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离子色谱法测定尿中硝酸盐、硫氰酸盐和高氯酸盐的方法研究

2024-09-24 173 上传者：管理员

摘要：建立离子色谱测定尿中的硝酸盐、硫氰酸盐和高氯酸盐的方法。采用超纯水稀释尿样，RP前处理小柱去除尿中的干扰离子，以AS20阴离子交换柱为分析柱，KOH淋洗液梯度洗脱，电导检测器进行检测。离子色谱法测定尿中硝酸盐、硫氰酸盐和高氯酸盐可在35min内实现基线分离，检出限分别为5.5μg·L-1、2.8μg·L-1和4.0μg·L-1;3种物质在线性范围内相关系数（r）均大于0.999；相对标准偏差为0.17%～6.28%；加标回收率为86.1%～107.7%。本实验建立的方法操作简便、准确、灵敏度高，可适用于同时检测尿中硝酸盐、硫氰酸盐和高氯酸盐。

关键词：
尿
硝酸盐
硫氰酸盐
离子色谱法
高氯酸盐
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硝酸盐摄入过多会对人体产生一定的危害，进入人体的硝酸盐主要是通过尿液排出。大量的硝酸盐在农业生产中作为肥料使用，它也做为防腐剂在食品加工中被频繁使用[1]，因而硝酸盐在环境和摄入的食物中普遍存在。尿中硫氰酸盐为氰化物接触的生物标志物，人体在短时间高剂量和长时间小剂量接触氰化物后，中枢神经系统和肝脏会受到一定损坏，氰化物最终会转化成硫氰酸根后经尿液排出[2]。吸烟、汽车尾气、奶制品和十字花科类蔬菜等都会影响人体内硫氰酸盐的水平[3]。高氯酸盐作为强氧化剂主要用在烟花制造、军火和航天工业。我国为烟花制造和航天大国[4]，高氯酸盐生产分布全国各地，饮用水氯化消毒工艺也是重要来源之一，所以我国部分地区饮水中存在高暴露情况。高氯酸盐在体内不发生代谢，生物半衰期短，不在体内蓄积，几乎全部以原型由尿液排泄[5]，可以通过检测尿高氯酸盐以评估高氯酸盐的暴露水平。硝酸盐、硫氰酸盐和高氯酸盐的高暴露，皆会抑制碘的摄取、降低甲状腺素的分泌而影响人体的正常生长发育[6]。已报道的文献少有对尿中这3种物质的同时测定。

硝酸盐的检测方法通常有离子色谱法[7]、分光光度法[8]、色谱法及液相色谱-质谱联用法等。硫氰酸盐检测方法主要有离子色谱法[9]、气相色谱法、高效液相色谱法、液相色谱-质谱联用法[10]、分光光度法[11]、原子吸收间接测定法等。对于高氯酸盐的检测，主要采用离子色谱法[12]、离子色谱质谱法及液相色谱质谱法[13]。离子色谱法主要用于环境、食品和人体代谢物中阴阳离子的分析，具有前处理简单、准确度高和方法灵敏度好等优点，适合于尿中硫氰酸盐、高氯酸盐强极性阴性离子的检测。采用RP柱净化[14]进行样品的前处理，可以免去衍生化等复杂的前处理，简单快速，效果令人满意。采用固相萃取-离子色谱法对尿中3种阴离子进行测定，简单、快速，适用于大批量样品的监测工作。

1、实验部分

1.1 主要仪器与试剂

ICS-6000型离子色谱仪（配KOH淋洗液自动发生器，美国Thermo公司）；Milli-Q型超纯水仪（MILLIPORE公司）；KDC-16H型高速离心机（科大创新股份有限公司）；0.22μm水系针式微孔滤膜过滤器（上海迪马科技发展有限公司）；CNW IC-Guard RP前处理小柱（上海安普试验科技有限公司）。

硝酸盐标准物质（1000μg·mL-1中国计量研究院）；硫氰酸盐标准物质和高氯酸盐标准物质，浓度均为1000μg·mL-1，北京北方伟业计量技术研究院有限公司；甲醇（色谱纯美国默克公司）。

1.2 仪器工作条件

色谱条件Dionex IonPac AS20阴离子交换分析柱（250mm×4mm),IonPac AG 20阴离子交换保护柱（50mm×4mm），柱温30℃，池温35℃，抑制器电流124mA，进样量100μL。

1.3 样品处理

样品采集和保存采集50mL中段尿样于干净的聚乙烯瓶（清洗后纯水浸泡4h以上，烘干）中，4℃或-20℃保存和运输，尽快测定。若2d内不能及时处理和测定，可置于-20℃保存一个月以上。

样品前处理冷冻尿样置于4℃冰箱中过夜，充分解冻后取出放置至室温，充分涡旋混匀，准确吸取混匀后的样品3.00mL于15mL的离心管中。4000r·min-1离心10min，取上清液用超纯水稀释30倍，待用。依次过Guard RP柱、0.22μm微孔滤膜后上机测定各物质，以标准曲线法定量。

1.4 标准溶液配制

混合标准使用溶液的配制分别移取硝酸盐、硫氰酸盐和高氯酸盐标准储备溶液1.0mL于100mL容量瓶中，用纯水定容至刻度，配制成浓度为10.0μg·mL-1的混合标准使用溶液。

方法的线性范围临用前分别移取10.0μg·mL-1的硝酸盐、硫氰酸盐和高氯酸盐混合标准使用溶液，用纯水逐级稀释成硝酸盐0.50、1.00、2.00、3.00、5.00、8.00、10.00mg·L-1和硫氰酸盐、高氯酸盐浓度为20、50、100、200、400、800μg·L-1的混合标准工作系列。

2、结果与讨论

2.1 色谱柱的选择

比较了IonPac AS16、AS19和AS20阴离子交换分析柱对3种物质的分离情况。AS16柱对易极化的硫氰酸盐和高氯酸盐的分离效果较好，但存在高氯酸盐与芳香族磺酸盐（4-氯苯磺酸）的色谱峰重叠问题和常见离子Br-对硝酸盐响应的干扰；AS19柱对离子半径小、电荷少的无机阴离子的分离能力高，疏水性强的硫氰酸盐和高氯酸盐在此柱上的保留时间过长，峰型也不理想；AS20柱可以在30min内完全分离3种物质且峰型尖锐对称，大柱容量能避免样品中高含量的氯化物、碳酸盐和硫酸盐对低浓度高氯酸盐的干扰，且可将高氯酸盐与4-氯苯磺酸完全分离，故综合考虑本实验选AS20柱。

2.2 洗脱方法

尿中存在较多种类的无机阴离子，为达到较好的分离效果，必须选用合适的淋洗液。硫氰酸盐和高氯酸盐为疏水性的强保留成分，适合用亲水性的AS20色谱柱，OH-淋洗液适用于这类亲水性的烷醇季铵类色谱柱，且OH-的柱后抑制产物为水，本底值低；淋洗液浓度增加时，背景电导变化很小，不影响目标峰与杂质峰的分离，可保证方法的灵敏度，综上所述，选择OH-为淋洗液。

由于硝酸盐为弱保留成分，淋洗液浓度过高会导致分离效果差，而硫氰酸盐和高氯酸盐为疏水性阴离子，属于强保留组分，尿液基质比较复杂，淋洗液浓度过低时会导致洗脱较慢，分析时间过长，因此，采用梯度洗脱这3种物质。前15min用低浓度的OH-淋洗液洗脱硝酸盐，可保证与尿液中其他杂质离子的分离度均大于1.5；其后升高淋洗液浓度并逐步降低流速，在控制硫氰酸盐、高氯酸盐与杂质峰的分离度的同时可增加两者的出峰时间，两者保留时间分别为25.8、27.7min，与杂质峰的分离度均大于1.0;35min后淋洗液降低至初始浓度平衡色谱柱。洗脱条件见表1。

表1 淋洗液梯度和流速

图1 不同流速下高氯酸盐的分离效果图

2.3 净化小柱的选择

由于尿液中有大量的有机物和各种离子，若直接上机测定会污染色谱柱和堵塞泵头和管道，影响色谱柱的使用寿命、增加仪器的维修次数，且大量的杂质会严重影响目标峰的分离，故必须对尿样进行净化处理。实验对HC-C18和IC-Guard RP两种规格的固相萃取小柱进行比较，研究结果显示（表2），经过两种固相萃取小柱分别处理后的尿液样本的加标回收率相近，其中IC-Guard RP固相萃取小柱的萃取速率高、时间短，且该类小柱的成本较低，因此，本实验选择IC-Guard RP小柱处理尿液样本。

表2 不同固相萃取小柱的3种物质加标回收率（%）

2.4 进样量的选择

实验考察了25μL、100μL和250μL 3种进样量对3种物质测定的影响。结果表明，进样量为25μL时，虽然柱容量变化不大，但检出限较高；进样量为250μL时，虽然信号高，但硫氰酸盐、高氯酸盐所出峰峰型略宽，拖尾严重；进样量为100μL时，3种物质所出的色谱峰峰型好，尖锐、对称、无拖尾，保证了3种物质检测的较宽线性范围和较低的方法检出限，能满足实际工作中对这3种物质测定的需求。故实验选择100μL为最终进样量。

在100μL进样量下，3种离子的标准溶液色谱图见图2，实际尿样中的3种加标离子色谱图见图3，可见硝酸盐、硫氰酸盐和高氯酸盐的峰型尖锐对称，与杂质峰分离度好、无拖尾现象。

图2 3种物质的离子色谱图

图3 尿样中3种物质的色谱图

2.5 样品稀释倍数

原尿样分别稀释20、30和40倍，经固相萃取小柱净化后，将处理后滤液经0.22μm滤头过滤,按色谱条件进行测定，比较不同稀释倍数对检测效果的影响。对样本采用20倍稀释时，尿液中的杂质在固相萃取柱中可基本去除，不影响样品的测定，但是观察色谱图发现高氯酸盐和硫氰酸盐不能很好的分离；采用40倍稀释尿样时，各项物质虽能够很好地分离，但是信号值较低，灵敏度不够；而30倍稀释尿样，可在有效分离待测物的基础上获得足够的灵敏度，故实验采用对样本进行30倍稀释的预处理方法。

2.6 样品稳定性实验

将尿样在不同的温度下进行储存，测定3种物质的变化情况，结果见图4。

图4 样品稳定性实验结果

由图4可见，室温下（20～25℃）样品硝酸盐测定值从第3天开始降低，第5天硫氰酸盐检出信号出现下降；4℃冷藏储存的样品在一个月内硝酸盐检出信号无明显降低，在第10天硫氰酸盐检出信号开始降低；-20℃储存的样品第30天检出信号都无明显下降。因此，在室温下样品原液可保存2d,4℃可保存9d,-20℃以下可保存30d以上。

2.7 线性范围和检出限

采用浓度为0.50～10.00mg·L-1的硝酸盐和20～800μg·L-1的硫氰酸盐、高氯酸盐混合标准溶液，用已优化的实验条件对其进行测定，以3种物质的峰面积为纵坐标，浓度为横坐标绘制标准曲线，计算线性回归方程和相关系数（r）。配制接近空白溶液的标准溶液，连续测定12次，计算检出限和定量限，结果见表3。

表3 3种物质的检出限、定量限及线性范围

由表3可见，3种物质在相应的浓度范围内线性关系良好，相关系数均大于0.999，检出限和定量限符合测定要求。

2.8 精密度和准确度实验

对3种物质进行低、中、高3个浓度水平的加标回收实验，每个浓度平行测定8次，计算加标回收率和相对标准偏差（RSD），结果见表4。

表4 3种物质的加标回收率和RSD(n=8)

由表4可见，3种物质的相对标准偏差RSD小于6.5%，加标回收率在86%～108%之间，表明该方法的回收率和精密度可较好满足尿样中3种物质的检测要求。

图5 11种物质的离子色谱图

2.9 基质效应

正常人尿液中可能含有F-、Cl-、Br-、I-、BrO32-、SO42-、C2O42-、PO43-等阴离子，由图4可见，上述阴离子对尿中NO3-、SCN-、ClO4-的测定均不产生干扰。

2.1 0 与标准方法比对

为了验证方法的准确性，采用本方法测定尿中硫氰酸盐与WS/T 39-1996《尿中硫氰酸盐的吡啶-巴比妥酸分光光度测定方法》进行比对实验。结果见表5。

表5 同国标法比对实验结果（n=8)