摘要:目的 检测ESAT-6联合IL-6、IL-10、IFN-γ、CK-18、MMP-7和MMP-9在抗结核药物性肝损伤(ATB-DILI)患者血清中的表达水平,分析上述指标与肝损伤严重程度的相关性,探讨7种因子对ATB-DILI的评估价值。方法 纳入2019年1月至2023年1月就诊于昆明市第三人民医院的肺结核患者,使用ELISA方法检测210例ATB-DILI的肺结核患者(A组)、120例抗结核治疗未发生肝损伤的肺结核患者(B组)及50例健康体检者(C组)血清中的ESAT-6、IL-6、IL-10、IFN-γ、CK-18、MMP-7、MMP-9水平,分析上述指标与肝损伤严重程度的相关性,以及评估肝损伤严重程度的准确性。结果 3组人群一般检查结果比较,A组患者年龄高于B、C组(P <0.05)。与对照组比较,A组血清ESAT-6、IL-10、CK-18、MMP-7和MMP-9表达上调,B组ESAT-6和MMP-7表达上调(P <0.05)。其中,A组CK-18、IL-10和MMP-9的表达量高于B组(P <0.05)。A组的年龄、ESAT-6、CK-18和MMP-9与肝损伤严重程度呈正相关关系(P <0.05)。Logistic回归分析显示,A组患者年龄>65岁、ESAT-6>31.3 pg/m L、CK-18>45.5 ng/m L是ATB-DILI的独立危险因素。结论 高龄患者更易发生ATB-DILI,ESAT-6、CK-18和MMP-9升高与ATB-DILI严重程度有关。年龄>65岁、ESAT-6>31.3 pg/m L、CK-18>45.5 ng/m L是ATB-DILI的独立危险因素,联合检测高龄患者ESAT-6和CK-18表达水平,对预判及评估ATB-DILI严重程度具有较高的临床价值。
抗结核药物性肝损伤(anti-tuberculosis druginduced liver injury,ATB-DILI)发病率一直居高不下,我国ATB-DILI发病率约为7.3%[1]。因ATB-DILI发生导致肺结核患者停药,延长了患者治疗时间,增加了患者的治疗负担[2]。如何有效观察ATB-DILI患者的疾病进展,提前干预,减少危重症比例,是目前ATB-DILI研究的热点[3]。本研究从分析ATB-DILI患者血清早期分泌靶向抗原6(early secreting antigen target-6,ESAT-6),基质金属蛋白酶7(matrix metalloproteinase-7,MMP-7)、MMP-9,白介素6(interleukin-6,IL-6)、IL-10,γ-干扰素(interferon-γ,IFN-γ),细胞角蛋白18(cytokeratin-18,CK-18)的表达水平与肝脏病变严重程度的相关性,发现方便快捷的观测指标,判断ATB-DILI发生发展,进一步指导临床治疗。
1、资料与方法
1.1材料
1.1.1试剂
基质金属蛋白酶7、9(MMP-7、9)ELESA试剂盒(货号KE10036、KE10037),均购自美国PROTEINTECH公司。ESAT-6、IL-6、IL-10、IFN-γ、CK-18的ELESA试剂盒购自美国Abnova公司(货号A10022、A10014、A10016、A10017、A10012)。
1.1.2仪器
美国Molecular公司SPECTCA MAX190酶标仪、流式细胞仪、中国阔海科技有限公司KH-TK组织脱水机、海尔集团4℃/-20℃冰箱、Thermo-80℃超低温冰箱、组织漂烘仪、凝胶成像仪、中威有限公司低温离心机等。
1.2研究对象
1.2.1入组人群
回顾性研究纳入患者:2019年1月至2023年1月就诊于昆明市第三人民医院的肺结核患者,其中合并ATB-DILI患者210例设为A组,女性89例,男性121例。年龄22~81岁,中位年龄68.6岁。单纯肺结核患者120例设为B组,组中女性55例,男性65例。年龄20~75岁,中位年龄53.1岁。门诊体检人群50例为对照组,设为C组,组中女性21例,男性29例。年龄19~73岁,中位年龄50.5岁。本研究已通过昆明市第三人民医院伦理委员会审批(201902313)。
1.2.2诊断及排除标准
入组患者抗结核药物性肝损伤诊断标准、肺结核诊断标准及排除标准见表1。
1.2.3 ATB-DILI的严重程度分级
入组患者抗结核药物性肝损伤的严重程度可分为0至5级,分级标准见表2。
1.3研究方法
使用EDTA抗凝管抽取入组人群血液样本,离心机3 500 r/min,离心20 min,取上清,置于-20℃保存备用。ELISA法检测蛋白表达:取10%上清,按各试剂盒说明,在酶标仪上检测ESAT-6、IL-6、IL-10、IFN-γ、CK-18、MMP-7和MMP-9在450 nm处的吸光值。血清ESAT-6、IL-6、IL-10、IFN-γ表达量单位为pg/m L;血清CK-18、MMP-7、MMP-9表达量单位为ng/m L。
表1诊断及排除标准
表2 ATB-DILI的严重程度[4]
1.4统计学处理
用SPSS 26.0分析数据。符合正态分布用均数±标准差表示,单因素方差分析,SNK-q检验进行组间比较,Pearson检验进行相关分析;不符合正态分布用中位数(四分位数)[M(Q1,Q3)]表示,Kruskal-Wallis H秩和检验进行组间比较,Kruskal-wallis单因素ANOVA(k样本)检验进行总体差异比较,Spearman检验进行相关分析。Logistic回归分析危险因素,以P<0.05为差异有统计学意义。
2、结果
2.1 A组、B组、C组3组一般临床数据比较
3组研究对象的性别、体重指数差异无统计学意义(P>0.05),3组年龄比较总体差异有统计学意义(P<0.05),A组患者年龄高于B组、C组,两两比较差异有统计学意义(P<0.05),B与C组年龄差异无统计学意义(P>0.05),见表3。
2.2 3组患者ESAT-6、IL-6、IL-10、IFN-γ、CK-1 8、MMP-7、MMP-9表达水平比较
A、B组ESAT-6、IL-6、IL-10、IFN-γ、CK-18、MMP-7、MMP-9均有不同程度升高,3组比较ESAT-6、IL-10、CK-18、MMP-7、MMP-9的总体差异有统计学意义(P<0.05)。两两比较发现,A组ESAT-6、IL-10、CK-18、MMP-7、MMP-9表达量高于C组,差异具有统计学意义(P<0.05);B组ESAT-6、MMP-7表达量高于C组,差异具有统计学意义(P<0.05);A组IL-10、CK-18、MMP-9表达量高于B组,差异具有统计学意义(P<0.05),见图1。
表3 3组患者一般临床数据比较[M(Q1,Q3)/
2.3 A组年龄、ESAT-6、CK-18、IL-10、MMP-7、MMP-9与肝损伤严重程度的相关性分析
将具有统计学差异的数据进行相关性分析,A组IL-10、MMP-7与肝脏病变严重程度无明显相关关系(IL-10 r=0.161,P=0.364;MMP-7 r=0.153,P=0.298)。A组年龄、ESAT-6、CK-18、MMP-9与肝脏病变严重程度呈正相关(年龄r=0.745,P<0.001;ESAT-6 r=0.923,P<0.001;CK-18 r=0.161,P<0.001;MMP-9 r=0.797,P<0.001),见图2。
图1 A、B、C组患者血清ESAT-6、IL-6、IL-10、IFN-γ、CK-18、MMP-7、MMP-9表达水平比较
图2 A组患者年龄、ESAT-6、CK-18、MMP-9与肝损伤严重程度的关系
2.4多因素回归分析抗结核药物性肝损伤的危险因素
以ATB-DILI为因变量(赋值:未发生=0,发生=1),筛选A组具有统计学意义的6个因子,年龄、ESAT-6、CK-18、IL-10、MMP-7、9纳入多因素模型中进行回归分析,赋值变量见表4。结果证实高龄、ESAT-6与CK-18高表达为ATB-DILI独立危险因素,见表5。
3、讨论
ATB-DILI发病率高严重影响结核病患者的疗效及预后。如何监测ATB-DILI的进展,评估病情严重程度,及早对症治疗,是目前防治结核病、避免耐药结核病发生的重点及难点。
ESAT-6是结核分枝杆菌(mycobacterium tuberculosis,MTB)基因组RDl区基因编码的早期分泌蛋白,是与毒力相关的T细胞蛋白抗原,其T细胞表位覆盖率可达到100%[6]。MTB被巨噬细胞吞噬后,CFP10与ESAT-6可形成异质二聚体(Esx AB)。Esx AB可以抑制吞噬溶酶体融合,利于MTB在宿主细胞内生存,增强致病性MTB的毒力[7]。ESAT-6的含量高低,决定MTB的致病力和侵袭力,独立或协同MTB促进各种炎症因子的分泌及释放[8]。本研究结果显示,ESAT-6高表达,促进细胞炎症反应,可以间接导致ATB-DILI发生发展,并且与ATB-DILI严重程度密切相关(P<0.05)。ESAT-6也是ATB-DILI的独立危险因子,通过动态监测ESAT-6的表达含量,可以提前判断ATB-DILI的严重程度,及早对症治疗,避免严重并发症发生。
有文献[9]报道,老年肺结核患者更易发生重症ATB-DILI,因为老年患者肝肾代谢能力弱,药物排除缓慢,比年轻人更容易发生药物蓄积引起的毒性反应。本研究结果显示,ATB-DILI患者老年占比更高,与单纯肺结核患者及对照组比较,数据具有统计学差异(P<0.05),回归分析显示年龄高于65岁是发生ATB-DILI的独立危险因素,与文献报道结果相符[10]。此外,已有研究表明ESAT-6及CK-18的表达与患者年龄无关[11-13]。因此,需加强对老年肺结核患者的肝功能监测,预判病情并提前保护肝功能,从而预防重症ATB-DILI的发生。
ESAT-6可以调控Th2细胞,增加分泌IL-4和IL-10等炎症因子。IL-10具有免疫调节和抗炎作用,在免疫反应中发挥负调控作用[14]。本研究结果显示,ATB-DILI患者IL-10的分泌增加,而在单纯肺结核患者组及健康对照组中无明显变化(P<0.05)。本研究结果也证实,ATB-DILI患者血清IL-10水平明显上升,IL-10导致的炎症刺激对ATB-DILI具有一定促进作用,也进一步证实ATB-DILI可能为1种多炎症因子刺激等因素导致的炎症反应。
表4 Logistic回归分析变量赋值表
表5 ATB-DILI发生风险因素Logistic回归分析
基质金属蛋白酶家族包括多种蛋白酶,与肿瘤、动脉粥样硬化、炎症等密切相关[15]。MMP-7是1种分泌型蛋白,以酶原形式存在,主要由上皮来源的细胞表达。MMP-9同样是1种蛋白酶,可裂解变性胶原和Ⅳ型胶原。MMP-7、9都与炎症反应相关,促进多种炎症因子表达[16]。MMP-9在启动裂解过程中,可驱使淋巴细胞和白细胞通过淋巴循环和血液循环进入病变局部,导致炎症发生[17-18]。本研究结果显示,肺结核患者MMP-7与MMP-9表达升高,其中MMP-9在ATB-DILI患者中的表达量高于其他2组,与肝损伤严重程度呈正相关关系(P<0.05),提示MMP-9导致的炎症反应能加重肝脏损伤,促进ATB-DILI发生。
细胞因子CK-18是肝脏内主要的中间丝蛋白,是各种肝脏疾病、肝细胞凋亡过程中形态学变化的特征[19]。本研究显示,ATB-DILI患者CK-18表达上调,与肝损伤严重程度密切相关(P<0.05),但在单纯肺结核组及健康对照组中无明显变化。研究结论证实,CK-18仅在肝损伤患者中水平升高,无肝损伤患者无明显未见升高,其表达水平可反映肝损伤严重程度。ESAT-6与CK-18同时也是ATB-DILI的独立危险因子,动态监测ESAT-6与CK-18的表达水平,可以预测ATB-DILI的严重程度(P<0.05)。通过在临床工作中开展2种因子监测,判断病情提前干预,可以避免重症及危重症ATB-DILI发生。
综上所述,关注高龄患者的ATB-DILI发生情况,监测ESAT-6及CK-18、IL-10、MMP-9的表达,尤其是动态监测ESAT-6与CK-18的表达,可以评估ATB-DILI的严重程度,从而预判病情发展并及时治疗,避免因ATB-DILI停药导致的耐药结核病发生,减轻结核病患者的医疗负担及经济负担。
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基金资助:国家自然科学基金资助项目(81960096);云南省科技厅科技计划项目地方高校联合专项基金资助项目(202001BA070001-134);云南省教育厅科学研究基金资助项目(2023J0916);昆明市科技计划项目重点项目(昆科计字2019-1-N-25318000003253);
文章来源:陆霓虹,刘洪璐,陈杨君,等.ESAT-6联合多项检测指标评估抗结核药物性肝损伤严重程度的关系[J].昆明医科大学学报,2024,45(08):52-57.
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