]。本研究从分析ATB-DILI患者血清早期分泌靶向抗原6(early secreting antigen target-6,ESAT-6），基质金属蛋白酶7(matrix metalloproteinase-7,MMP-7）、MMP-9，白介素6(interleukin-6,IL-6）、IL-10,γ-干扰素（interferon-γ,IFN-γ），细胞角蛋白18(cytokeratin-18,CK-18）的表达水平与肝脏病变严重程度的相关性，发现方便快捷的观测指标，判断ATB-DILI发生发展，进一步指导临床治疗。

1、资料与方法

1.1材料

1.1.1试剂

基质金属蛋白酶7、9(MMP-7、9)ELESA试剂盒（货号KE10036、KE10037），均购自美国PROTEINTECH公司。ESAT-6、IL-6、IL-10、IFN-γ、CK-18的ELESA试剂盒购自美国Abnova公司（货号A10022、A10014、A10016、A10017、A10012）。

1.1.2仪器

美国Molecular公司SPECTCA MAX190酶标仪、流式细胞仪、中国阔海科技有限公司KH-TK组织脱水机、海尔集团4℃/-20℃冰箱、Thermo-80℃超低温冰箱、组织漂烘仪、凝胶成像仪、中威有限公司低温离心机等。

1.2研究对象

1.2.1入组人群

回顾性研究纳入患者：2019年1月至2023年1月就诊于昆明市第三人民医院的肺结核患者，其中合并ATB-DILI患者210例设为A组，女性89例，男性121例。年龄22～81岁，中位年龄68.6岁。单纯肺结核患者120例设为B组，组中女性55例，男性65例。年龄20～75岁，中位年龄53.1岁。门诊体检人群50例为对照组，设为C组，组中女性21例，男性29例。年龄19～73岁，中位年龄50.5岁。本研究已通过昆明市第三人民医院伦理委员会审批（201902313）。

1.2.2诊断及排除标准

入组患者抗结核药物性肝损伤诊断标准、肺结核诊断标准及排除标准见表1。

1.2.3 ATB-DILI的严重程度分级

入组患者抗结核药物性肝损伤的严重程度可分为0至5级，分级标准见表2。

1.3研究方法

使用EDTA抗凝管抽取入组人群血液样本，离心机3 500 r/min，离心20 min，取上清，置于-20℃保存备用。ELISA法检测蛋白表达：取10%上清，按各试剂盒说明，在酶标仪上检测ESAT-6、IL-6、IL-10、IFN-γ、CK-18、MMP-7和MMP-9在450 nm处的吸光值。血清ESAT-6、IL-6、IL-10、IFN-γ表达量单位为pg/m L；血清CK-18、MMP-7、MMP-9表达量单位为ng/m L。

表1诊断及排除标准

表2 ATB-DILI的严重程度[4]

1.4统计学处理

用SPSS 26.0分析数据。符合正态分布用均数±标准差表示，单因素方差分析，SNK-q检验进行组间比较，Pearson检验进行相关分析；不符合正态分布用中位数（四分位数）[M(Q1,Q3）]表示，Kruskal-Wallis H秩和检验进行组间比较，Kruskal-wallis单因素ANOVA(k样本）检验进行总体差异比较，Spearman检验进行相关分析。Logistic回归分析危险因素，以P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1 A组、B组、C组3组一般临床数据比较

3组研究对象的性别、体重指数差异无统计学意义（P>0.05),3组年龄比较总体差异有统计学意义（P<0.05),A组患者年龄高于B组、C组，两两比较差异有统计学意义（P<0.05),B与C组年龄差异无统计学意义（P>0.05），见表3。

2.2 3组患者ESAT-6、IL-6、IL-10、IFN-γ、CK-1 8、MMP-7、MMP-9表达水平比较

A、B组ESAT-6、IL-6、IL-10、IFN-γ、CK-18、MMP-7、MMP-9均有不同程度升高，3组比较ESAT-6、IL-10、CK-18、MMP-7、MMP-9的总体差异有统计学意义（P<0.05）。两两比较发现，A组ESAT-6、IL-10、CK-18、MMP-7、MMP-9表达量高于C组，差异具有统计学意义（P<0.05);B组ESAT-6、MMP-7表达量高于C组，差异具有统计学意义（P<0.05);A组IL-10、CK-18、MMP-9表达量高于B组，差异具有统计学意义（P<0.05），见图1。

表3 3组患者一般临床数据比较[M(Q1,Q3）/

2.3 A组年龄、ESAT-6、CK-18、IL-10、MMP-7、MMP-9与肝损伤严重程度的相关性分析

将具有统计学差异的数据进行相关性分析，A组IL-10、MMP-7与肝脏病变严重程度无明显相关关系（IL-10 r=0.161,P=0.364;MMP-7 r=0.153,P=0.298）。A组年龄、ESAT-6、CK-18、MMP-9与肝脏病变严重程度呈正相关（年龄r=0.745,P<0.001;ESAT-6 r=0.923,P<0.001;CK-18 r=0.161,P<0.001;MMP-9 r=0.797,P<0.001），见图2。

图1 A、B、C组患者血清ESAT-6、IL-6、IL-10、IFN-γ、CK-18、MMP-7、MMP-9表达水平比较

图2 A组患者年龄、ESAT-6、CK-18、MMP-9与肝损伤严重程度的关系

2.4多因素回归分析抗结核药物性肝损伤的危险因素

以ATB-DILI为因变量（赋值：未发生=0，发生=1），筛选A组具有统计学意义的6个因子，年龄、ESAT-6、CK-18、IL-10、MMP-7、9纳入多因素模型中进行回归分析，赋值变量见表4。结果证实高龄、ESAT-6与CK-18高表达为ATB-DILI独立危险因素，见表5。

3、讨论

ATB-DILI发病率高严重影响结核病患者的疗效及预后。如何监测ATB-DILI的进展，评估病情严重程度，及早对症治疗，是目前防治结核病、避免耐药结核病发生的重点及难点。

ESAT-6是结核分枝杆菌（mycobacterium tuberculosis,MTB）基因组RDl区基因编码的早期分泌蛋白，是与毒力相关的T细胞蛋白抗原，其T细胞表位覆盖率可达到100%[6]。MTB被巨噬细胞吞噬后，CFP10与ESAT-6可形成异质二聚体（Esx AB）。Esx AB可以抑制吞噬溶酶体融合，利于MTB在宿主细胞内生存，增强致病性MTB的毒力[7]。ESAT-6的含量高低，决定MTB的致病力和侵袭力，独立或协同MTB促进各种炎症因子的分泌及释放[8]。本研究结果显示，ESAT-6高表达，促进细胞炎症反应，可以间接导致ATB-DILI发生发展，并且与ATB-DILI严重程度密切相关（P<0.05）。ESAT-6也是ATB-DILI的独立危险因子，通过动态监测ESAT-6的表达含量，可以提前判断ATB-DILI的严重程度，及早对症治疗，避免严重并发症发生。

有文献[9]报道，老年肺结核患者更易发生重症ATB-DILI，因为老年患者肝肾代谢能力弱，药物排除缓慢，比年轻人更容易发生药物蓄积引起的毒性反应。本研究结果显示，ATB-DILI患者老年占比更高，与单纯肺结核患者及对照组比较，数据具有统计学差异（P<0.05），回归分析显示年龄高于65岁是发生ATB-DILI的独立危险因素，与文献报道结果相符[10]。此外，已有研究表明ESAT-6及CK-18的表达与患者年龄无关[11-13]。因此，需加强对老年肺结核患者的肝功能监测，预判病情并提前保护肝功能，从而预防重症ATB-DILI的发生。

ESAT-6可以调控Th2细胞，增加分泌IL-4和IL-10等炎症因子。IL-10具有免疫调节和抗炎作用，在免疫反应中发挥负调控作用[14]。本研究结果显示，ATB-DILI患者IL-10的分泌增加，而在单纯肺结核患者组及健康对照组中无明显变化（P<0.05）。本研究结果也证实，ATB-DILI患者血清IL-10水平明显上升，IL-10导致的炎症刺激对ATB-DILI具有一定促进作用，也进一步证实ATB-DILI可能为1种多炎症因子刺激等因素导致的炎症反应。

表4 Logistic回归分析变量赋值表

表5 ATB-DILI发生风险因素Logistic回归分析

基质金属蛋白酶家族包括多种蛋白酶，与肿瘤、动脉粥样硬化、炎症等密切相关[15]。MMP-7是1种分泌型蛋白，以酶原形式存在，主要由上皮来源的细胞表达。MMP-9同样是1种蛋白酶，可裂解变性胶原和Ⅳ型胶原。MMP-7、9都与炎症反应相关，促进多种炎症因子表达[16]。MMP-9在启动裂解过程中，可驱使淋巴细胞和白细胞通过淋巴循环和血液循环进入病变局部，导致炎症发生[17-18]。本研究结果显示，肺结核患者MMP-7与MMP-9表达升高，其中MMP-9在ATB-DILI患者中的表达量高于其他2组，与肝损伤严重程度呈正相关关系（P<0.05），提示MMP-9导致的炎症反应能加重肝脏损伤，促进ATB-DILI发生。

细胞因子CK-18是肝脏内主要的中间丝蛋白，是各种肝脏疾病、肝细胞凋亡过程中形态学变化的特征[19]。本研究显示，ATB-DILI患者CK-18表达上调，与肝损伤严重程度密切相关（P<0.05），但在单纯肺结核组及健康对照组中无明显变化。研究结论证实，CK-18仅在肝损伤患者中水平升高，无肝损伤患者无明显未见升高，其表达水平可反映肝损伤严重程度。ESAT-6与CK-18同时也是ATB-DILI的独立危险因子，动态监测ESAT-6与CK-18的表达水平，可以预测ATB-DILI的严重程度（P<0.05）。通过在临床工作中开展2种因子监测，判断病情提前干预，可以避免重症及危重症ATB-DILI发生。

综上所述，关注高龄患者的ATB-DILI发生情况，监测ESAT-6及CK-18、IL-10、MMP-9的表达，尤其是动态监测ESAT-6与CK-18的表达，可以评估ATB-DILI的严重程度，从而预判病情发展并及时治疗，避免因ATB-DILI停药导致的耐药结核病发生，减轻结核病患者的医疗负担及经济负担。

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文章来源:陆霓虹,刘洪璐,陈杨君,等.ESAT-6联合多项检测指标评估抗结核药物性肝损伤严重程度的关系[J].昆明医科大学学报,2024,45(08):52-57.