恶性肿瘤作为全球公共卫生难题之一，严重危害了人类的身体健康。卵巢癌(Ovarian cancer, OC)是死亡率最高的妇科恶性肿瘤，美国癌症协会在2022年的报告显示，新增的1900例OC患者中有1200例死亡病例[1]。在OC的临床治疗中，铂类化疗(如卡铂、顺铂)是公认的一线治疗方案，而长期铂类化疗带来的骨髓抑制和胃肠道等不良反应受到了广泛关注，急需研发新靶标与新机制的治疗药物。

聚腺苷酸二磷酸核糖聚合酶(Poly-ADP-ribose polymerase, PARP)是结构和功能多样化的酶，参与DNA修复、细胞分化、基因转录和信号转导途径等多种关键生物和病理过程的调节[2]。PARP家族所有的17个成员中，PARP1、PARP2和PARP 3在基因组稳定性和DNA修复中发挥关键作用，而PARP1在DNA损伤修复中发挥了90%～95%的功能[3],已成为癌症治疗中一个有研究价值的靶点。PARP1包含多个结构域：N端锌指基序、由BRCA1 C-端基序组成的中央自动修饰域(BRCT)、富含色氨酸-甘氨酸-精氨酸结构域(WGB)和C端催化结构域(CAT)[4],其中N端锌指基序对DNA的修复具有重要意义，主要参与识别特定的DNA损伤[5]。双链断裂(Double-strand breaks, DBSs)的精确修复对细胞的存活至关重要[6],DSBs修复至少有3种机制：包括同源重组(Homologous combination, HR)修复、非同源末端连接(Non-homologous end joining, NHEJ)和微同源介导末端连接(Micro-homology Mediated end joining, MMEJ)[7]。当PARP1的功能受到抑制时，在HR缺陷的细胞中，DSBs通过易错修复的非同源末端连接(NHEJ)方式进行[8],使染色体不稳定，最终导致细胞死亡。抑制PARP1对同源重组缺陷及BRCA突变的卵巢癌患者具有良好的抗肿瘤作用，改善卵巢癌的治疗现状。

图式1 部分PARP抑制剂的化学结构   

“合成致死”是肿瘤靶向治疗领域的热点之一，奥拉帕尼是第一个基于此概念获得临床成功的药物[9]。PARP抑制剂利用细胞的HR缺陷来阻断DNA损伤修复，促使癌细胞凋亡[10]。奥拉帕尼(Olaparib)于2014年被批准上市，是第一个在临床试验中得到验证的PARP抑制剂，已在多种恶性肿瘤治疗中被证明了其疗效和安全性[11,12]。尼拉帕尼(Niraparib)于2017年12月获批上市，用于复发性输卵管癌、上皮卵巢癌或原发性腹膜癌女性患者的维持治疗[13]。随后，他拉唑帕尼(Talazoparib)于2018年10月批准用于治疗BRCA突变、转移性乳腺癌[14]。到目前为止，奥拉帕尼、尼拉帕尼、他拉唑帕尼和鲁卡帕尼已成功应用于卵巢癌、乳腺癌、胰腺癌和前列腺癌的治疗[15,16]。PARP抑制剂在临床使用中出现血液学、胃肠道毒性、肺炎以及继发性血液恶性肿瘤等不良反应[17]。研究表明，这些不良反应可能与抑制PARP2的活性有关[18]。AZD5305是新一代PARP1特异性抑制剂，AZD5305,表现出较好的PARP1选择性[19]。临床前毒理学研究表明，AZD5305主要对BRCA缺陷细胞起作用，而对各项血液学参数均没有影响。AZD9574是另一款具有脑渗透的高选择性PARP1抑制剂，可以明显改善血脑屏障外排泵对PARP抑制剂临床应用的限制[20]。迄今，尚无选择性PARP1抑制剂上市，且报道的结构类型也较为有限。仍需开发结构类型新、亚型选择性好的PARP抑制剂，满足临床需求。

基于结构的虚拟筛选是从结构丰富多样的化学库中寻找结构新颖和潜在活性的先导化合物的计算机技术，具有更快的计算速度和更低的实验成本[21,22],该技术在新药研发中受到广泛的关注。本研究在前期工作[23]的基础上，通过虚拟筛选和活性验证得到苗头化合物Y041-8647,并通过分子动力学考察了其与结合口袋周围的残基的相互作用模式，为进一步的结构修饰提供理论参考。

1、材料与方法

1.1 虚拟筛选

人源PARP1与Niraparib复合物的X射线晶体结构(PDB ID:7KK5;分辨率：1.70Å)来自Protrin Data Bank(PDB)数据库。使用Schrödinger分子模拟软件包(version 9.0)的Protein Preparation wizard模块对蛋白进行预处理：修正键级，基于OPLS-2005力场添加氢原子，删除所有结晶水分子，在pH 7.0下分配电荷和质子化状态，并使用OPLS-2005力场最小化结构[24]。

蛋白质格点文件生成：以7KK5蛋白结构中的结晶分子(Niraparib)为网格中心，网格框定义为24Å×24Å×24Å,使用Receptor Grid Generation生成格点文件用于对接，其他参数保持默认值。

配体库准备：ChemDiv数据库中约150万个分子被用作筛选来源。在Schrödinger的工作中，所有化合物都被导入到Ligprep模块中来制备配体。配体制备过程如下：在pH 7.0±2.0条件下，分子在EPIK 3.1下产生电离态[25],生成立体异构体，每个配体生成一个低能构象。

1.2 生物活性评价

PARP1和PARP2酶测定是用全长进行的使用化学发光测定试剂盒(BPS Bioscience)测定蛋白质，实验步骤如下：首先向384孔板中添加25μL组蛋白溶液并在4℃下孵育过夜，使用PBST缓冲液和封闭缓冲液各清洗孔板三次。其次将2000×化合物转移至含有20μL测定缓冲液的96孔中间板，以1000r/min离心1min。然后将10μL PARP1和DNA的混合物在室温下孵育10min后添加到测定板中，每孔中加入10μL NAD+,室温下孵育60min。在测定板中依次添加20μL抗Poly/Mono-ADP Ribose Rabbit mAb、抗兔IgG、HRP连接抗体和25μL Femto-ECL底物A和Femto-ECL底物B(1∶ 1)混合物，最后在Envision上读取化学发光。获得的数据使用GraphPad Prism 7.0软件分析处理得到IC50值。

1.3 代谢稳定性实验

HPLC检测条件：高效液相色谱仪(型号Waters e2695,美国沃特世公司),色谱柱：Waters-C18柱(250mm×4.6mm, 5μm),柱温40℃;流动相：0.1%甲酸水溶液(A)-甲醇(B),梯度洗脱。

标准溶液的配制：按中国药典(2020版)[26]精密称取Y041-8647适量，以甲醇溶解并定容至5mL量瓶中，制成质量浓度为1mg/mL的对照品贮备液，于4℃贮存。

1.3.1 体外人工胃肠液稳定性

按中国药典(2020版)[26]精确配置人工胃肠液和空白胃肠液，将Y041-8647(1mg/mL)分别与空白胃液、人工胃液、空白肠液、人工肠液混合均匀，于37℃水浴中共同孵育0、0.5、1、2、4、8h, 其中Y041-8647的最终浓度为10μg/mL(有机含量为1%)。用400μL冰甲醇终止反应[27]。平行3次试验，涡旋混匀10min, 于4℃下以13000r/min离心10min, 取上清液检测，记录峰面积。

1.3.2 体外血浆稳定性

取198μL大鼠空白血浆，加入2μL质量浓度为10μg/mL的Y041-8647对照品溶液(有机含量为1%),振荡混匀，在37℃水浴中孵育0、0.5、1、2、3 h, 加入400μL冰甲醇终止反应，涡混5min, 4℃下13000 r/min离心10min, 吸取上层清液到新的EP管中在37℃下N2吹干，以200μL甲醇复溶，4℃下13000r/min离心10min后取上清液进行检测，记录峰面积。

1.3.3 体外肝微粒体代谢稳定性

将Y041-8647(10μg/mL)与0.5mg/mL大鼠肝微粒体进行孵育。孵育体系总体积为200μL,包含148μL磷酸盐缓冲液(0.1mol/L,pH 7.4)和30μL NADPH启动液(A、B液按体积比5∶ 1混合),A液由NADP-Na2 (200mg)、G-6-P-Na2(200mg)、MgCl2(133mg)、水(10mL)组成，B液由柠檬酸钠(44mg)、G-6-P-DH(1000U)、水(25mL)组成。在冰浴下加入Y041-8647后置于37℃水浴中预孵育5min(有机含量为1%),加入NADPH辅酶溶液(1mmol/L)启动反应[28]。分别在0、5、15、30、45、60 min时加入400μL冰甲醇终止反应，每个时间点平行3份。将上述混合物涡旋混匀5min后，于4℃下13000r/min离心10min, 收集上清液，在37℃、N2下吹干，残渣用200μL甲醇复溶，13000r/min离心10min, 取上清液检测，记录峰面积。

1.4 分子动力学模拟

对Niraparib和Y041-8647分别与7KK5形成的复合物进行了100ns的分子动力学(MD)模拟。Amber 16软件用于溶剂化，分子动力学模拟和轨迹分析。Niraparib与7KK5复合物的结构是从蛋白质数据库中获得的。用于MD模拟的Y041-8647与7KK5复合物的初始结构是通过高精度(XP)对接获得的。化合物使用高斯16软件包进行优化并使用Amber 16软件中的antechamber模块拟合resp电荷，赋予蛋白质FF14SB力场参数，构建一个12Å×12Å×12Å的溶剂立方体盒子，使用TIP3P水模型填充整个立方盒。同时，在体系中加入6个Na+使体系呈中性。模拟期间采用SHAKE方法约束与氢原子相连化学键的伸缩，模拟积分步长设置为2fs, 用PME(Particle Mesh Ewald)方法计算长程静电相互作用，应用周期边界条件(PBC)消除溶剂盒子的边缘效应，对复合物在温度300K和1.0压强下进行100ns的MD模拟。相关详细步骤，请参阅我们之前发表的文章中分子动力学模拟部分[29]。

1.5 结合自由能和残基自由能分解计算

通过MMGBSA方法计算Niraparib和Y041-8647分别与7KK5形成的复合物的结合自由能。使用Amber 16中的MMGBSA.py脚本对动力学模拟最后10ns轨迹中提取的100个构象进行结合自由能和残基能量分解计算。相应的计算公式和原理，请参考文献[29]中结合自由能计算部分。这里主要讨论焓驱动的分子结合，相关文献提出结合热力学已经被广泛接受可以用作在药物发现和开发过程中的决策标准，特别是结合焓在选择和优化化合物时可作为候选药物的评价指标，所以在这里我们忽略熵的贡献。

2、结果与讨论

2.1 基于结构的虚拟筛选

基于结构的虚拟筛选工作流程如图所示。将ChemDiv数据库中约150万个小分子化合物，通过预处理后使用Schrödinger软件中Virtual Screening Workflow模块的高通量虚拟筛选(HTVS)、标准精度(SP)和高精度(XP)进行逐级筛选。首先，根据对接得分，对HTVS打分前10%的化合物，将其进行SP模式对接，对SP模式下打分前10%的化合物进行XP对接[21],最终选择购买9个化合物并进行生物活性测定。发现其中两个化合物对PARP有抑制活性，分别是Y041-8647和0173-0018。

图1 虚拟筛选流程图   

2.2 酶活性测定结果

按“1.2”项的方法测定9个化合物对PARP1和PARP2的酶抑制活性，实验结果如表1所示，化合物Y041-8647和0173-0018对PARP1和PARP2均具有较强的抑制活性，Y041-8647和0173-0018对PARP1的IC50值分别为1.4和6.7 μmol/L,对PARP2的IC50值分别为32.6和78.7 μmol/L。而且，Y041-8647对PARP1表现出一定的选择性抑制。其中Y041-8647的活性优于0173-0018,可将其作为结构改造与优化的先导化合物。其他化合物没有明显表现出对PARP1和PARP2的酶抑制活性。使用Schrödinger软件中QikProp模块预测这两个化合物的相关结构参数，结果如表2所示，表明Y041-8647和0173-0018可能显示出良好的类药性质。

图式2 基于结构虚拟筛选所得的化合物的化学结构式  

表1 化合物对PARP的抑制作用和化合物的XP对接分数

表2 化合物的理化性质

2.3 代谢稳定性

2.3.1 人工胃肠道稳定性

按“1.3.1”项的方法对样品进行处理，以孵育0h的质量浓度为对照，计算各孵育时间点的药物剩余百分比。结果如表3所示，在孵育8h后，Y041-8647在空白胃肠液和人工胃肠液中的剩余量均大于85%,表明Y041-8647在这四种溶液中稳定性良好，不易发生降解。

2.3.2 血浆稳定性

按“1.3.2”项的方法对样品进行处理，以孵育0h的质量浓度为对照，计算各孵育时间点的药物剩余百分比。结果如表4所示，在孵育3h后，Y041-8647在大鼠血浆中的剩余率为82.15%,表明Y041-8647在大鼠血浆中稳定性良好。

表3 Y041-8647在人工胃肠液中的稳定性(n=3)

表4 Y041-8647在大鼠血浆中孵育后的剩余百分率(n=3)

2.3.3 大鼠肝微粒体稳定性

按1.3.3节的方法对样品进行处理，以孵育0h的质量浓度为对照，计算各孵育时间点的药物剩余百分比。结果如表5所示，在孵育60min后，Y041-8647在I相代谢孵育体系中，大鼠肝微粒体剩余百分率为78.03%,半衰期大于90min, 且清除率为0.0084mL/(min·mg),表明Y041-8647在大鼠肝微粒体中代谢稳定性良好。

表5 Y041-8647在大鼠肝微粒体中的代谢稳定性(n=3)

2.4 分子动力学模拟

2.4.1 对接方法验证结果

将共晶分子的对接构象与原始共晶配体进行叠合，计算其均方根差(RMSD)值，结果如图2所示，RMSD为0.135Å,表明共晶分子与原始晶体结构几乎重合，表明对接方法具有可靠性。

图2 共晶分子对接构象与原始配体叠合图(RMSD=0.135Å, PDB ID:7KK5)(粉色代表原始配体，蓝色代表构象)

2.4.2 分子对接结合模式预测

为阐明PARP抑制剂的结合模式，对Schrödinger软件中Glide XP生成的对接构象结合PyMOL软件进行分析。如图3(A,B)所示，PARP1(PDB ID: 7KK5)与Niraparib复合物结合的晶体结构表明：抑制剂Niraparib与残基GLY 863和ASP 766形成氢键作用；此外，与多个残基如TYR 907、TYR 896、PHE 897、ALA 898、MET 890、VAL 762、TYR 996、TYR 889和TRP 861有疏水作用。如图3(C,D)所示，化合物Y041-8647与7KK5的对接结合方式表明，其与残基GLY 863和残基ASP 766形成氢键，这与抑制剂Niraparib-7KK5结合模式产生相同的氢键作用。此外，多个残基如TYR 889、TRP 861、PHE 907、ALA 898、TYR 896对化合物Y041-8647与7KK5的结合提供了疏水作用。

图3 (A)Niraparib与蛋白PARP1的2D结合模式(PDB ID: 7KK5);(B)Niraparib与蛋白PARP1的3D结合模式； (C)化合物Y041-8647与蛋白PARP1的2D结合模式；(D)化合物Y041-8647与蛋白PARP1的3D结合模式。红色虚线为氢键

2.4.3 RMSD分析动力学模拟轨迹稳定性

RMSD描述了复合物的初始构象在模拟过程中的变化幅度，用于观察模拟过程中的收敛性和复合物的稳定性。7KK5分别与Niraparib和Y041-8647进行了100ns的分子动力学模拟。RMSD结果如图4所示，在分子动力学模拟过程中，抑制剂Niraparib和Y041-8647与7KK5复合物RMSD值的波动范围小于2Å,表明在分子动力学模拟期间实现了总体平衡。

图4 分子动力学模拟的RMSD图

2.4.4 氢键分析

使用Amber 16中的CPPTRAJ程序分析了Niraparib和Y041-8647与7KK5的氢键相互作用，表6中列出了相应的数据，在Niraparib-7KK5的体系中，Niraparib与GLY 863(占90.05%)形成稳定的氢键，与残基SER 904(占60.83%)之间形成稳定的氢键，此外还与残基GLN 759(占33.78%)、THR 887(占45.81%)和GLN 863(占13.10%)形成三个氢键。在Y041-8647-7KK5体系中，化合物Y041-8647与残基SER 904(占49.58%)和GLY 863(占68.01%)形成氢键，说明残基GLY 863和SER 904是Y041-8647-7KK5体系中的关键残基。与化合物Y041-8647相比，抑制剂Niraparib与7KK5具有相同的氢键作用，但是明显强于Y041-8647与7KK5之间的相互作用。上述数据可以从氢键作用的角度解释Niraparib对PARP1酶的抑制活性优于化合物Y041-8647。

2.5 结合自由能计算

通过MMGBSA方法计算Niraparib和Y041-8647分别与7KK5形成的复合物的结合自由能，从能量上探讨Niraparib和Y041-8647的结合差异。分别对Niraparib和Y041-8647进行结合自由能计算，结果如表7所示，Niraparib的ΔGbind(-64.24 kcal/mol)优于化合物Y041-8647的ΔGbind(-52.01kcal/mol)。在静电贡献中，Niraparib-7KK5的ΔEele(-35.41kcal/mol)优于Y041-8647-7KK5的ΔEele (-27.09kcal/mol),静电力主要是由氢键所提供，结果表明，Niraparib-7KK5的氢键效应优于Y041-8647-7KK5,与2.4.4节中对氢键的分析结果一致。

表6 蛋白PARP1(7KK5)与两种抑制剂(Niraparib和Y041-8647)之间氢键相互作用的分析

表7 Niraparib和Y041-8647分别与蛋白PARP1(7KK5)复合物的结合自由能贡献(单位kcal/mol)

2.6 残基自由能分解计算

将PARP1抑制剂Niraparib复合物的结合自由能分解到每一个残基，以评估残基的相互作用在抑制剂与7KK5结合模式中的详细贡献。Niraparib和Y041-8647对7KK5蛋白能量贡献低于-0.5kcal/mol的残基如图5所示，能量低于-1.0kcal/mol的残基被视为关键残基；在Niraparib-7KK5复合物中共鉴定出10个关键残基：GLY 863、SER 904、ASP 766、THR 887、TYR 907、VAL 762、TYR 889、GLN 759、TRP 861和TYR 896。关键残基GLY 863、SER 904、THR 887、TYR 907是Niraparib和Y041-8647与7KK5结合的主要残基。为了探索残基的极性贡献(静电和极性溶剂化的总和，如图6(A)所示)和非极性贡献的总和(范德华力和非极性溶剂化的总和，如图6(B)所示),图中非极性贡献的减少导致Y041-8647-7KK5复合物中GLY 863的能量贡献的减少，TYR 907、VAL 762、和GLN 759的能量贡献降低的原因是其极性贡献不利于Y041-8647-7KK5复合物的结合。总之，Niraparib与残基之间的能量贡献主要是由非极性相互作用所提供的。

图5 Niraparib和Y041-8647与PARP1(PDB ID:7KK5)结合 关键残基的总能量贡献比较

图6 (A)Niraparib和Y041-8647与蛋白PARP1(PDB ID: 7KK5)结合关键残基的极性能量贡献；(B)Niraparib和Y041-8647 与蛋白PARP1结合关键残基的非极性能量贡献。

2.7 讨论

通过基于Glide对接的XP虚拟筛选、生物活性的测定及体外稳定性研究，化合物Y041-8647对PARP具有较好的酶抑制活性，且Y041-8647在人工胃肠液、血浆及体外肝微粒体中表现出良好的稳定性。进一步对Niraparib和化合物Y041-8647与7KK5的复合物进行分子对接、氢键分析、分子动力学模拟和残基自由能分解计算，结果表明，残基GLY 863和SER 904是Niraparib和Y041-8647与7KK5结合中所必需的残基，是PARP1活性产生的关键残基；非极性相互作用是抑制剂与7KK5结合的主要作用力。通过分子对接和氢键相互作用分析发现Niraparib和化合物Y041-8647与7KK5结合方式的差异在于：虽然两者均产生了相同的关键氢键作用力，但是Niraparib-7KK5中与残基SER 904(占90.05%)形成的氢键明显强于Y041-864-7KK5与残基SER 904(占68.01%)形成的氢键。因此，可尝试通过优化化合物Y041-864的结构，增强与残基SER 904,GLY 863,THR 887的氢键相互作用，添加与残基GLN 759的氢键相互作用，或增加与关键残基的非极性相互作用，以提高抑制活性。

3、结论

本研究基于结构虚拟筛选，并结合生物活性实验，从ChemDiv数据库中发现了两个对PARP有一定抑制活性的苗头化合物。酶活性抑制实验结果表明化合物Y041-8647对PARP1有较强的抑制活性(IC50=1.4μmol/L)。采用HPLC对化合物Y041-8647进行了体外代谢稳定性考察，Y041-8647在人工胃液肠液百分剩余比都大于85%,血浆中剩余率为82.15%,I相代谢大鼠肝微粒体中剩余百分比为78.03%,t1/2为165.00min。结果表明Y041-8647在以上环境中具有良好的稳定性。分子动力学模拟和结合自由能计算表明，非极性相互作用是抑制剂与7KK5结合的主要作用力。通过增加Y041-864-7KK5与残基GLN 759之间的氢键相互作用，增强关键的氢键和非极性相互作用有利于进一步的结构优化。综上所述，本文所筛选的化合物Y041-8647可作为具有改造潜力的先导化合物，对其进一步进行结构优化，从中筛选出结构新颖、酶抑制活性高的新型PARP抑制剂。

参考文献:

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[28]杜瑶,陈瑞,朱高峰,等.中国药房,2021,32(17):2059~2065.

基金资助:国家自然科学基金项目(22267003); 贵州省自然科学基金项目(黔科合基础-ZK[2023]一般305,黔科合基础-ZK[2024]一般170); 贵州省卫健委科技基金项目(gzwkj2023-511)资助;

文章来源:周其鈺,张娜娜,卢江溶,等.PARP抑制剂的虚拟筛选､酶抑制活性及代谢稳定性研究[J].化学通报,2024,87(07):864-871+844.