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罗氟司特对急性心肌梗死大鼠心肌损伤的影响

2024-02-18 44 上传者：管理员

摘要：目的研究罗氟司特对急性心肌梗死(AMI)大鼠的治疗作用及其可能的作用机制。方法将SD雄性大鼠随机分为假手术组、模型组(AMI)、低剂量实验组(AMI+1 mg•kg-1罗氟司特)、高剂量实验组(AMI+3 mg•kg-1罗氟司特),对照组(AMI+0.9 mg•kg-1倍他乐克),每组10只，连续药物干预10 d后进行AMI造模。造模成功7 d后检测大鼠心功能指标水平，以酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测血清因子水平，以试剂盒检测心肌组织氧化应激相关指标水平，以原位末端标记法(TUNEL)法检测大鼠心肌组织心肌细胞凋亡情况，以蛋白质印迹法检测心肌组织蛋白表达水平。结果假手术组、模型组、低剂量实验组、高剂量实验组和对照组大鼠的左心室射血分数(EF)水平分别为(64.44±3.65)%、(36.12±2.50)%、(41.91±3.92)%、(49.90±2.48)%、(53.28±3.22)%,肌酸激脢同工酶(CK-MB)水平分别为(19.15±0.91)、(77.86±5.92)、(61.58±4.78)、(43.62±4.17)、(39.73±4.08)U•L-1,丙二醛(MDA)含量分别为(2.07±0.23)、(4.57±0.15)、(3.55±0.32)、(2.88±0.27)、(2.46±0.17)nmol•mL-1,TUNEL阳性细胞率分别为(3.96±0.20)%、(16.56±1.82)%、(14.30±0.80)%、(9.73±1.07)%、(7.80±0.56)%,磷酸化腺苷一磷酸活化蛋白激酶(p-AMPK)蛋白相对表达水平分别为1.10±0.09、0.34±0.04、0.59±0.06、0.87±0.05和0.78±0.09,沉默信息调节因子相关酶1(SIRT1)蛋白相对表达水平分别为0.96±0.13、0.33±0.03、0.48±0.06、0.77±0.07和0.69±0.06;模型组的上述指标与假手术组比较，低、高剂量实验组和对照组的上述指标与模型组比较，低、高剂量实验组的上述指标比较，在统计学上差异均有统计学意义(均P<0.05)。结论罗氟司特可能通过激活AMPK/SIRT1通路抑制炎症反应和氧化应激，减轻心肌细胞凋亡改善AMI大鼠心功能。

关键词：
急性心肌梗死
氧化应激
炎症反应
罗氟司特
腺苷酸活化蛋白激酶/沉默信息调节因子相关酶1信号通路
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急性心肌梗死(acute myocardial infarction, AMI)是由冠状动脉疾病引起的心肌急性缺血性坏死，可导致致死性并发症，严重者可导致死亡[1,2]。罗氟司特是一种磷酸二酯酶4抑制药，由于其具有强大的抗炎和免疫调节特性，被用于治疗严重慢性阻塞性肺疾病[3]。本研究通过构建AMI大鼠模型初步探究罗氟司特在AMI中的治疗效果，并探讨其潜在机制。

1、材料与方法

1材料

动物SD雄性大鼠(SPF级),鼠龄6～7周，体质量180～200 g,中国科学院动物研究所提供。动物生产许可证号：SCXK(京)2021-0012。本实验经北京天坛医院伦理委员会批准(伦理批号：YK2023-271D)。

药品与试剂罗氟司特，规格：每瓶10 mg,纯度：≥99%,批号：20221014,上海源叶生物科技有限公司生产；酒石酸美托洛尔片，规格：每片25 mg,批号：20220120,批准文号：国药准字H32025391,阿斯利康制药有限公司生产。肌酸激脢同工酶(creatine kinase-MB, CK-MB)酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)试剂盒，上海梵态生物科技有限公司生产；大鼠心肌肌钙蛋白Ⅰ(cardiac troponinⅠ,cTnⅠ)ELISA试剂盒，超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)试剂盒，丙二醛(malondialdehyde, MDA)试剂盒，均为上海佰利莱生物科技有限公司生产；白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)试剂盒，肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factorα, TNF-α)试剂盒，均为上海钰博生物科技有限公司生产；一步法原位末端标记(terminal-deoxynucleoitidyl transferase mediated nick end labeling, TUNEL)法细胞凋亡检测试剂盒，上海碧云天生物技术研究所生产；裂解的胱天蛋白酶-3(cleaved cysteine aspartate proteinase-3,Cl-caspase-3)、磷酸化腺苷一磷酸活化蛋白激酶(phosphorylation adenosine monophosphate-activated protein kinase, p-AMPK)、AMPK和沉默信息调节因子相关酶1(silencing information regulatory factor-related enzymes 1, SIRT1)一抗，均由美国Abcam公司提供；裂解的胱天蛋白酶-9(cleaved cysteine aspartate proteinase-9,Cl-caspase-9)一抗，上海优宁维生物科技股份有限公司生产；二抗，上海优宁维生物科技股份有限公司生产。

仪器LAT小动物专用高端便携式彩色多普勒超声系统，北京莱艾特科技发展有限公司产品；Revolve Generation 2荧光显微镜，美国Echo公司产品。

2实验方法

2.1模型构建[4]4]

大鼠饲养在SPF动物房中(温度为23～25℃,相对湿度为50%～60%,12 h光暗循环),适应性饲养一周后进行实验。将大鼠进行麻醉(3%戊巴比妥钠，1 mg·kg-1)后，在左侧进行开胸手术，对大鼠冠状动脉左前降支进行结扎(左心耳下1～2 mm)构建心肌梗死模型，并在术后给予8.0×105单位青霉素预防感染(肌内注射，共2 d),术后对大鼠进行心电图监测，根据心电图结果观察各大鼠ST段情况进行模型鉴定。

2.2动物分组与给药方法

适应性喂养1周后，将大鼠随机分为假手术组、模型组、低剂量实验组、高剂量实验组和对照组。低、高剂量实验组大鼠每天灌胃给予1和3 mg·kg-1罗氟司特，对照组每天灌胃给予0.9 mg·kg-1酒石酸美托洛尔片[5]。假手术大鼠根据“2.1”中方法开胸后穿线但不结扎，假手术组和模型组大鼠每天灌胃给予等量0.9%NaCl。连续药物干预10 d后按照“2.1”中方法进行造模，每组10只大鼠。建模成功后7 d检测各组大鼠心功能指标，并大鼠腹主动脉采血后处死大鼠收集心脏组织备用。

2.3动物多普勒超声系统检测心功能相关指标[6]6]

用动物多普勒超声系统对各组大鼠心功能指标进行检测，将超声仪的探头置于各大鼠左心室的乳头肌平面进行检测，记录左心室射血分数(left ventricular ejection fraction, LVEF)、左心室收缩分数(left ventricular fractional shortening, LVFS)、左心室收缩末期内径(left ventricular end-systolic internal diameter, LVIDs)、左心室舒张末期内径(left ventricular end-diastolic internal diameter, LVIDd)指标。

2.4 ELISA法检测血清因子水平[7]7]

各组大鼠检测完心功能指标后，腹主动脉采血，并在室温下静置0.5 h,然后以3 000 r·min-1离心5 min(半径为10 cm),收集血清，然后根据ELISA试剂盒说明书进行操作，检测各组大鼠血清CK-MB、cTnⅠ、IL-1β、TNF-α水平。

2.5试剂盒检测心肌组织氧化应激相关指标[8]8]

取各组大鼠梗死心肌组织并置于冰台上，然后使用0.9%NaCl进行组织匀浆，并根据说明书将组织匀浆与试剂混合后离心10 min,取上清液，然后根据试剂盒操作说明检测梗死心肌组织中SOD和MDA水平。

2.6 TUNEL法检测各组大鼠心肌组织心肌细胞的凋亡情况[9]9]

取各组大鼠心肌组织，用4%多聚甲醛固定后进行常规石蜡包埋并制片(5μm),根据一步法试剂盒操作说明，经脱蜡和水化后加入TUNEL染色液孵育1 h(37℃),然后加入DAPI试剂进行核染色(10 min),结束后封片然后用荧光显微镜观察，并用Image J软件进行计数。

2.7蛋白质印迹法检测心肌组织Cl-caspase-3、Cl-caspase-9、p-AMPK和SIRT1蛋白的表达水平[10]10]

收集各组大鼠心肌组织，加入裂解液提取总蛋白，以二喹啉甲酸法鉴定提取的蛋白浓度后取50μg蛋白进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，结束后转至聚偏二氟乙烯膜并在室温下封闭2 h(5%脱脂奶粉),然后加入Cl-caspase-3(1∶500)、Cl-caspase-9(1∶1 000)、p-AMPK(1∶1 000)、AMPK(1∶1 000)、SIRT1(1∶1 000)一抗试剂，4℃孵育过夜，然后TBST清洗3次后加入二抗(1∶2 000)室温孵育，ECL显影后采集图像并以β-actin为内参进行灰度值分析。

3统计学处理

用SPSS 26.0软件进行统计分析。数据用

表示，2组间比较用独立样本t检验，多组间比较用单因素方差分析。

2、结果

1罗氟司特对心肌梗死大鼠心功能相关指标的影响

低、高剂量实验组分别给予1和3 mg·kg-1罗氟司特，对照组给予0.9 mg·kg-1酒石酸美托洛尔片，假手术组和模型组均给予等量0.9%NaCl。

与假手术组比较，模型组大鼠EF、FS水平均显著降低，LVIDs、LVIDd水平均显著提高(均P<0.05);与模型组比较，低、高剂量实验组和对照组大鼠EF、FS水平均显著提高(均P<0.05),LVIDs、LVIDd水平均显著下降(均P<0.05);与低剂量实验组比较，高剂量实验组大鼠EF、FS水平均显著提高(均P<0.05),LVIDs、LVIDd水平均显著下降(均P<0.05)。结果见表1。

2罗氟司特对心肌梗死大鼠血清相关指标的影响

与假手术组比较，模型组大鼠血清CK-MB、cTnⅠ、IL-1β、TNF-α水平均显著提高(均P<0.05);与模型组比较，低剂量实验组、高剂量实验组和对照组大鼠血清CK-MB、cTnⅠ、IL-1β、TNF-α水平均显著下降(均P<0.05);与低剂量实验组比较，高剂量实验组大鼠血清CK-MB、cTnⅠ、IL-1β、TNF-α水平均显著下降(均P<0.05),见表2。

表1各组大鼠心功能指标的比较

表2各组大鼠血清指标的比较

3罗氟司特对心肌梗死大鼠SOD和MDA水平的影响

与假手术组比较，模型组大鼠SOD水平均显著降低，MDA水平均显著提高(均P<0.05);与模型组比较，低剂量实验组、高剂量实验组和对照组大鼠SOD水平均显著提高，MDA水平均显著下降(均P<0.05);与低剂量实验组比较，高剂量实验组大鼠SOD水平显著提高，MDA水平显著下降(均P<0.05),见表3。

4罗氟司特对心肌梗死大鼠心肌组织心肌细胞凋亡的影响

与假手术组比较，模型组大鼠阳性细胞率及Cl-caspase-3和Cl-caspase-9蛋白相对表达水平均显著提高(均P<0.05);与模型组比较，低剂量实验组、高剂量实验组和对照组大鼠阳性细胞率及Cl-caspase-3和Cl-caspase-9蛋白相对表达水平均显著下降(均P<0.05);与低剂量实验组比较，高剂量实验组大鼠TUNEL阳性细胞率及Cl-caspase-3和Cl-caspase-9蛋白相对表达水平均显著下降(均P<0.05),见表4。

5罗氟司特对心肌梗死大鼠AMPK信号通路的影响

与假手术组比较，模型组大鼠p-AMPK和SIRT1蛋白相对表达水平均显著下降(均P<0.05);与模型组比较，低剂量实验组、高剂量实验组和对照组大鼠SIRT1蛋白相对表达水平均显著升高(均P<0.05);与低剂量实验组比较，高剂量实验组大鼠SIRT1蛋白相对表达水平均进一步显著增加(均P<0.05),见表5。

表3各组大鼠超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)水平的比较

表4各组大鼠心肌细胞阳性细胞率及凋亡蛋白表达的比较

表5各组大鼠心肌组织腺苷一磷酸活化蛋白激酶(AMPK)通路蛋白表达的比较

3、讨论

本研究结果发现，罗氟司特治疗后AMI大鼠心功能指标LVEF、LVFS、LVIDs、LVIDd水平均得到改善。此外，罗氟司特治疗后还显著降低了AMI大鼠血清CK-MB、cTnⅠ水平，提示罗氟司特可显著改善AMI大鼠心功能，说明罗氟司特预处理在AMI发生时具有一定的保护作用[10]。

本研究中，经罗氟司特治疗后，AMI大鼠血清IL-1β、TNF-α炎性因子及MDA水平均显著降低，SOD水平显著提高，且高剂量的罗氟司特对AMI大鼠炎性因子和氧化指标的改善作用优于低剂量组，同时高、低剂量罗氟司特对AMI心肌细胞凋亡率及促凋亡相关蛋白Cl-caspase-3和Cl-caspase-9水平均具有不同程度的抑制作用，提示罗氟司特可通过抑制炎症反应和氧化应激改善AMI大鼠心肌细胞凋亡。

AMPK信号是细胞内的能量传感器，研究表明激活AMPK信号通路可以减少线粒体损伤，AMPK的激活可抑制线粒体分裂，从而阻止线粒体通透性转换孔的打开，有助于细胞存活[11]。本研究中，罗氟司特处理后，AMI大鼠心肌组织中p-AMPK及SIRT1表达均提高，提示罗氟司特治疗后可能通过激活AMPK/SIRT1通路发挥作用。

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文章来源:宋辉,徐玢,郭伟.罗氟司特对急性心肌梗死大鼠心肌损伤的影响[J].中国临床药理学杂志,2024,40(03):383-387.