造血干细胞(hematopoietic stem cells,HSCs)具有自我更新的能力,并能够生成各种造血祖细胞(hematopoietic progenitor cells,HPCs),最终分化成为各谱系的成熟细胞[1]。这种原始和成熟血细胞之间的平衡受到内外因素的共同调控。白血病是一种以染色体易位为主要特征的血液系统恶性肿瘤。在白血病细胞的浸润下,造血平衡遭到严重破坏,导致成熟有功能的血细胞减少,这成为白血病患者发病和死亡的重要原因[2]。先前的研究表明,正常的HSCs和HPCs在白血病发展过程中逐渐受到抑制,其倾向于维持在静息状态,但仍保留造血潜能[3,4]。

产热脂肪组织(thermogenic adipose tissues,TATs)包括棕色脂肪组织(brown adipose tissue,BAT)和棕色化的白色脂肪组织(white adipose tissue,WAT),由在线粒体的内膜中表达的解偶联蛋白1(uncoupling protein 1,UCP 1)介导[5],通过非寒颤生热(non-shivering thermogenesis,NST)产生热量,参与能量耗散,可减轻肥胖和糖尿病动物的体重并改善代谢功能障碍[6]。最近的研究显示,在实验小鼠中,激活棕色脂肪组织通过降低癌细胞中的糖酵解代谢水平,显著抑制了各种实体肿瘤的生长[7],但其对血液肿瘤的影响仍不明确。米拉贝隆(mirabegron)是一种选择性的β3-肾上腺素受体激动剂,最早获批用于临床治疗膀胱过度活动综合征[8]。米拉贝隆通过β3-肾上腺素受体介导的交感神经激活激活成年人和啮齿动物的棕色脂肪组织以调节代谢[9]。尽管我们在先前的研究中观察到米拉贝隆对白血病细胞的影响,但其对正常和异常造血细胞功能的具体影响尚不十分清楚。

基于上述研究背景,本研究旨在通过米拉贝隆激活棕色脂肪组织,明确机体能量代谢变化对生理和病理条件下造血细胞的影响,并为探索一条治疗白血病和其他血液系统疾病的新策略提供理论和实验依据。

1、材料和方法

1.1 实验动物

所有动物实验均经中国医学科学院北京协和医学院血液学研究所动物管理中心及伦理委员会的批准(CIFMS2021004-EC-2)。在伦理学许可下,以人道终点为标准对每只小鼠实施安乐死。所有实验均未超过身体状况评分BCS-1(body condition scoring-1)(濒死状态)。C57BL/6雄性小鼠购自北京华阜康生物科技股份有限公司,年龄在7到8周龄之间,在12 h的黑暗和12 h的光照循环下自由进食饮水。

1.2 药物治疗

所有动物在实验前随机分组。每只小鼠分别灌胃给予10 mg/kg的米拉贝隆(Cat.No.HY-14773,MedChemExpress)或PBS,一日一次,持续3周后取小鼠骨髓骨髓、脾脏、外周血和产热脂肪组织进行分析。对于白血病模型在注射白血病细胞当天开始给药,一日一次。

1.3 小鼠模型

白血病模型:每只小鼠尾静脉注射1×106个MSCV-MLL-AF9-GFP+细胞建立急性髓系白血病小鼠模型。造模当天记为第0天,分别在第7天、第14天、第21天,取小鼠骨髓、肝脏、脾脏、外周血和产热脂肪组织进行分析。棕色脂肪组织去除术:麻醉7周龄小鼠后,通过钝性剥离术暴露肩胛间棕色脂肪组织,并在不影响周围组织血供的情况下切除棕色脂肪组织。对照组手术仅暴露棕色脂肪组织,不切除棕色脂肪组织。缝合伤口后,动物休息1周至术后恢复,再行白血病造模处理。

1.4 H&E染色和免疫荧光染色

小鼠发病后将股骨、脾脏、肝脏和脂肪组织用4%多聚甲醛室温固定过夜后进行石蜡包埋,再将样品切为5μm厚的薄片,60°C烘烤1 h,在二甲苯中室温固定(10 min×2次),在99%、95%、70%乙醇中依次浸泡5 min,脱水,PBS洗两遍。H&E染色:组织切片室温下用苏木精(Cat.No.MB9897,Meilunbio)染色3～5 min,流水冲洗掉苏木素染液,1%盐酸酒精分化3 s,水洗,置于自来水中浸泡返蓝5 min,伊红(Ca.No.MA0164,Meilunbio)染色15 s,蒸馏水清洗,用95%和99%乙醇脱水,然后用中性树脂封片。免疫荧光染色:将组织切片封闭后用一抗于4°C孵育过夜,一抗包括兔抗鼠UCP1抗体(Cat.No.ab10983,Abcam,1׃100)、兔抗鼠COX4抗体(Cat.No.PA5-29992,ThermoFisher Scientific,1׃100)和羊抗鼠Perilipin-1抗体(Cat.No.ab61682,Abcam,1׃100)。第2天PBS冲洗后,用二抗染色45 min,二抗包括驴抗兔Alexa Fluor 647 IgG(H+L)抗体(Cat.No.ab150169,ThermoFisher Scientific,1׃500)和驴抗羊PE IgG(H+L)抗体(Cat.No.31860,ThermoFisher Scientific,1׃500)。PBS冲洗后,用DAPI(Ca.No.C0060,Solarbio,1׃500)孵育5 min。PBS冲洗后,中性树脂封片。

1.5 流式细胞术

GFP+细胞比例检测:取小鼠骨髓、肝脏、脾脏和外周血的单个核细胞各1×106个,用200μL PBSE重悬细胞沉淀,加DAPI标记死细胞,流式细胞仪检测GFP+细胞比例。造血干/祖细胞检测:取5×107个骨髓单个核细胞,用100μL PBSE重悬,加入流式抗体Lin–(CD3e、CD4、CD8a、TER-119、Ly-6G/Ly-6C、B220、CD11b)-APC eFluor 780、c-kit-BV421、Sca-1-PE/Cyanine7、CD34-APC、CD135-PE、CD16/32-PerCP和CD127-Per CP各1μL,4°C避光孵育30 min,用流式细胞仪进行分析。成熟免疫细胞的检测:取5×106个骨髓单个核细胞,用100μL PBSE重悬,加入流式抗体CD11b-PE、Ly6G-PE/Cyanine7、Ly6C-FITC、CD3-APC和B220-APC/Cyanine7各1μL,避光孵育30 min,加DAPI标记死细胞,用流式细胞仪进行分析(除Lin–抗体购于Thermo Fisher Scientific外,其余均购自Bio Legend)。

1.6 集落形成实验

使用流式细胞分选仪分选LSK(Lin–、c-Kit+、Sca-1–)细胞接种到含青霉素–链霉素的混合溶液(100×)的Methocult GF M3434培养基(stem cell technologies)的24孔板内(每孔104个LSK细胞)。于37°C、5%CO2的恒温培养箱内培养3～10天后,在显微镜下观察并计数克隆。

1.7 白血病细胞凋亡和细胞周期的检测

细胞凋亡:分选5×106个小鼠的LSK细胞,用500μL缓冲液重悬后孵育30 min,加入5μL APC-Annexin V及5μL 7-AAD(Cat.No.KGA1025,Keygenbio),室温避光孵育15 min后,用流式细胞仪检测骨髓白血病细胞早期凋亡(Annexin V+7-AAD–)细胞和晚期凋亡(Annexin V+7-AAD+)细胞的比例。细胞周期:分选5×106个小鼠的LSK(Lin–、c-Kit+、Sca-1–)细胞,使用固定破膜缓冲液(Cat.No.00-5523-00,ThermoFisher Scientific)固定细胞后,加入50µL RNase(Cat.No.R8020,Solarbio,100µg/mL)和200µL PI工作液(Cat.No.C0080,Solarbio,50µg/mL),室温避光孵育30 min,用流式细胞仪检测。

1.8 RNA提取和实时荧光定量PCR

使用TRIzol(Cat.No.15596026CN,ThermoFisher Scientific)从白血病小鼠的LSK细胞和脂肪组织中分离总RNA。采用iScript cDNA合成试剂盒(Cat.No.1708891,Bio-Rad)逆转录合成c DNA,采用SYBR Green定量RT-PCR试剂盒(Cat.No.1708880,Bio-Rad)进行RT-PCR。我们实验中使用的不同基因的特异性引物对见表1。

1.9 Western blot检测

取小鼠50 mg脂肪组织,加入100μL含1%磷酸酶抑制剂和蛋白酶抑制剂的RIPA裂解和提取缓冲液(Cat.No.89900,ThermoFisher Scientific)碾碎匀浆后,再加入150μL裂解液冰上裂解20 min,4°C以12 000 r/min离心5 min取上清加入相应体积的SDS上样缓冲液,置于95°C金属浴煮沸10 min至蛋白变性,–20°C冻存或直接上样。以80 V恒压电泳,350 mA恒流转膜2 h、5%牛奶室温封闭2 h,PBS清洗后加入一抗兔抗鼠UCP1抗体(Cat.No.ab10983,Abcam,1׃1 000) 4°C孵育过夜,第2天PBS清洗后加入羊抗兔二抗(Cat.No.31460,ThermoFisher Scientific,1׃5 000) 4°C孵育1.5 h,加入化学发光剂(Cat.No.WBULS0500,Millipore),使用Bio-Rad Chemi Doc化学发光成像系统曝光采集图像。

表1 引物序列

1.1 0 统计分析

采用GraphPad Prism 8软件进行统计学分析。两组间的统计学差异采用未配对Student t检验。多组间比较采用单因素方差分析。*P<0.05为差异有统计学意义,**P<0.01为差异非常显著,***P<0.001为差异极显著。

2、结果

2.1 米拉贝隆抑制白血病的发生发展并延长小鼠生存期

MLL-AF9是急性髓系白血病中M4、M5常见的融合基因,MLL-AF9转染的细胞可诱导小鼠发生急性髓系白血病[10]。在本研究中,我们选用了MLL-AF9急性髓系白血病小鼠模型,旨在探讨米拉贝隆在病理环境下对C57小鼠造血系统的影响。为了研究米拉贝隆对白血病宿主体内白血病发生、发展和生存的影响,我们建立了MLL-AF9-GFP+白血病小鼠模型(图1A)。将携带白血病的C57BL/6小鼠随机分为两组,从接种白血病细胞当天开始分别使用米拉贝隆和PBS进行治疗,观察其发病情况,并详细记录小鼠的生存期。结果显示,米拉贝隆治疗能显著延长白血病小鼠的生存期(图1B),显著减轻白血病小鼠的肝脾肿大(图1C)。流式细胞术结果分析显示,米拉贝隆治疗能抑制白血病细胞的浸润,显著减少各时间节点白血病小鼠骨髓、肝脏、脾脏和外周血中的GFP+白血病细胞的比例和数量(图1D),第14天时差异最为显著。取造模第14天小鼠骨髓、脾脏和肝脏进行H&E染色,结果显示,米拉贝隆能显著改善骨髓、脾脏和肝脏中白血病细胞的浸润,并减轻器官结构的损伤(图1E)。总之,这些结果表明,米拉贝隆治疗可显著抑制白血病的进展,并提高白血病小鼠的生存率。

2.2 米拉贝隆对生理和白血病状态下成熟免疫细胞的影响

米拉贝隆治疗能够提高白血病小鼠的生存率,但至今不清楚免疫细胞在其中所起的作用,因此我们又开展了米拉贝隆治疗对小鼠骨髓成熟免疫细胞作用的研究。实验中通过流式细胞术分析发现米拉贝隆对正常C57小鼠骨髓、脾脏和外周血中各类成熟免疫细胞数量及比例均无明显影响(图2A和图2B)。而在白血病条件下,米拉贝隆治疗组小鼠骨髓中粒细胞、单核细胞和B细胞的比例和绝对数均显著增高,T细胞的比例下降,但绝对数增加。脾脏中T细胞比例增加,但外周血中T细胞比例降低(图2C和图2D)。以上结果说明,米拉贝隆治疗导致白血病小鼠骨髓成熟免疫细胞的绝对数显著增加。

2.3 米拉贝隆对生理和白血病状态下小鼠骨髓造血干/祖细胞的影响

为了研究米拉贝隆治疗对小鼠骨髓造血干/祖细胞的影响,我们通过流式细胞术分析其数量及比例。研究结果显示:米拉贝隆治疗对正常C57小鼠骨髓造血干/祖细胞无显著影响(图3A)。而在白血病模型中,米拉贝隆治疗组小鼠骨髓中LT-HSC(long time-HSC:Flk2–CD34–LSK)细胞、ST-HSC(short time-HSC:Flk2–CD34+LSK)细胞、MPP(multi-potent progenitor:Flk2+CD34+LSK)细胞、CMP(the common myeloid progenitor:CD34+CD16/32–LK)细胞、GMP(granulocyte/macrophage progenitors:CD34+CD16/32+LK)细胞、MEP(megakaryocyte/erythrocyte progenitors:CD34–CD16/32–LK)细胞和CLP(the common lymphoid progenitor:Flk2+CD127+)细胞的比例和数量均显著增加(图3B)。为了阐明米拉贝隆治疗促进白血病小鼠骨髓造血干/祖细胞数量和比例增加的原因,我们通过流式细胞术分析了骨髓造血干/祖细胞周期和细胞凋亡情况。在骨髓中,米拉贝隆治疗组的LSK在G1/G0期和G2/M期中分布无显著性差异,仅在S期中差异有统计学意义。米拉贝隆治疗组和对照组的LK在G1/G0期、S期和G2/M期均无显著性差异(图3C)。而流式细胞术分析结果表明,米拉贝隆治疗组小鼠骨髓造血祖细胞晚期凋亡比例显著减少(图3D)。集落形成细胞(colony-forming cell,CFC)结果显示米拉贝隆治疗组LSK培养形成的细胞形成集落的数量和大小都显著高于对照组(图3E)。以上结果说明米拉贝隆治疗促进白血病小鼠骨髓造血干细胞的增殖,抑制造血祖细胞的凋亡,导致白血病小鼠骨髓造血干/祖细胞的比例及数量显著增加,并增强LSK细胞的集落形成能力。

图1 米拉贝隆抑制白血病的发生发展并延长小鼠生存期

图2 米拉贝隆对生理和白血病状态下成熟免疫细胞的影响

图3 米拉贝隆对生理和白血病状态下小鼠骨髓造血干/祖细胞的影响

2.4 米拉贝隆通过改变全身代谢抑制白血病

我们已经证明米拉贝隆可以抑制白血病的发生发展,但其作用的分子机制仍不清楚,因此我们在米拉贝隆治疗的第14天取白血病小鼠的肩胛间棕色脂肪组织(intrascapular BAT,iBAT)、腹股沟白色脂肪组织(inguinal WAT,iWAT)和附睾白色脂肪组织(epididymal WAT,eWAT)进行分析。H&E染色和免疫荧光染色结果显示米拉贝隆治疗组中i BAT呈现高度致密的结构,表现为较小的多房结构,为i BAT激活的典型形态学表型(图4A)。与表型变化一致,UCP1在米拉贝隆治疗组中的表达水平相应地增加。在米拉贝隆治疗条件下,iBAT中细胞色素c氧化酶亚基4(cytochrome c oxidase subunit 4,COX4)阳性的线粒体含量也显著增加(图4A),和正常C57小鼠中观察到的结果一致。为了进一步明确产热脂肪组织在白血病小鼠中的激活情况,提取各产热脂肪组织的总RNA和总蛋白,通过RT-PCR分析各产热脂肪组织中棕色化基因的表达水平以及Western blot分析UCP1蛋白水平的表达。结果显示,米拉贝隆治疗组中各产热脂肪组织的棕色化基因如Ucp1、Cidea、Pgc1-α、Prdm16等表达水平均显著升高(图4B),UCP1蛋白的含量也显著升高(图4C)。以上结果表明,米拉贝隆在生理病理条件下均能显著激活产热脂肪组织。

图4 米拉贝隆通过改变全身代谢抑制白血病

为了进一步明确米拉贝隆抑制白血病发生发展的分子作用机制,我们在MLL-AF9-GFP+细胞植入前1周对野生型C57小鼠进行了棕色脂肪组织去除术。我们发现,同样是白血病造模第14天,去BAT后,米拉贝隆对骨髓、外周血和髓外部位的白血病的抑制几乎被完全解除(图4D),与该结果一致的是,米拉贝隆治疗不影响移除BAT后的白血病小鼠的生存期。同时,米拉贝隆治疗组中BAT的糖代谢相关基因表达水平上升,而白血病小鼠骨髓中造血干/祖细胞的糖代谢相关基因表达水平下降(图4E)。

3、讨论

在生理状态下,骨髓中大多数的造血干/祖细胞处于静息期,只有少数通过增殖和分化生成各种类型的成熟血细胞,以维持和形成各类血细胞占比相对稳定的造血平衡[11,12]。骨髓中的造血细胞,如粒细胞、单核细胞、T细胞和B细胞等,是机体免疫系统的重要组成部分[13]。白血病作为一种血液系统的恶性肿瘤,其发病机制复杂,现有的治疗方案效果有限,因此对白血病治疗的创新性研究成为当下的迫切需求。而代谢治疗为其提供了新的方向。最近的研究提出了通过冷暴露激活棕色脂肪组织以改变全身代谢的创新性观点[14]。越来越多的证据表明,葡萄糖代谢在这一过程中发挥着关键的作用,有助于棕色脂肪组织产生热量[15,16]。与此同时,Glut1、Glut4以及己糖激酶等因子的缺失则被发现显著影响代谢过程[17]。已有研究证明可以通过激活产热脂肪组织改善全身糖代谢,从而抑制实体肿瘤的发生和发展[7]。米拉贝隆是一种已批准用于临床治疗膀胱过度活动综合征的药物,具有无明显毒性和副作用小的特点,以更为温和的方式改善全身糖代谢[18,19]。这为探索白血病治疗的新途径提供了有希望的方向。

在本研究中,我们探讨了米拉贝隆对C57小鼠生理及病理状态下造血系统的影响。β3-肾上腺素受体激动剂米拉贝隆模拟冷诱导的交感神经激活,导致小鼠脂肪细胞体积减小,呈现出致密的多房结构。UCP1和COX4的表达上调,产热基因和棕色化相关转录因子的表达水平增加,表明长达三周的米拉贝隆治疗在生理和病理情况下均能显著激活棕色脂肪组织,并促进白色脂肪组织的棕色化。我们的数据显示,米拉贝隆通过激活脂肪组织改善全身糖代谢,对生理状态下的造血系统无明显影响。然而,在白血病所致的病理环境下,米拉贝隆预给药可降低骨髓、脾脏、肝脏和外周血中白血病细胞的比例,抑制白血病细胞的髓外浸润,改善肝脾肿大,显著延长白血病小鼠的生存期。去除棕色脂肪组织后,米拉贝隆的治疗效果消失,说明其通过激活棕色脂肪组织抑制白血病的发生和发展。

众所周知白血病会抑制骨髓的正常造血,但造血干/祖细胞仍具有正常的分化潜能[20,21]。我们在研究中发现米拉贝隆治疗后白血病细胞的增殖受到抑制,促进了正常造血干/祖细胞的增殖和分化,并且还减少了正常造血祖细胞的凋亡。这表明在病理条件下,米拉贝隆可以促进正常造血干/祖细胞的增殖分化和存活,显著延缓了急性髓性白血病的发生和发展,有效延长了小鼠的生存期,为白血病的治疗争取了更多的时间窗口。

在研究中,为确保米拉贝隆充分激活棕色脂肪组织,我们采用了预给药的形式。研究明确了米拉贝隆可以有效抑制白血病的发生和发展。然而,在面对已发病的白血病患者时,米拉贝隆的治疗作用仍需进一步研究。针对中晚期白血病患者,在强有力的诱导治疗后的维持治疗期间,联合使用米拉贝隆可能会取得更好的治疗效果。我们将在未来的研究中继续深入探讨米拉贝隆联合传统化疗对白血病的治疗效果,以及其在更多血液系统疾病中的潜在应用前景。

综上所述,我们的研究结果表明,米拉贝隆可以在生理和病理情况下激活棕色脂肪组织,抑制白血病细胞的增殖,促进白血病小鼠的正常造血干/祖细胞的增殖分化和存活,延长小鼠生存期。该研究为今后有效治疗急性髓性白血病和其他类型的血液系统疾病提供了一个新的治疗概念。

基金资助:中国医学科学院医学科学创新基金(批准号:2021-12M-1-017); 国家自然科学基金(批准号:81970107)资助的课题~~;

文章来源:成天然,邵雅,刘欢,等.棕色脂肪激活对机体正常和异常造血的影响[J].中国细胞生物学学报,2024,46(06):1081-1089.