华法林是临床广泛使用的香豆素类口服抗凝药物,主要用于血栓栓塞性疾病的预防和治疗[1,2,3,4,5]。华法林治疗窗窄,个体差异大,血浆蛋白结合率高达98%～99%[6],代谢依赖CYP450酶,容易与其他药物发生相互作用而影响抗凝效果或出现严重不良反应[7,8,9,10,11],因此,在使用过程中需要密切监测INR值,避免抗凝过度或抗凝不足带来严重后果。

冠心宁注射液是由丹参和川芎制成的中药注射剂,具有活血化瘀和通脉养心的功效,主要用于治疗冠心病、心绞痛、心肌梗死、脑梗死等疾病[12]。华法林和冠心宁注射液都可用于心脑血管疾病,患者有可能存在联合用药的情况,但冠心宁注射液是否会影响华法林的抗凝作用,两药的药品说明书中均未见描述,亦未见相关报道。因此,本研究将从冠心宁注射液对华法林药效学和药动学的影响来探讨联用后华法林抗凝作用的变化及相关机制,为两药能否联用及联用风险提供基础研究依据。

1、仪器和试药

UPLC-TQ MS(美国Waters公司);Mass Lynx V4.1数据采集软件(美国Waters公司);C2000-2半自动血凝分析仪(北京普利生仪器有限公司);MC-19R冷冻离心机(昊诺斯生物公司);HCG-12A型氮吹仪(合肥信诺仪器有限责任公司);L550台式低速大容量离心机(湖南湘仪实验室仪器开发有限公司);MIX-30S涡旋混合器(杭州米欧仪器有限公司);KQ-500E型超声清洗器(昆山市超声仪器有限公司);AEL-40SM电子天平(日本SHIMADZU公司)。

冠心宁注射液(石药银湖制药有限公司,10 ml/支,批号:1021706202);华法林钠片(上海信谊药厂有限公司,2.5 mg/片,批号:18170205E);甲氯噻嗪对照品(中国药品生物制品检定院,批号:101227-201101);PT试剂(上海太阳生物技术有限公司,批号:105357);APTT试剂(上海太阳生物技术有限公司,批号:111062);乙酸铵为色谱纯(Sigma-aldrich贸易有限公司,批号:BCBP9953V),其他试剂均为分析纯;实验用水为纯化水。

实验用清洁级雄性Wistar大鼠,体重(200±20)g,购自哈尔滨医科大学实验动物学部,合格证号:SYXK(黑)2006-033。

2、方法与结果

2.1溶液的配制

将1片华法林钠片研成细粉,用适量0.5% CMC-Na溶液超声振荡溶解,配制成浓度为0.05 mg/ml的华法林溶液。取冠心宁注射液10 ml,加入240 ml生理盐水配置成体积分数为4%的冠心宁注射液稀释液。

精密称取R-华法林对照品、S-华法林对照品和甲氯噻嗪对照品各适量,用甲醇溶解,分别配制成浓度为0.5 mg/ml的储备液,临用前用甲醇稀释至适宜浓度。

2.2动物实验

2.2.1冠心宁注射液对单剂量华法林抗凝作用影响的动物实验

将大鼠随机分为4组:空白对照组(A组)、冠心宁注射液组(B组)、华法林对照组(C组)、华法林和冠心宁联合给药组(D组),每组8只。B、D两组大鼠连续14 d腹腔注射冠心宁注射液稀释液(7.2 ml/kg),A、C两组大鼠连续14 d腹腔注射相同体积生理盐水。第8天,C、D两组大鼠灌胃给予华法林溶液(0.2 mg/kg),A、B两组大鼠灌胃相同体积的生理盐水。

2.2.2冠心宁注射液对稳态华法林抗凝作用影响的动物实验

将大鼠随机分为2组:稳态华法林对照组(E组),稳态华法林与冠心宁联合给药组(F组),每组8只。连续8 d均灌胃给予华法林溶液(0.2 mg/kg)。从第5天起连续4 d,F组大鼠腹腔注射冠心宁注射液稀释液(7.2 ml/kg),E组大鼠腹腔注射给予等量生理盐水。

2.3冠心宁注射液对华法林抗凝作用影响的药效学研究方法

A、B、C、D四组大鼠灌胃给予华法林溶液或生理盐水后0、4、8、12、24、36、48、72、96、120、144 h,E、F两组大鼠每天给药前,分别从各组大鼠眼窝静脉丛取血0.4 ml,置于预先枸橼酸钠抗凝处理的离心管中,于3 000 r/min离心15 min。吸取上层血浆,按照PT和APTT试剂说明书中的方法处理血浆样品用于测定PT和APTT值,并计算INR值[INR=(PTtest/PTnormal) ISI,ISI为国际敏感指数,PTtest为PT实测值,PTnormal为同一时间点的空白组PT平均值]。

2.4冠心宁注射液对华法林抗凝作用影响的药动学研究方法

2.4.1血浆样品采集与处理

C、D两组大鼠灌胃给予华法林溶液后0.5、1、1.5、2、4、8、12、24、36、48、72、96、120、144 h,E、F两组大鼠每天给药前,分别从各组大鼠眼窝静脉丛取血0.5 ml置于肝素抗凝处理的离心管中,9 000 r/min离心10 min,准确吸取100μl上清液于离心管中,依次加入20μl乙酸,50μl甲氯噻嗪内标溶液(2.0μg/ml),涡旋振荡1 min,然后加入3 ml乙酸乙酯,涡旋振荡2 min,3 500 r/min离心5 min,吸取上清液至尖底试管中,氮气流下40℃挥干,加入100μl流动相复溶,0.22μm微孔滤膜滤过后测定。

2.4.2 S-华法林和R-华法林血药浓度测定条件

色谱条件:Astec CHIROBIOTICTMV手性色谱柱(5μm,2.1 mm×100 mm);柱温:28℃;流动相:5 mmol/L乙酸铵(pH 4.02)∶乙腈= 85∶15(v/v);进样体积:5μl;流速:0.2 ml/min;检测时间:12 min。质谱条件:电喷雾离子源(ESI),负离子模式检测,多反应监测(MRM)扫描方式,毛细管电压:0.4 kV,锥孔电压:35 V,氮气流温度:400℃,流速:650 L/h。华法林和内标甲氯噻嗪定量分析的离子对分别为307.1→161.0和357.8→321.9,碎裂电压分别为115 eV和100 eV,碰撞能量分别为20 eV和8 eV,碰撞池加速电压均为5 V。

2.5数据处理

应用DAS 2.0软件处理血药浓度-时间数据,计算药代动力学参数。应用SPSS 22.0软件对各组药动学和药效学数据进行统计分析。用t检验分析比较组间差异,P<0.05为差异有统计学意义。

2.6冠心宁注射液对华法林抗凝作用的药效学影响结果

2.6.1冠心宁注射液对单剂量华法林抗凝作用的药效学影响结果

测得A、B、C、D四组的PT、APTT值,并根据PT值计算INR值,结果见图1和表1。

图1冠心宁注射液对单剂量华法林药效学影响实验PT(A)和INR(B)变化曲线(n=8)

表1冠心宁注射液单剂量华法林药效学影响实验APTT测定结果(x¯¯±s,n=8)

以上结果显示,与空白对照组比较,冠心宁注射液组大鼠在各个时间点的PT、INR值差异均无统计学意义(P>0.05),说明冠心宁注射液本身无抗凝作用;与华法林对照组比较,合用冠心宁注射液后,PT、INR值在4～96 h显著降低(P<0.01),120、144 h时降低(P<0.05),APTT无明显变化(P>0.05),说明冠心宁注射液与华法林联用时,能够减弱华法林的抗凝作用。

2.6.2冠心宁注射液对稳态华法林抗凝作用的药效学影响结果

测得E、F两组的PT、APTT值,并根据PT值计算INR值,结果见图2和表2。

以上结果显示,华法林达稳态后,与冠心宁注射液联用,能使PT、INR显著降低(P<0.01),APTT无明显变化(P>0.05)。说明冠心宁注射液与稳态华法林联用后,能够减弱稳态华法林的抗凝作用。

2.7冠心宁注射液对华法林抗凝作用的药动学影响结果

2.7.1 R-华法林和S-华法林血药浓度测定的方法学考察

①专属性试验:

按照“2.4.1”项下方法分别处理空白血浆和空白血浆加R-/S-华法林对照品及甲氯噻嗪(内标),用UPLC-MS/MS进行测定。结果如图3所示,内标、R-华法林和S-华法林分离良好,且样品中的内源性物质不干扰测定。

表2冠心宁注射液对稳态华法林药效学影响实验的APTT测定结果

②线性范围和定量下限试验:

配制浓度分别为2、10、50、100、250、500、1 000 ng/ml的R-华法林和S-华法林对照品溶液。各取5μl进样测定。以浓度为横坐标、R/S-华法林与内标峰面积比为纵坐标进行线性回归,结果如下:R-华法林线性范围2.05～1 026 ng/ml,R2=0.999 8,定量下限2.05 ng/ml;S-华法林线性范围2.06～1 030 ng/ml,R2=0.999 4,定量下限2.06 ng/ml。

图2冠心宁注射液对稳态华法林药效学影响实验PT(A)和INR(B)变化曲线(n=8)

③准确度和精密度试验:

取浓度分别为2.0、5.0、250、800 ng/ml的R-华法林和S-华法林对照品溶液,每一浓度6个样品,连续测定3 d。R-华法林和S-华法林测定的相对偏差RE、日内精密度和日间精密度RSD值均不超过15%,符合生物样品检测要求。

④提取回收率试验:

取空白血浆,分别加入R-华法林和S-华法林对照品溶液,使其浓度分别为5.0、250、800 ng/ml,每一浓度6个样品。按“2.4.1”项下方法处理样品。另取空白血浆同法处理后,再分别加入R-华法林和S-华法林对照品溶液。样品分别测定后计算各浓度下的提取回收率,结果为:低、中、高浓度R-华法林提取回收率分别为83.62%、89.38%、90.04%,低、中、高浓度S-华法林提取回收率分别为85.36%、91.23%、93.06%,RSD均小于5%,符合生物样品检测要求。

⑤基质效应试验:

取空白血浆,分别加入R-华法林和S-华法林对照品溶液,使其浓度分别为5.0、250、800 ng/ml,每一浓度6个样品。按“2.4.1”项下方法处理样品并测定。另取甲醇代替空白血浆,同法处理后测定。计算每一浓度下2种处理方法的峰面积比值。结果R-华法林低、中、高浓度的基质效应分别为103.12%、101.45%、100.24%,S-华法林分别为102.87%、101.77%、100.62%,RSD均小于5%,基质效应对测定无影响。

⑥稳定性试验:

取空白血浆,分别加入R-华法林和S-华法林对照品溶液,使其浓度分别为5.0、250、800 ng/ml,按照“2.4.1”项下方法处理后测定,分别考察血浆样品处理后放置12 h、血浆样品-20℃冷冻放置14 d、反复冻融3次的稳定性。结果在3种条件下测定的R-华法林和S-华法林RE值均小于5%,表明样品稳定性良好。

2.7.2冠心宁注射液对单剂量华法林的药动学影响结果

单剂量华法林实验中,两组大鼠R-华法林和S-华法林平均血药浓度-时间曲线分别如图4所示,药代动力学参数见表3、表4。

由图4、表3和表4所示结果可知,合用冠心宁注射液后与华法林对照组比较,R-华法林的药动学参数Cmax、t1/2、AUC0-t、AUC0-∞分别降低了33.42%、40.23%、44.26 %、39.35 %(P<0.01);S-华法林的药动学参数无统计学差异。

图3大鼠血浆中R-华法林和S-华法林的MRM色谱图

图4单剂量华法林实验中大鼠体内R-华法林(A)和S-华法林(B)的血药浓度-时间曲线(n=8)  表3单剂量华法林实验中大鼠体内R-华法林的药代动力学参数(n=8)

表4单剂量华法林实验中大鼠体内S-华法林的药代动力学参数(x¯¯±s,n=8)

图5稳态华法林实验中R-华法林(A)和S-华法林(B)的血药浓度-时间曲线(n=8)

2.7.3冠心宁注射液对稳态华法林的药动学影响结果

稳态实验中两组大鼠R-华法林和S-华法林的平均血药浓度-时间曲线分别如图5所示。

如图5所示,在联合冠心宁注射液后,与稳态华法林对照组相比,合用后的第1天、第2天和第3天,R-华法林的血药浓度分别降低了21.18 %、19.64 %、15.96 %(P<0.01);而S-华法林的血药浓度无明显变化。

2.8冠心宁注射液对华法林PK/PD模型的影响

由图6可知,药动学-药效学曲线呈现逆时针状态,当华法林血药浓度达到峰值时INR值还未达峰,显示出华法林PK与PD之间存在时滞现象,且联用冠心宁注射液后华法林的峰浓度和INR峰值均减小。

图6 INR值与华法林血药浓度的PK/PD曲线

3、讨论

凝血功能异常筛查实验中将PT值作为外源性凝血途径的筛查指标,APTT作为内源性凝血途径的筛查指标[13,14]。本研究通过测定大鼠凝血参数PT、APTT值,并计算INR值来评价冠心宁注射液对大鼠体内华法林抗凝作用的药效学影响。单剂量华法林药效学实验结果表明,冠心宁注射液本身对凝血参数无影响,无抗凝作用。单剂量和稳态华法林药效学实验结果均显示,冠心宁注射液与华法林联用后,PT、INR值显著降低,APTT无明显变化,表明冠心宁注射液可通过外源性凝血途径减弱华法林的抗凝作用,对内源性凝血途径没有影响。

单剂量和稳态华法林实验结果均表明,冠心宁注射液可以加快R-华法林的代谢,但对S-华法林的代谢无影响。临床应用的华法林是由R-华法林和S-华法林等比例构成,其中R-华法林经CYP1A2和CYP3A4代谢,S-华法林经CYP2C9代谢[15]。本课题组前期研究结果表明,冠心宁注射液可诱导CYP1A2酶[16],而对CYP3A4、CYP2C9无影响,由此推测冠心宁注射液可能是通过诱导CYP1A2酶来加快R-华法林的代谢,使华法林抗凝作用减弱。

通过比较华法林的药效学和药动学数据可知,华法林浓度达峰时,INR值并未同步达到最大值,药动学和药效学之间存在时滞现象,这与华法林的凝血作用机制有密切关系。人体内的凝血反应是由一系列复杂的级联反应构成,内源性和外源性凝血都是通过Ⅶ、Ⅸ等凝血因子激活凝血因子Ⅹ,进而激活凝血因子Ⅱ,最终使纤维蛋白原变成纤维蛋白实现的。华法林对已生成的凝血因子没有影响,只有在这些凝血因子的含量明显下降之后华法林才发挥抗凝作用。

本研究结果提示,冠心宁注射液与华法林联合应用,可产生药动学相互作用,使抗凝作用减弱,可造成抗凝治疗不足增加血栓形成的风险,因此,应避免华法林与冠心宁注射液同时使用。若患者需要必须联用时,则应密切监测患者INR值,并视具体情况酌情增加华法林用量,保障抗凝治疗效果,规避血栓风险。

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基金:国家自然科学基金项目(81173659).