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直肠癌患者中应用T淋巴细胞亚群检测的价值研究
摘要：目的 研究检测外周血T淋巴细胞亚群对直肠癌患者的临床意义及其与健康人群的差异。方法 随机选取2017年10月至2019年10月该院收治直肠癌患者72例纳入试验组，并选取同期在该院体检的健康者72例纳入对照组，试验组患者采用流式细胞仪，对其外周血T淋巴细胞亚群进行检测，将检测结果与对照组进行对比分析。结果 试验组直肠癌患者外周血CD3+、CD4+水平及CD4+/CD8+低于对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)；试验组CD8+水平明显高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。外周血T淋巴细胞亚群与直肠癌临床病理分期具有内在联系，分期较晚，其CD3+、CD4+水平越低，CD8+水平明显升高。结论 对直肠癌患者外周血进行淋巴癌细胞亚群检测，可以判定患者的免疫功能，有效预测患者预后效果，对直肠癌患者临床治疗有重要的指导意义。
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直肠癌是临床常见的恶性肿瘤，随着人们生活日益富足，社会经济水平提升，直肠癌发病概率呈逐渐增长趋势，对人们的身体健康造成极大威胁[1]。转移是影响直肠癌患者预后的重要因素，而免疫功能对于肿瘤的发展与预后有着重要影响。临床研究发现，肿瘤疾病的发生与肿瘤宿主免疫状况有紧密的内在联系，细胞免疫在机体抗肿瘤免疫中占据着重要地位[2]。
人体外周血的淋巴细胞是机体重要的免疫细胞，主要包括T淋巴细胞、B淋巴细胞、自然杀伤细胞。T淋巴细胞主要表达CD3+，约占健康人外周血淋巴细胞总数的60%～80%;B淋巴细胞主要表达CD19+，约占健康人外周血淋巴细胞总数的15%～20%；自然杀伤细胞主要表达CD3+～CD16+、CD56+，约占健康人外周血淋巴细胞总数的10%～20%。T淋巴细胞及亚群是机体重要的免疫细胞群，在免疫方面起重要作用。根据其表面标记和功能的不同，T淋巴细胞可分为CD3+、CD4+和CD8+亚群。CD3+是所有T淋巴细胞都具有的分化抗原，也是外周血最好的鉴定标准。CD4+是促进B淋巴细胞、T淋巴细胞和其他免疫细胞的免疫分化与增殖，协调细胞间的相互作用；CD8+有抑制各种免疫细胞的功能；CD4+/CD8+比值相对稳定。各种亚群在体内进行免疫应答时相互协同，相互拮抗，以维持免疫应答的相对平衡。平衡一旦失调就会导致免疫功能紊乱，产生一系列的免疫病理变化[3]。研究发现，越来越多的疾病与免疫紊乱有关[4,5]，尤其是在恶性肿瘤中[6,7]。
表1对比对照组与试验组患者外周血T淋巴细胞亚群情况
T淋巴细胞功能变化与肿瘤发展、扩散有相关性特征。本研究对直肠癌患者外周血的T淋巴细胞亚群与健康者进行对比分析，以此了解与掌握直肠癌患者免疫功能变化情况，以期为临床直肠癌患者细胞免疫功能、预后评定提供更多的思路与方法。
1、资料与方法
1.1一般资料
随机选取2017年10月至2019年10月本院收治的直肠癌患者72例纳入试验组，全部患者通过病理确诊为直肠癌。结合国际新TNM分析标准，直肠癌患者展开临床病理分期，其中9例为Ⅰ期，17例为Ⅱ期，26例为Ⅲ期，20例为Ⅳ期；男38例，女34例；年龄34～80岁，平均（58.41±2.46）岁。另选取同期在本院体检的健康者72例纳入对照组，其中男42例，女30例；年龄30～59岁，平均（44.57±1.86）岁。纳入条件：年龄低于80岁；全部受试者没有免疫系统、血液系统疾病或感染性疾病等；全部受试者没有应用过免疫抑制剂相关药物；直肠癌患者未接受放化疗、靶向治疗等；全部受试者与家属知晓此次研究，并签署知情同意书。本研究已通过本院医院伦理委员会批准。
1.2方法
1.2.1检测试剂与设备
T淋巴细胞亚群水平检测采用流式细胞法，仪器为美国BD公司生产的FACS-Calibur流式细胞仪。
1.2.2检测方式
外周血淋巴细胞亚群检测用血均为清晨空腹采集。取肝素抗凝血2mL，运用磷酸盐缓冲溶液（PBS）稀释3～4倍，加入2mL淋巴细胞分离液试管上层。以2000r/min为标准，将血浆与分离液间的单层细胞层吸取出来，加入PBS5倍摇晃均匀；以1500～2000r/min为标准，离心5min，将上清液除去，所得沉淀为单核细胞。取少量PBS液装入带有沉淀物质的试管当中，摇晃均匀，将其置于玻片圈内，快速将其吹干，随即加入BFA固定液，固定30s后，借助PBS冲洗。加入T淋巴细胞亚群单克隆抗体、羊抗鼠免疫球蛋白G(IgG）、碱性磷酸酶-抗碱性磷酸酶抗体（APAAP）复合物与碱性磷酸酶底物显色，每一步都放置于温盒房中30min，确保温盒37℃。利用PBS液洗涤3次，最终将甲基绿染色液复染5min，蒸馏水冲洗干净，将其晾干处理，置于油镜下观察[8]。细胞核呈蓝色，细胞表面呈红色标志物的细胞即为阳性，无红色标志物的细胞即为阴性。
1.3统计学处理
采用SPSS19.0统计学软件处理数据。符合正态分布的计量资料以±s表示，组间比较采用t检验。计数资料以率或构成比表示，组间比较采用χ2检验。P<0.05为差异有统计学意义。
2、结果
试验组直肠癌患者外周血CD3+、CD4+水平及CD4+/CD8+指标水平均低于对照组，差异均有统计学意义（P<0.05）；试验组Ⅳ期CD8+水平明显高于对照组，差异均有统计学意义（P<0.05）。试验组Ⅰ～Ⅳ期CD3+、CD4+、CD8+水平比较，差异均无统计学意义（P>0.05）。试验组Ⅲ期、Ⅳ期CD4+/CD8+水平低于Ⅰ期、Ⅱ期，差异均有统计学意义（P<0.05）。见表1。
3、讨论
人体抗肿瘤免疫机制复杂多变，涉及众多免疫成分，主要以体液免疫、细胞免疫，以及具有免疫调节作用的各个可溶性分析为主。细胞免疫是抗肿瘤免疫的常见形式，体液免疫也占据着诸多地位，其中淋巴免疫细胞表型（CD抗原）是反映其功能的重要标志，可随着疾病的转归发生转化[9,10]。
相关临床研究证明，肿瘤患者经常出现的免疫抑制会根据病情的发展而逐渐加重[11]。直肠癌患者CD3+、CD4+水平及CD4+/CD8+指标均低于健康人，且CD8+水平升高明显，说明细胞免疫功能受到抑制作用影响。直肠癌患者血清中含有抑制淋巴细胞分化繁殖的可溶性免疫抑制因子，以肿瘤细胞生成的PGE2与免疫抑制酸性蛋白等成分为主，其会使淋巴细胞表面的CD3+、CD4+抗原表达降低；CD8+水平升高是以抑制性T细胞增多为主导。CD4+水平降低与CD8+水平升高会对直肠癌患者造成不良影响。直肠癌患者CD4+细胞所释放的白细胞介素-2(IL-2）、γ-干扰素水平降低，血清中可溶性IL-2受体水平明显升高，促使活性减少，免疫监视功能受其影响[12]。
免疫治疗是直肠癌综合治疗的热门话题，其包括肿瘤疫苗、细胞疗法、细胞因子治疗、免疫检查点抑制剂治疗及联合治疗等方法，在临床上已取得一定的疗效[13,14]。肿瘤疫苗如树突状细胞（DC）疫苗，其为负载相应肿瘤抗原的DC，可刺激机体内的肿瘤杀伤性淋巴细胞增殖[15]。细胞疗法又称过继性T细胞疗法，是指收集自体或异体的免疫细胞并在体外扩增，再将T淋巴细胞回输入患者体内，直接杀灭肿瘤细胞，或调动机体的免疫功能抑制肿瘤。细胞因子（如IL-2、γ-干扰素等）是一种能有效激活肿瘤免疫细胞、对抗肿瘤免疫抑制的多效性蛋白，其能激活机体免疫系统杀伤肿瘤细胞和抑制肿瘤细胞增殖，但由于其在发挥治疗作用的同时也会广泛激活免疫系统，进而诱发毒性反应，故目前研究有限[16]。免疫检查点抑制剂治疗是当前直肠癌免疫治疗的热点，如近年来热门的PD-1抗体。免疫检查点是指表达于肿瘤细胞和（或）免疫细胞上的蛋白分子，它们能够调控T细胞的启动/激活过程，诱导T细胞凋亡，抑制活化T细胞功能，而肿瘤细胞则可利用这种对免疫系统的抑制作用来逃避肿瘤微环境（CRC）中免疫细胞的特异性杀伤效应[17]。CRC可分为错配修复功能缺陷或微卫星高度不稳定（dMMR-MSI-H)CRC及错配修复功能完整或微卫星低度不稳定或微卫星稳定（pMMR-MSI-L)CRC。目前，微卫星不稳定性或错配修复基因状态是最佳的疗效预测指标[18,19]，单独使用免疫检查点抑制剂对dMMR-MSI-H的结直肠癌有效，而对pMMR-MSI-L的结直肠癌无效[20]。免疫治疗是直肠癌治疗的热门研究方向，潜力巨大。T淋巴细胞是机体重要的免疫细胞群，能用于监测肿瘤患者的免疫状态，也能为后续的免疫相关治疗提供一定的参考。
本研究结果显示，试验组直肠癌患者外周血CD3+、CD4+水平及CD4+/CD8+指标均低于对照组，差异均有统计学意义（P<0.05）；试验组CD8+水平明显高于对照组，差异有统计学意义（P<0.05）。外周血T淋巴细胞亚群的变化与直肠癌临床病理分期存在内在联系，分期较晚，其CD3+、CD4+水平与CD4+/CD8+指标就相对较低，而CD8+细胞水平相对较高。可见，直肠癌患者免疫功能低于健康人群，其根本原因与肿瘤在发生、发展阶段产生大量免疫抑制因子，对细胞活性造成杀伤。在肿瘤抗原的刺激作用下，脾细胞免疫抑制细胞前体得到进一步激活，从而生成大量的免疫抑制因子，弱化直肠癌患者免疫功能。本研究结果与严明基等[21]的研究结果一致。
综上所述，淋巴细胞及其亚群作为机体重要的免疫细胞群，发挥着重要的免疫作用。对直肠癌患者外周血进行淋巴癌细胞亚群检测，可以判定患者的免疫功能，有效预测患者预后效果，对直肠癌患者临床治疗有重要的指导意义，值得应用推广。
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癌症一直是困扰人们的一大难题，其中由化疗药物引起的心脏毒性是癌症患者死亡的重要原因之一，病死率仅次于复发性恶性肿瘤。所有化疗药物包括靶向药物都有潜在的心脏毒性，表现为亚临床左室功能障碍、充血性心力衰竭、心肌缺血甚至心脏猝死等。蒽环类是目前应用最广泛的一类化疗药物，其代表性药物阿霉素的抗癌作用强，化疗指数高，临床上用于治疗各种实体瘤及血液系统肿瘤。
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尿酸(uric acid, UA)是人体主要代谢产物之一。因此，有必要开发一种有效的分析技术来准确地测定尿酸浓度，并能够对人体中尿酸含量进行实时监测。光谱和色谱分析方法存在操作过程复杂、耗时较长、成本高、不够精确等缺点，在具体使用过程中受到一定程度的限制。电化学传感器[2]因其高效、精确等优点，被认为是一种新兴的、有发展前景的检测方法。
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