龋病是最常见的口腔疾病之一[1],其发生并非由变异链球菌等单一致病菌所致，而是口腔菌群失调的结果[2-3]。频繁的糖摄入被认为是诱发口腔内正常菌群向致龋菌群转变的主要危险因素[4-5]。在各种膳食糖类中，蔗糖已被证明更易导致龋病发生[6-7]。然而目前有关蔗糖刺激作用下健康人群和高龋患者口腔微生物群落的差异研究仍然有限。

唾液作为口腔微生物的主要储存库，已被用作评估龋病风险和监测口腔健康的重要工具[8-9],本研究拟通过高通量测序技术，研究蔗糖刺激作用下无龋人群和高龋患者唾液微生物群落差异，为探索龋病风险因素作用下唾液微生物群的差异提供临床依据。

1、资料与方法

1.1 研究对象

本试验选取2021年1—6月于天津市口腔医院牙体牙髓科就诊的患者及其他经宣传自愿参加的志愿者作为研究对象，研究经天津市口腔医院医学伦理委员会批准(批件号：PH2020-B-013),所有对象知情同意。

纳入标准：①年龄20～40岁；②无全身系统性疾病，无长期服药史；③无口腔不良习惯；④无牙周病、根尖周病、唾液腺疾病及其他口腔黏膜疾病；⑤无肿瘤及感染性疾病史；⑥口内无第三磨牙外的恒牙缺失，无明显错牙合畸形；⑦1个月内未服用抗生素或漱口水，口腔局部未使用抗菌剂、氟化剂；⑧1个月内未接受口腔相关治疗。排除标准：①饮食失调、食物不耐受、药物或食物过敏史；②妊娠期或哺乳期；③采样期间处于生理期；④长期处于紧张、焦虑等精神压力下；⑤参照WHO《口腔健康调查基本方法》第5版中标准，0<龋失补牙数(decayed, missing, filled teeth, DMFT)≤3的低龋患者。

最终纳入研究对象18例，男、女各9例，平均年龄(31.1±2.7)岁。根据龋齿检查结果及病史回顾，收集记录DMFT并进行分组，无龋组(CF组)DMFT=0,高龋组(CA组)DMFT≥4[10]。

1.2 样本采集

样本收集参考文献[11]进行，所有受试者于采样前一晚至采样时不刷牙漱口，采样前至少1 h禁食禁饮。蔗糖处理前收集每位受试者非刺激性唾液2 mL,CF组、CA组样本分别命名为CF.B、CA.B。随后受试者用20%蔗糖溶液进行含漱，每次含漱1 min, 每10 min一次，分别于30 min、2 h后收集唾液样本[12],根据刺激时间将样本分别命名为CF.30M、CA.30M(刺激30 min后)和CF.2H、CA.2H(刺激2 h后)。所有唾液样本收集后立即置于冰上，-80 ℃保存备用。

1.3 DNA提取及16S rRNA基因扩增

采用CTAB/SDS法纯化提取样品的总基因组DNA。定量测定DNA的纯度及浓度。根据浓度，用无菌水将DNA稀释至1 ng/μL。以稀释后的基因组DNA为模板，选用带barcode的特异性引物515F(5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3′)和806R(5′-GGACTACHV GGGTWTCTAAT-3′)(生工生物，中国)扩增16S rDNA的V3～V4高变区。PCR反应体系为Phusion®High-Fidelity PCR Master Mix(NEB,美国)15 μL,引物0.2 μmol/L,模板DNA 10 ng。扩增条件为98 ℃预变性1 min; 98 ℃ 10 s, 50 ℃ 30 s, 72 ℃ 30 s, 循环30次；72 ℃延伸5 min。将等体积的1×上样缓冲液(含SYB Green)与PCR产物混合，在2%琼脂糖凝胶上进行电泳检测DNA。将PCR产物按等比例混合，然后使用Qiagen Gel Extraction Kit(Qiagen, 德国)对混合PCR产物进行纯化。

1.4 Illumina 测序及测序数据处理

使用NEBNext®UltraTMⅡ DNA Library Prep Kit(Cat No.E7645)建库试剂盒进行文库构建，使用Qubit@2.0荧光仪(Thermo Scientific, 美国)和Agilent Bioanalyzer 2100系统对文库质量进行评估。文库合格后，在Illumina NovaSeq平台上对文库进行测序，生成250 bp的成对末端reads。根据barcode序列和PCR扩增引物序列从下机数据中拆分出各样本数据，截去barcode和引物序列后使用FLASH(V1.2.11,http: //ccb.jhu.edu/software/FLASH/)软件对样本的reads进行拼接，得到Raw Tags。随后使用fastp软件(版本0.20.0)对得到的Raw Tags进行质控，得到高质量的Clean Tags。最后使用Usearch软件(版本2.15.0)将Clean Tags与数据库(Silva数据库https: //www.arbsilva.de/)进行比对以检测嵌合体并进行去除，从而得到最终的有效数据即Effective Tags。采用QIIME2软件(版本QIIME2-202006)中的DADA2模块对得到的Effective Tags进行降噪，并过滤掉丰度小于5的序列，从而获得最终的扩增子序列变异(amplicon sequence variants, ASVs)及特征表。随后，使用QIIME2软件中的classify-sklearn模块将得到的ASVs与数据库(Silva databas)比对从而得到每个ASV的物种信息。

1.5 统计学分析

使用R软件(版本3.5.3)进行统计学分析，采用独立样本t检验进行组间比较，P<0.05为差异有统计学意义。采用线性判别分析效应量(Line discriminant analysis(LDA)effect size, LEfSe)方法来估算每个物种丰度对差异效果影响的大小，以LDA score>4.0表示具有显著差异的物种。

2、结果

2.1 一般资料

CF组共8例，男4例，女4例，平均年龄(30.7±3.2)岁；CA组10例，男5例，女5例，平均年龄(31.5±2.2)岁。两组年龄和性别组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。

2.2 Alpha多样性分析

Chao1指数和Shannon指数稀释曲线中，每条曲线均趋于平缓，并到达平台区，提示该测序数据量可靠，能反映当前研究对象所包含的微生物多样性。比较各时间点两组样本的物种多样性和丰富度，结果显示：处理前及处理30 min时，CF组和CA组的Chao1指数和Shannon指数无统计学差异(P>0.05);处理2 h时，CA组的Shannon指数显著高于CF组(P<0.05),Chao1指数无明显差异(P>0.05)(图1)。

图1 Alpha多样性分析

2.3 Beta多样性分析

NMDS分析是根据样本中包含的物种信息，以点的形式反映在多维空间上，不同样本间的差异程度通过点与点间的距离体现。应用NMDS分析比较蔗糖处理前和处理后CF组和CA组的微生物组成发现，在3个检测时间点，CF组和CA组微生物群落结构相似，组间均有样本重叠，未观察到明显分离；未加权的UniFrac分析基于稀有物种作为主参数，结果同样未观察到显著分离(图2)。

2.4 门和属水平物种丰度分析

根据物种注释结果，选取每组在各水平相对丰度前10的物种生成堆栈图。在门水平，各组样本相对丰度排名前10的优势菌门分别为：变形菌门(Proteobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)、拟杆菌门(Bacteroidota)、放线菌门(Actinobacteriota)、梭杆菌门(Fusobacteriota)、蓝细菌门(Cyanobacteria)、髌骨菌门(Patescibacteria)、弯曲杆菌门(Campilobacterota)、螺旋菌门(Spirochaetota)、盐杆菌门(Halobacterota)(图3A)。

在属水平，各组样本相对丰度排名前10的优势菌属分别为：假单胞菌属(Pseudomonas)、罗氏菌属(Ralstonia)、链球菌属(Streptococcus)、普雷沃菌属(Prevotella)、奈瑟菌属(Neisseria)、拟普雷沃菌属(Alloprevotella)、劳特罗普氏菌属(Lautropia)、嗜血杆菌属(Haemophilus)、韦荣菌属(Veillonella)、纤毛菌属(Leptotrichia)(图3B)。相同时间点CF组和CA组间优势菌门及优势菌属相似，但相对丰度不同。

图2 Beta多样性的NMDS分析

图3门及属水平的物种丰度及系统发育树

2.5 优势菌属水平组间相对丰度差异分析

蔗糖处理前，CA组假单胞菌属(Pseudomonas)、罗氏菌属(Ralstonia)、普雷沃菌属(Prevotella)、拟普雷沃菌属(Alloprebotella)、嗜血杆菌属(Haemophilus)、韦荣菌属(Veillonella)、纤毛菌属(Leptotrichia)相对丰度较高，但无统计学差异(P>0.05)。而CF组链球菌属(Streptococcus)、奈瑟菌属(Neisseria)、劳特罗普氏菌属(Lautropia)相对丰度较高，其中奈瑟菌属与CA组有明显差异(P<0.05)。

蔗糖处理30 min后，与CF组相比，CA组相对丰度较高的菌属为普雷沃菌属(Prevotella)、拟普雷沃菌属(Alloprebotella)、韦荣菌属(Veillonella)和纤毛菌属(Leptotrichia),但差异无统计学意义。罗氏菌属(Ralstonia)、嗜血杆菌属(Haemophilus)在CA组的丰度下降，组间差异呈减小趋势；普雷沃菌属(Prevotella)、拟普雷沃菌属(Alloprebotella)、纤毛菌属(Leptotrichia)组间差异呈增大趋势，其中两组拟普雷沃菌属(Alloprebotella)丰度差异具有显著性(P<0.05)。而CF组假单胞菌属(Pseudomonas)细菌丰度高于CA组，但差异无统计学意义。

蔗糖处理2 h后，与CF组相比，CA组相对丰度较高的优势菌属为普雷沃菌属(Prevotella)、拟普雷沃菌属(Alloprebotella)、韦荣菌属(Veillonella)和纤毛菌属(Leptotrichia)。普雷沃菌、拟普雷沃菌组间差异较蔗糖处理30 min呈减小趋势，但较蔗糖处理前仍呈增大趋势。韦荣菌属(Veillonella)在蔗糖处理前后差异变化不明显。CF组假单胞菌属(Pseudomonas)细菌丰度高于CA组，且差异较处理前呈增大趋势(图4)。

图4属水平物种丰度组间差异分析

2.6 组间菌群差异物种t-test分析

分析属和种水平组间具有显著差异的物种，结果显示，在属水平，蔗糖处理前，CA组中新月形单胞菌属(Selenomonas)、缠节优杆菌群(Eubacterium nodatum group)物种丰度显著高于CF组(P<0.05)。蔗糖处理30 min时，CA组中拟普雷沃菌属(Alloprevotella)、弯曲杆菌属(Campylobacter)、新月形单胞菌属(Selenomonas)、缠节优杆菌群(Eubacterium nodatum group)、卡氏菌属(Catonella)物种丰度显著高于CF组(P<0.05)。蔗糖处理2 h时，CA组中放线菌属(Actinomyces)、弯曲杆菌属(Campylobacter)、密螺旋体属(Treponema)、卡氏菌属(Catonella)、消化球菌属(Peptococcus)、消化链球菌属(Peptostreptococcus)物种丰度显著高于CF组(P<0.05)(图5)。

在种水平，蔗糖处理前，CA组中拉瓦异普雷沃菌(Alloprevotella rava)、Actinomyces graevenitzii、月形单胞菌(Selenomonas_sp)、Eubacterium_sulci物种丰度显著高于CF组(P<0.05)。蔗糖处理30 min时，CA组中普雷沃菌(Prevotella_sp)、拉瓦异普雷沃菌(Alloprevotella rava)、Eubacterium sulci、牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis)物种丰度显著高于CF组(P<0.05)。蔗糖处理2 h时，CA组中普雷沃菌(Prevotella_sp)、拉瓦异普雷沃菌(Alloprevotella rava)、普雷沃菌(Alloprevotella tannerae)、Actinomyces graevenitzii、口腔消化链球菌(Peptostreptococcus stomatis)物种丰度显著高于CF组(P<0.05)(图5)。

2.7 LEfSe分析

LEfSe是一种用于发现和解释高维度生物标识的分析工具，通过LEfSe分析组间具有统计学差异的生物标志物，结果如图6所示，在蔗糖处理前，拉瓦异普雷沃菌(Alloprevotella rava)在CA组富集(LDA score>4.0);蔗糖处理30 min后，拟普雷沃菌属(Alloprevotella)、普雷沃菌(Prevotella_sp_)、拉瓦异普雷沃菌(Alloprevotella rava)在CA组富集(LDA score>4.0);蔗糖处理2 h后，普雷沃菌(Prevotella_sp_)在CA组富集(LDA score>4.0)。

图5组间差异物种的t-test分析

图6组间差异物种的LEfSe分析

3、讨论

本研究通过采集无龋人群和高龋患者蔗糖刺激前后唾液样本，利用16S rRNA高通量测序技术，比较两组人群唾液微生物群落的变化差异，初步探讨对蔗糖刺激敏感的关键微生物。

Alpha多样性分析中，Chao1指数用于估计群落样品中包含的物种总数，本研究发现蔗糖刺激前后，两组样本的Chao1指数无明显差异，表明蔗糖刺激并未改变样本物种数量。Shannon指数可用于表征群落内物种分布的多样性和均匀度，蔗糖刺激前及刺激30 min时，两组样本的微生物群落多样性相似；但在刺激2 h时，高龋患者微生物群落多样性高于无龋人群。先前研究报道，高糖摄入后口腔微生物的丰富度和多样性显著降低[13-15],与本研究结果不一致的原因可能是研究的处理方式、样本类型、采样方式、试验时间不同。先前研究采用调查问卷进行糖摄入情况回顾，糖摄入时间周期较长，本研究为蔗糖作用的2 h内，为口腔内微生物群落即时变化的直接观察。

Beta多样性分析发现，各时间点两组样本的微生物群落均未出现明显分离，进一步说明了两组样本的群落结构相似性。这与先前研究结果相同[16-18],表明高龋患者与无龋人群口腔内细菌群落结构都是相对稳定的。

相对丰度结果表明，两组样本在蔗糖刺激前后，唾液微生物群落在门及属水平优势物种类型相似，以拟杆菌门(Bacteroidota)的普雷沃菌属(Prevotella)、拟普雷沃菌属(Alloprebotella),厚壁菌门(Firmicutes)的链球菌属(Streptococcus)、韦荣菌属(Veillonella),变形菌门(Proteobacteria)的假单胞菌属(Pseudomonas)、奈瑟菌属(Neisseria)为主要优势菌。食物、细菌、宿主、时间为龋病的四联因素。蔗糖为致龋的高危因素，可为口腔内致龋微生物提供营养并产生酸性环境。先前研究表明，高糖摄入可改变口腔中细菌的丰度。链球菌和韦荣菌属口腔常驻菌，高糖摄入后唾液中链球菌和韦荣菌丰度增加[19-21]。本研究蔗糖刺激后韦荣菌变化不明显，这可能与韦荣菌的代谢方式有关，韦荣菌无法直接代谢糖，需依靠产酸菌产生的乳酸作为营养物质来源[22],因此在较短的研究时间内，韦荣菌相对丰度的增加不明显。

对上述几种主要优势菌属进一步组间比较分析发现，蔗糖刺激前后组间差异菌属中未见链球菌属和韦荣菌属。菌斑生物膜致龋过程中链球菌起到重要作用，而本研究显示唾液中的链球菌对蔗糖刺激并未表现出较大的敏感性，还需扩大样本量并增加牙菌斑微生物相关试验进行进一步的研究。本研究中，普雷沃菌属、拟普雷沃菌属在高龋患者分布较高，蔗糖刺激后，差异进一步呈增大趋势；LEfSe分析也显示高龋患者主要富集普雷沃菌，提示普雷沃菌作为潜在生物标志物的潜力。普雷沃菌是口腔中优势菌，具有糖代谢功能，尽管不具有直接致病性，但参与口腔生物膜的形成及生物膜相关疾病的发生发展[23-24]。一项基于荧光原位杂交技术的牙菌斑研究发现，普雷沃菌是生物膜形成所必需的早期定植菌之一[25-26],可能在生物膜形成的早期和中期阶段通过促进细胞-细胞黏附和创造有利于其他菌定植的理化环境，发挥对生物膜形成的促进作用[27-28]。此外，在没有链球菌的生物膜模型中，中间普氏菌丰度增加，形成了类似于链球菌的丝状链[29],同样促进细菌间的聚集与获得性生物膜的形成，促使龋病的发生。唾液作为生物膜形成的微生物来源，其中普雷沃菌的变化差异是否提示高龋患者在后续的生物膜形成中更具有易感性还有待进一步研究。

本研究结果显示高龋患者在蔗糖刺激后唾液微生物更具有多样性。虽然高龋患者和无龋人群在细菌群落结构方面无差异且主要优势菌类型相似，但相对丰度存在差异。普雷沃菌可作为龋病风险预测的潜在生物标志物，未来仍需更多研究来更好地了解其在口腔微生物群及口腔生物膜形成中的作用[30-32],从根源上降低龋病的发生风险。

参考文献:

[16]任雯,赵梅,李杰,等.青少年唾液菌群结构的分析研究[J].北京口腔医学,2019,27(5):256-260.

[17]姚雅男,梁宏雁,吉俊盈,等.16S rRNA高通量测序技术分析肾移植患者唾液菌群分布特征[J].北京口腔医学,2023,31(3):201-204.

基金资助:天津市卫健委人才培育项目(KJ20089); 天津市医学重点学科(专科)建设项目(津卫科教[2021]492号);

文章来源:王萌萌,刘晓斌,李利,等.蔗糖刺激前后无龋人群和高龋患者唾液微生物群落差异分析[J].口腔医学,2024,44(09):670-677.