微氧活性污泥体系是指将溶解氧控制在0.3～1.0 mg/L的生物脱氮体系，它结合了好氧条件下的硝化作用和微氧或厌氧条件下的反硝化作用，从而实现氮的高效去除。微氧活性污泥技术具备曝气能耗低、污泥产量少等优点，但存在启动期较长、脱氮效率难以稳定达标等问题。为了进一步提高微氧活性污泥体系的污染物去除效率，曾有研究人员尝试投加铁元素介导体系的运行[1]。铁元素为微生物生存和繁殖所必需的微量元素，不仅能在废水处理系统中形成铁循环为微生物提供必要的电子传递和能量，而且可以通过降低溶解氧、氧化还原电位以及调控pH等环境因素来提高脱氮效率[2]。研究表明，增加纳米零价铁可提高体系的运行效果，但纳米零价铁具备易团聚、有一定的生物毒性、制备成本较高等缺点。近年来，采用绿色合成法制备的纳米铁(Green-nano iron, G-nFe)在环境影响、生物相容性、经济效益等方面具有明显的优势，获得了广泛关注。葡萄籽中含有大量原花青素、儿茶素、表儿茶素、没食子酸、表儿茶素没食子酸酯等多酚类物质，具有显著的抗氧化性能，是合成G-nFe的优良还原剂。

因此，本文以葡萄籽的多酚提取物制备葡萄籽纳米铁(Grape Seed-nano iron, GS-nFe)并投加到微氧活性污泥床中，构建GS-nFe介导的微氧活性污泥新体系，探究GS-nFe介导微氧活性污泥生物脱氮的性能，明确GS-nFe介导的微氧活性污泥不同生态位功能菌群互生互作机制以及微生物群落演替规律，为GS-nFe介导的微氧活性污泥应用提供理论和技术支撑。

1、实验材料和方法

1.1 实验装置

本研究采用的反应装置为有机玻璃制成的外曝气回流复氧微氧污泥床，有效容积为1.8 L,反应器外部围绕水套保温层，水套保温层内置加热棒使内部的温度维持在30℃。通过蠕动泵将模拟城市污水送入反应器，污水经上升流后，通过反应装置的顶部出水口流入外部出水池，出水池中设置曝气泵实现出水的复氧过程，部分复氧后的水通过回流泵回流至反应器中，剩余水溢流至出水桶排放。

1.2 葡萄籽铁的制备

通过将20 g/L的葡萄籽粉末加热至80℃(1.5 h)制备葡萄籽提取物，同时制备0.1 g/mol FeCl3的溶液。然后，将0.1 g/mol FeCl3以2∶1的体积比添加到20 g/L的葡萄籽提取物溶液中，液体颜色迅速转变为黑色，依据颜色的变化可初步认为生成了Fe0。而后滴加NaHCO3溶液调节pH至7,制备葡萄籽提取物合成的纳米铁(GS-nFe),用去离子水将GS-nFe洗涤并冷冻干燥48 h, 得到GS-nFe粉末。

1.3 实验方法

外曝气回流复氧微氧污泥床的实验污泥取自课题组内长期微氧运行后的活性污泥，反应装置内的污泥的初始混合液悬浮固体(MLSS)和混合液挥发性悬浮固体(MLVSS)浓度分别为6.85 g/L和 3.55 g/L。进水采用模拟城市污水，以无水葡萄糖(C6H12O6)、氯化铵(NH4Cl)、磷酸二氢钾(KH2PO4)分别作为碳、氮、磷源，通过碳酸氢钠(NaHCO3)提供碱度和无机碳源，同时添加氯化钙(CaCl2)和硫酸镁(MgSO4·7H2O)以及1.2 mL/L的微量元素溶液[3],合成的模拟城市污水的NH+4-N浓度为70 mg/L,COD/ NH+4-N为3,具体运行条件如表1所示。

表1 GS-nFe投加实验的反应器运行条件

1.4 分析方法

通过扫描电子显微镜(SEM,LYRA3 XMH)观察材料的微观形貌，结合X射线能谱(EDS,LYRA3 XMH)对材料进行元素成分分析；通过傅里叶变换红外光谱(FT-IR,Spectrum TWO)和X射线衍射(XRD,Aeris)分析材料的物质结构；反应器每两天取进出水水样，并用0.45 μm滤膜过滤后测定。水样的NH+4-N、NO-2-N、NO-3-N均采用国标方法测定；氧化还原电位(ORP)和pH可通过HI5222-02(ROMANIA)测定；通过多参数水质测定仪(连华科技5B-3B)测定COD。

1.5 高通量测序

在第1 d和第67 d, 取适量泥水混合液分别命名为P1和P2,而后于-80℃保存。采用引物338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)进行16S rRNA基因水平的PCR扩增，用Illumina MiSeq(美吉生物)对其进行高通量测序。

2、结果与讨论

2.1 GS-nFe的物化特性

2.1.1 GS-nFe的表观形貌

本文制备的GS-nFe表面形貌如图1所示。结果表明，单个粒径范围在50～300 nm, GS-nFe之间留有间隙，有利于吸附部分污染物。对所制备的 GS-nFe进行半定量分析，如表2所示，依据SEM-EDS的元素含量分析结果可知，构成GS-nFe的化学元素主要为Fe、O和C等元素，其中，Fe含量为33.1%。C和O主要来源于合成样品GS-nFe表面包裹着的多酚以及其他有机物，O也可能来源于铁纳米颗粒与空气中的O2反应而发生的氧化[4]。

图1 GS-nFe的表面形貌分析

表2 GS-nFe的元素含量分析结果

2.1.2 GS-nFe的物质结构分析

图2(a)为GS-nFe的XRD表征结果，从图中可以看出，使用葡萄籽提取物为原材料时，由于制备后样品进行干燥及后续测试等过程无法保证无氧环境，因此，从检测结果来看，无法获得纯Fe0晶相，产物中出现了FeO(OH)(JCPDs: 81-0462)的衍射峰，这说明合成的Fe0发生了部分氧化[5],但是2θ=44.669°、47.397°、49.413°和78.804°处出现了微弱Fe0(JCPDs: 50-1275)的衍射峰，这说明Fe0表面被有机物包裹或在性质上是非晶态的[6]。

图2(b)为绿色合成零价铁的FT-IR光谱。3 500～3 200 cm-1的宽带归因于O—H伸缩振动。1 617 cm-1附近的峰归因于

的伸缩振动，1 353 cm-1附近的峰归因于多酚芳环

的伸缩振动，并且1 114 cm-1附近的峰归因于C—O—C的对称伸缩振动吸收[7]。此结果表明，绿色植物提取物中主要含有的酚类物质具备将Fe3+还原为Fe0的作用[8]。

图2 GS-n Fe的XRD表征和FT-IR能谱

2.2 污染物去除效果的变化

2.2.1 出水Fe浓度的变化

图3为反应器中出水铁元素浓度变化情况，由图3可知，当向反应器内部投加GS-nFe后，反应器的出水总铁含量均迅速提高，随着GS-nFe投加量的倍增，反应器的出水总铁含量却只呈现出小幅度提高的趋势，这表明GS-nFe溶解出的铁离子并未大量富集在反应器的上清液中，而是进入活性污泥中。这是由于制备的GS-nFe的羟基基团可与细胞膜中的磷脂分子相互作用，导致磷脂分子的排列发生变化，从而影响细胞膜的通透性以及流动性，增加了细胞膜外的铁离子进入胞内的含量，从而上清液中的铁离子含量较低。此外，GS-nFe不仅可以取代有机物作为好氧反硝化的电子供体，而且能通过释放Fe2+增加系统中可用于自养反硝化的电子供体数量，介入到微生物生化反应物质与能量代谢过程，从而短时间提高活性污泥中多种功能菌群的生物活性和协同能力[12-13]。

图3 反应器中出水铁元素浓度变化图

2.2.2 氮和碳的去除效果

如图4所示，以C/N=3的条件运行第1 d时，反应器的出水NH+4-N的质量浓度和去除率分别为5.71 mg/L和92.19%,保持良好的脱氮性能。如表3所示，随着运行时间的延长，在阶段Ⅰ后期(11～29 d)反应器的平均出水NH+4-N质量浓度和去除率分别为4.39 mg/L和93.84%,TIN和COD去除率分别维持在68.78%和81.03%。在阶段Ⅱ,当向反应器内投加GS-nFe时，在阶段Ⅱ前期(30～37 d),反应器的平均出水NH+4-N质量浓度和去除率分别为5.29 mg/L和92.69%,TIN去除率维持在68.29%。其中，反应器的出水NH+4-N去除率和出水NO-3-N质量浓度较投加GS-nFe前均呈现小幅度下降的趋势，出水NO-2-N小幅度积累，这可能是由于GS-nFe中的羟基(—OH)具有还原性，作为反应物可直接参与微氧污泥床中硝态氮的还原，降低出水硝态氮的含量，而且GS-nFe被慢性腐蚀后释放出的Fe2+和Fe3+,通过抑制硝化细菌(NB)的生长、促进反硝化细菌(DNB)和厌氧氨氧化菌(AnAOB)的生长以达成此效果。

图4 GS-n Fe对NH+4-N、NO-x-N、TIN和COD去除的影响

表3 各阶段运行期间的出水氮和COD浓度以及去除效率

当GS-nFe的投加量进一步增至240 mg/L时，反应器运行稳定后，在阶段Ⅱ后期(53～67 d),反应器的平均出水NH+4-N质量浓度和去除率分别为7.83 mg/L和89.48%,TIN和COD去除率分别维持在76.24%和79.39%。与前面的运行工况相比，反应器的出水NH+4-N去除率、出水NO-2-N质量浓度和出水NO-3-N质量浓度大幅度降低，TIN的去除率均实现升高，结合COD的变化情况可知，这可能是由于不同浓度GS-nFe的介导不仅可使NO-3-N被还原为NO-2-N和NH+4-N,而且GS-nFe中释放出的Fe2+和Fe3+,通过抑制大部分硝化细菌的活性，并作为电子供体促进自养反硝化菌(ADNB)和异化硝酸盐还原为氨细菌(DNRAB)的脱氮性能，此外，又通过降低溶解氧和氧化还原电位，将系统内调整为适宜的pH条件，利于厌氧氨氧化细菌的生长，从而达到不同菌群的相互协同，实现较高的TIN去除效能[12,14]。

2.2.3 pH和ORP的变化

GS-nFe的添加可能会通过影响pH和ORP来改善相关微生物的生存条件，从而提高生物处理的效率。如图5(a)所示，在反应器运行阶段，进水pH约为7.68。随着反应器内GS-nFe的投加，出水pH呈现先升高后降低的趋势。由于GS-nFe在化学还原过程中，通过产生OH-使系统内的碱度提高[15],因此，初投加GS-nFe时，反应器的pH实现了小幅度的升高。随着GS-nFe的投加，反应器的出水硝酸盐浓度逐渐降低，这是由于去除相同质量的氮时，异养反硝化所需的H+更多，当异养反硝化能力减弱时，其他反硝化途径的贡献率增强，因此消耗H+的过程减少，导致反应体系的pH逐渐降低。在阶段Ⅱ的后期(53～67 d),反应器的平均出水pH降至7.98,出水和进水pH接近，说明中间产物对微生物带来的pH抑制越来越弱，这也解释了微生物活性越来越高[3]。

从微生物学和代谢的方面来分析，在污水生物处理系统中，活性污泥内部微生物丰度占比和优势微生物丰度占比的动态变化与其生存环境的ORP密切相关[16]。如图5(b)所示，在反应器运行阶段，进水ORP值约为-55.3 mV。在阶段Ⅰ后期(11～29 d)反应器的平均出水ORP为-75.24 mV,随后向反应器内投加GS-nFe时，出水ORP逐渐降低，在阶段Ⅱ后期(53～67 d)时，反应器的平均出水ORP降至-85.76 mV。这是由于GS-nFe的投加量会影响ORP,较高的GS-nFe浓度会导致较低的ORP。

图5 反应器的p H和ORP变化情况

2.2.4 微生物菌群结构分析

为了更好的探究GS-nFe对微氧污泥床生物脱氮效能的影响，从菌属水平上进行分析。随着反应系统内GS-nFe的投加，P1和P2内AOB、NOB、AnAOB、DNB等脱氮功能菌属丰度呈现差异性。

在微生物群落属水平上，硝化菌为第二大优势菌属，其丰度占比分别为9.45%(P1)和7.16%(P2),受GS-nFe的影响总丰度占比呈现出下降的现象，但是反应器内硝化菌属Microbacterium和SM1A02的丰度占比受GS-nFe的影响呈升高趋势[18],Microbacterium的丰度占比由0.06%升高至0.08%,SM1A02的丰度占比由0.23%升高至0.34%。此外，反应器内厌氧氨氧化菌属(Candidatus_Brocadia、Candidatus_Kuenenia、Candidatus_Jettenia)的丰度占比受GS-nFe的影响呈升高趋势，AnAOB的总丰度占比由1.98%升高至2.87%。其中，反应器内NH+4-N的去除率均呈降低的趋势。这表明GS-nFe的投加虽然降低了大部分硝化菌属的丰度，但仍有一部分主要降解氨氮的硝化细菌的相对丰度呈现升高的趋势，从而使得硝化效率并未发生大幅度的变化。

反应器中反硝化细菌的相对丰度占比最高，随着GS-nFe的投加，检测到4种厌氧反硝化菌(AnDB)的总相对丰度占比由8.14%增至8.88%。好氧反硝化菌(ADB)的总相对丰度占比也呈升高的趋势，由5.50%增至14.73%,这可能是由于GS-nFe投加后，随着铁离子的释放，不断地利用质子和氧气，改善了系统内的生存环境，使得微氧污泥生物具备更宽泛的生态位，从而反应器内更利于发生好氧反硝化，并且某些厌氧反硝化优势菌也能利用 GS-nFe作为电子供体进行反硝化，进而强化生物脱氮能力[19-20]。在样品中共检测到6种自养反硝化菌，4种铁自养反硝化细菌，Thiobacillus为铁氧化细菌，能进行铁(硫)自养反硝化，其相对丰度占比为0.48%(P1)和0.25%(P2),Brevundimonas和Acidovorax是参与铁自养反硝化的主要菌属[21],Brevundimonas的丰度占比由0.05%增至0.26%,铁自养反硝化细菌相对丰度的不同变化趋势，表明能够利用GS-nFe为电子供体进行反硝化的微生物在铁自养反硝化过程中的适应性不同[22]。与自养反硝化菌的变化趋势相反，异养反硝化菌(HDNB)的总相对丰度占比为9.86%(P1)和4.72%(P2),呈现下降的现象。Gemmobacter作为异养反硝化菌属，具备将有机物转化为小分子含碳化合物的功能[18,23],而其丰度占比的降低致使其余异养反硝化菌属丰度占比的降低，其中，Denitratisoma作为典型反硝化菌属，其丰度占比则呈现出升高趋势，由1.83%增至1.97%。

随着GS-nFe的投加，在样本中检测到的反硝化聚磷菌(DPAOs)的总丰度占比没有显著变化。norank_f_norank_o_C10-SB1A能够参与异化硝酸盐还原为氨反应(DNRA)[14],其相对丰度占比为1.59%(P1)和3.02%(P2),得到了升高，此菌属可能和好氧反硝化菌、铁自养反硝化菌以及某些异养反硝化菌属共同降解NO-3-N,从而使得反应器内出水NO-3-N的含量显著降低。unclassified_f_Enterobacteriaceae在氨态氮代谢中起着不可或缺的作用[24],其相对丰度占比由0.45%增至0.98%,此菌属丰度占比的变化可能对氨氮去除率并未大幅度降低起着必不可少的作用。另外，反应器内norank_f_norank_o_norank_c_Sumerlaeia的相对丰度占比实现了倍增，由1.86%倍增至3.09%,但此菌属的功能却有待探讨。从微生物的菌群结构变化情况来看，总无机氮效率的提高在于硝态氮含量的大幅度降低，而反硝化效率的提高则主要归功于多种功能菌群的协同，在微氧条件下，体系在适应GS-nFe的介导之后，最终都能达到不同菌群相互协同，实现较高的TIN去除效能。

3、结论

GS-nFe单个粒径范围在50～300 nm, 具备孔隙结构，有利于吸附部分污染物，XRD的分析结果表明制备出了零价铁，而Fe2+和Fe3+的出现表明合成的零价铁发生了氧化。反应器在投加GS-nFe后，运行效能实现了提高，平均出水NH+4-N、TIN和COD的去除率分别维持在89.48%、76.24%和79.39%。高通量结果表明，GS-nFe的投加使硝化菌属Microbacterium和SM1A02的相对丰度呈现升高的趋势，并且厌氧氨氧化菌属的丰度占比也呈现升高的趋势，由1.98%升高至2.87%;好氧反硝化菌以及Brevundimonas等铁自养反硝化细菌的相对丰度占比也实现了不同程度的升高；此外，异化硝酸盐还原为氨细菌(norank_f_norank_o_C10-SB1A),其相对丰度占比由1.59%增至3.02%,此菌属可能和好氧反硝化菌、铁自养反硝化菌、某些异养反硝化菌和厌氧氨氧化等菌属作为脱氮的主要路径。

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基金资助:山西省应用基础研究计划(20210302124479);中国博士后科学基金资助项目(2023M732570);国家自然科学基金(52270134);中央引导地方科技发展资金项目(YDZJSX2022A008);

文章来源:李文博,张潇,赵博玮,等.葡萄籽纳米铁介导微氧污泥床生物脱氮性能研究[J].现代化工,2024,44(S2):110-115.